Name: protocol for recombinant rbd-based sars vaccines: protein preparation, animal vaccination and neutralization detection
Uploaded: 2011-05-02T15:00:00
Duration: 12 min 9 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Protocol for Recombinant RBD-based SARS Vaccines: Protein Preparation, Animal Vaccination and Neutralization Detection at JoVE.com

Denna studie stöddes av National Institutes of Health (NIH) i USA (RO1 AI68002).

1. Rekombinant sars-CoV RBD Protein Förberedelser <ol><li> Förbered kalcium reagens fosfat transfektion <ol><li> 2X HBS buffert preparatet: Blanda ihop 16 g NaCl, 0,4 g Na 2 HPO 4 * 7H 2 O, och 13,0 g HEPES. Justera pH till 7,00 och ta upp den totala volymen till 1000 ml i destillerat vatten. Efter filtrering lösningen för sterilisering, delprov och lagra det vid -20 ° C. Tips: Alla variationer av pH-värdet skulle påverka transfektion resultaten. Därför är det lämpligt att testa flera olika pH-värden runt 7,00 (exempelvis 6,99, 7,00 eller 7,01) och hitta den bästa för de transfektion med metoden infördes nedan. </li><li> 2,5 M CaCl 2 preparatet: Tillsätt 73,5 g CaCl 2 * 2H 2 O till destillerat vatten i en slutlig volym på 200 ml. Filtrera lösningen och förvara vid -20 ° C. </li></ol></li><li> Rekombinant plasmid transfektion och proteinrening <ol><li> Dela 293T celler med 50-70% confluency 24 timmar före transfektion. Väx celler i T-175 cm 2 kolvar vävnadskultur i 40 ml DMEM innehåller 10% värmeinaktiveras (HI) FBS och 1% Penicillin / streptomycin (P / S) vid 37 ° C i 5% CO 2. </li><li> Alla transfektion reagens bör tas upp till rumstemperatur innan transfektion. Dessa reagenser inkluderar 2X HBS, 2.5M CaCl 2, DiH 2 O och rRBD plasmid 6. Tips: Den slutliga rekombinant plasmid konstruera används för proteinuttryck bör innehålla en signal peptid för att säkerställa sekretion av uttryckt rekombinanta proteiner till kulturen supernatanten. En 6x Hans tagg kan läggas till C-terminalen det uttryckta proteinets för enkel rening. </li><li> Förbered en 50 ml (A) och en 15 ml (B) BD Falcon rör, och lägga reagens rören som anges i tabell 1. Lägg 2X HBS buffert för att tub A. I röret B, tillsätt 2,5 miljoner CaCl 2 och rRBD plasmid och föra volymen till kravet i DiH 2 O. <table border="1"><tbody><tr><td colspan="4"> A. En T-175 cm 2 vävnadsodling kolv (4000 ml / kolv): förbereda rRBD uttryck </td></tr><tr><td colspan="2"> Rör A </td><td colspan="2"> Rör B </td></tr><tr><td> 2X HBS </td><td> 2000 mikroliter </td><td> 2,5 M CaCl 2 </td><td> 200 mikroliter </td></tr><tr><td></td><td></td><td> rRBD plasmid-DNA </td><td> 40 mikrogram </td></tr><tr><td></td><td></td><td> DiH 2 O </td><td> 2000 mikroliter </td></tr><tr><td colspan="4"> B. En 100-mm petriskål (1000 ml / fat): förbereda för sars pseudovirus produktion </td></tr><tr><td colspan="2"> Rör A </td><td colspan="2"> Rör B </td></tr><tr><td> 2X HBS </td><td> 500 mikroliter </td><td> 2,5 M CaCl 2 </td><td> 50 mikroliter </td></tr><tr><td></td><td></td><td> Sars-CoV S plasmid-DNA </td><td> 5 mikrogram </td></tr><tr><td></td><td></td><td> HIV-1 plasmid (pNL4-3.luc.RE) </td><td> 5 mikrogram </td></tr><tr><td></td><td></td><td> DiH 2 O </td><td> 500 mikroliter </td></tr></tbody></table> Tabell 1. Transfektion blandning förberedelse och volymer De volymer som anges i tabell 1 för en transfektion enhet. Om fler flaskor eller maträtter används för transfektion, justera volymen därefter. </li><li> Lägg till DNA-kalcium i rör B i röret A i ett droppvis sätt, samtidigt som konstant och varsam blandning i en virvel. Låt blandningen sätta sig i rumstemperatur i 20-30 min. Nyckeln till en framgångsrik kalciumfosfat transfektion beror på storleken och formen på de bildade fällningen. Därför bör blandningen vortexed konstant och långsamt för att tillgodose detta krav och som ett resultat, förbättra transfektion effekt. </li><li> Lägg blandningen i en droppvis och till och med sätt in 293T celler (4000 ml / flaska). Kultur celler i inkubator vid 37 ° C i 5% CO 2. </li><li> Byt odlingsmedium med färska serumfritt OPTI-MEM Jag reducerade-Serum Medium (50 ml / flaska) 80-10 timmar efter transfektion. Fortsätt att kulturen celler för två dagar i samma skick. </li><li> Samla supernatanten som innehåller uttryck rRBD protein 72 timmar efter transfektion. Centrifugera vid 6000 rpm i 15 min för att avlägsna celler skräp. Lägg cocktail proteashämmare för att den insamlade supernatanten och förvara vid 4 ° C över natten. </li><li> Nästa dag, rena rRBD rekombinant protein från supernatant med Ni-NTA Superflow efter tillverkarens anvisningar. </li><li> Koncentrera renat protein med Amicon Ultra -15 koncentration rör. Efter proteinkoncentration,Lägg PBS koncentrationen rören och centrifugera igen för att ta bort imidazol i eluering buffert. Beräkna protein koncentration och lagra renat protein vid -80 ° C fram till användning. </li></ol></li></ol> 2. Mus vaccination och Provtagning <ol><li> Pre-varm Sigma adjuvant system (SAS) till 40-45 ° C enligt tillverkarens anvisningar. Tillsätt 1 mL PBS per flaska och blanda väl. </li><li> Förbered protein-adjuvans emulsion enligt protokollet i tabell 2. Pipettera beräknas rRBD protein i ett 1,5 ml rör. Tillsätt lika stor mängd SAS adjuvans till röret och vortexa kraftigt i 2-3 minuter för att bilda emulsion. Tips: De volymer som anges i tabell 2 för en mus. Justera volym enligt den faktiska musen använda nummer. För varje grupp, blanda ihop de proteiner och adjuvans krävs för varje vaccin. Alltid förbereda ett extra prov för vaccinering för att säkerställa noggrannheten. <table border="1"><tbody><tr><td> Grupp </td><td> 1 st vaccin (200 mikroliter / mus) </td><td> 2: a vaccin (200 mikroliter / mus) </td><td> 3: e vaccin (200 mikroliter / mus) </td></tr><tr><td> rRBD protein </td><td> 20 mikrogram protein i PBS (100 mikroliter) + 100 mikroliter SAS </td><td> 10 mikrogram protein i PBS (100 mikroliter) + 100 mikroliter SAS </td><td> 10 mikrogram protein i PBS (100 mikroliter) + 100 mikroliter SAS </td></tr><tr><td> PBS-kontroll </td><td> 100 mikroliter PBS + 100 mikroliter SAS </td><td> 100 mikroliter PBS + 100 mikroliter SAS </td><td> 100 mikroliter PBS + 100 mikroliter SAS </td></tr></tbody></table> Tabell 2. Mouse immunisering protokoll </li><li> Subkutant prime-vaccinera kvinnliga BALB / c möss (4-6 veckor gammal, 5 möss / grupp), och öka två gånger med rRBD och SAS anges i tabell 2. Använd PBS grupp som kontroll. Webbplatsen för subkutan injektion oftast valt är den lösa huden mellan skulderbladen. Alternativt är den ventrala buken används ofta, eftersom det är lättare att injicera, och kan iaktta eventuella läckage från injektionsstället. När upprepade doser av vaccin som används, är det lätt att välja olika injektionsställen, förebygga potentiella lokala hudreaktioner. </li><li> Utfallande möss via retro-orbital med bedövning före immunisering och 10 dagar efter varje vaccination och värme serum vid 56 ° C i 30 min för att inaktivera komplement. Förvara mus serum vid -20 ° C fram till användning. </li></ol> 3. Neutralisering Detektering med hjälp av analys Pseudovirus neutralisering <ol><li> Förbered sars pseudovirus <ol><li> Dela 293T celler i 100 kultur mm vävnad petriskålar (2x10 6 celler / fat) 16 h före transfektion, och växa celler som ovan. </li><li> Förbered transfektion reagens som anges i tabell 1. Co-transfektera en plasmid kodning sars-CoV S protein och en plasmid kodning env-defekt, luciferas-uttrycker HIV-1-genomet (pNL4-3.luc.RE) med kalcium reagens fosfat transfektion. </li><li> Byt medium med 10 mL färsk DMEM innehåller 10% FBS och 1% P / S 8-10 timmar efter transfektion. Samla supernatanten innehållande sars pseudovirus 72 timmar efter transfektion. </li><li> Filtrera pseudovirus genom ett 0,45 ìm filter. Alikvotera och förvara vid -80 ° C fram till användning. </li></ol></li><li> SARS pseudovirus neutralisering analys <ol><li> Dela 293T celler som uttrycker sars-CoV receptorn ACE2 (ACE2/293T) vid 10 4 cells/100 mikroliter / brunn i 96-brunnar vävnadsodling 16 timmar före infektion. </li><li> Späd SARS pseudovirus med 2-faldigt att upptäcka viruset titer i ACE2/293T celler. </li><li> Seriellt späda mus serum i 96-hålsplattor vävnadsodling och lägga lika volym titrerad sars pseudovirus. Preincubate plattorna vid 37 ° C under 1 h. </li><li> Efter inkubation, tillsätt 100 ìl av serum-pseudovirus blandningen ACE2/293T celler, och fortsätter att växa celler vid 37 ° C i 5% CO 2. Lägg färska DMEM 24 timmar senare. </li><li> Helt ta bort kulturen supernatanterna från plattorna 72 timmar efter infektion. Lägg 1X luciferas cell reagens kultur lys (60 mikroliter / brunn), och främja cellslys med konstant skakning av plattor för 1-2 timmar i rumstemperatur. </li><li> Överföring cell lysates (50 mikroliter / brunn) i luminometer plattor (Microfluor plattor med 96 brunnar). Lägg luciferas substrat (50 mikroliter / brunn) som ingår i luciferas analyssystem, och upptäcka relativa luciferas aktivitet i Ultra 384 luminometer. </li><li> Beräkna sars titer pseudovirus neutralisering och presentera som 50% neutraliserande antikroppstiter (NT 50) 6. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Pitcovski, J., Gutter, B., Gallili, G., Goldway, M., Perelman, B., Gross, G., Krispel, S., Barbakov, M., Michael, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+large-scale+use+of+recombinant+VP2+vaccine+for+the+prevention+of+infectious+bursal+disease+of+chickens.">Development and large-scale use of recombinant VP2 vaccine for the prevention of infectious bursal disease of chickens.</a> Vaccine. 21, 4736-4743 (2003).</li><li>Tait, A., Hall, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Theileria+annulata:+control+measures,+diagnosis+and+the+potential+use+of+subunit+vaccines.">Theileria annulata: control measures, diagnosis and the potential use of subunit vaccines.</a> Rev. Sci. Tech. 9, 387-403 (1990).</li><li>Qi, Z., Zhou, L., Zhang, Q., Ren, L., Dai, R., Wu, B., Wang, T., Zhu, Z., Yang, Y., Cui, B., Wang, Z., Wang, H., Qiu, Y., Guo, Z., Yang, R., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+mouse,+guinea+pig+and+rabbit+models+for+evaluation+of+plague+subunit+vaccine+F1+rV270.">Comparison of mouse, guinea pig and rabbit models for evaluation of plague subunit vaccine F1+rV270.</a> Vaccine. 28, 1655-1660 (2010).</li><li>Rosser, M. P., Xia, W., Hartsell, S., McCaman, M., Zhu, Y., Wang, S., Harvey, S., Bringmann, P., Cobb, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+transfection+of+CHO-K1-S+using+serum-free+medium+in+suspension:+a+rapid+mammalian+protein+expression+system.">Transient transfection of CHO-K1-S using serum-free medium in suspension: a rapid mammalian protein expression system.</a> Protein Expr. Purif. 40, 237-243 (2005).</li><li>Du, L., Zhao, G., Li, L., He, Y., Zhou, Y., Zheng, B. J., Jiang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigenicity+and+immunogenicity+of+SARS-CoV+S+protein+receptor-binding+domain+stably+expressed+in+CHO+cells.">Antigenicity and immunogenicity of SARS-CoV S protein receptor-binding domain stably expressed in CHO cells.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 384, 486-490 (2009).</li><li>Du, L., Zhao, G., Chan, C. C., Sun, S., Chen, M., Liu, Z., Guo, H., He, Y., Zhou, Y., Zheng, B. J., Jiang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+receptor-binding+domain+of+SARS-CoV+spike+protein+expressed+in+mammalian,+insect+and+E.+coli+cells+elicits+potent+neutralizing+antibody+and+protective+immunity.">Recombinant receptor-binding domain of SARS-CoV spike protein expressed in mammalian, insect and E. coli cells elicits potent neutralizing antibody and protective immunity.</a> Virology. 393, 144-150 (2009).</li><li>Ambrosino, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amino+acids+270+to+510+of+the+severe+acute+respiratory+syndrome+coronavirus+spike+protein+are+required+for+interaction+with+receptor.">Amino acids 270 to 510 of the severe acute respiratory syndrome coronavirus spike protein are required for interaction with receptor.</a> J. Virol. 78, 4552-4560 (2004).</li><li>Li, W., Moore, M. J., Vasilieva, N., Sui, J., Wong, S. K., Berne, M. A., Somasundaran, M., Sullivan, J. L., Luzuriaga, K., Greenough, T. C., Choe, H., Farzan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiotensin-converting+enzyme+2+is+a+functional+receptor+for+the+SARS+coronavirus.">Angiotensin-converting enzyme 2 is a functional receptor for the SARS coronavirus.</a> Nature. 426, 450-454 (2003).</li><li>He, Y., Zhou, Y., Liu, S., Kou, Z., Li, W., Farzan, M., Jiang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor-binding+domain+of+SARS-CoV+spike+protein+induces+highly+potent+neutralizing+antibodies:+implication+for+developing+subunit+vaccine.">Receptor-binding domain of SARS-CoV spike protein induces highly potent neutralizing antibodies: implication for developing subunit vaccine.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 324, 773-781 (2004).</li><li>Batard, P., Jordan, M., Wurm, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfer+of+high+copy+number+plasmid+into+mammalian+cells+by+calcium+phosphate+transfection.">Transfer of high copy number plasmid into mammalian cells by calcium phosphate transfection.</a> Gene. 270, 61-68 (2001).</li><li>Pramfalk, C., Lanner, J., Andersson, M., Danielsson, E., Kaiser, C., Renstrom, I. M., Warolen, M., James, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin+receptor+activation+and+down-regulation+by+cationic+lipid+transfection+reagents.">Insulin receptor activation and down-regulation by cationic lipid transfection reagents.</a> BMC. Cell Biol. 5, 7-7 (2004).</li><li>Rosser, M. P., Xia, W., Hartsell, S., McCaman, M., Zhu, Y., Wang, S., Harvey, S., Bringmann, P., Cobb, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+transfection+of+CHO-K1-S+using+serum-free+medium+in+suspension:+a+rapid+mammalian+protein+expression+system.">Transient transfection of CHO-K1-S using serum-free medium in suspension: a rapid mammalian protein expression system.</a> Protein Expr. Purif. 40, 237-243 (2005).</li><li>Jiang, M., Chen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+Ca2+-phosphate+transfection+efficiency+in+low-density+neuronal+cultures.">High Ca2+-phosphate transfection efficiency in low-density neuronal cultures.</a> Nat. Protoc. 1, 695-700 (2006).</li><li>Jiang, M., Deng, L., Chen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+Ca(2+)-phosphate+transfection+efficiency+enables+single+neuron+gene+analysis.">High Ca(2+)-phosphate transfection efficiency enables single neuron gene analysis.</a> Gene Ther. 11, 1303-1311 (2004).</li><li>Han, D. P., Kim, H. G., Kim, Y. B., Poon, L. L., Cho, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+safe+neutralization+assay+for+SARS-CoV+and+characterization+of+S-glycoprotein.">Development of a safe neutralization assay for SARS-CoV and characterization of S-glycoprotein.</a> Virology. 326, 140-149 (2004).</li><li>Toledo, J. R., Prieto, Y., Oramas, N., Sanchez, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyethylenimine-based+transfection+method+as+a+simple+and+effective+way+to+produce+recombinant+lentiviral+vectors.">Polyethylenimine-based transfection method as a simple and effective way to produce recombinant lentiviral vectors.</a> Appl. Biochem. Biotechnol. 157, 538-544 (2009).</li></ol>

Celltäthet är en viktig faktor som påverkar effekten av kalciumfosfat-baserade transfektion. Enligt vår erfarenhet tar mindre än 70% confluency av cellerna de bästa resultaten. Således, i syfte att förbättra transfektion effektivitet, rekommenderas att celltäthet hållas på omkring 50-70% av confluency. Den kalciumfosfat transfektion metod är i allmänhet vara mindre effektiva jämfört med andra transfektion metoder, såsom lipid transfektion 16. Men i detta protokoll, använde vi en modifierad kalcium metod fosfat transfektion där konstant och långsam blandning av transfektion lösning i en virvel säkerställer bildandet av en fällning med lämplig storlek och form, och därmed förbättra transfektion effektivitet.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>NaCl</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>S7653</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Na2HPO4*7H2O</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>S2429</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>HEPES</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>H3375</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CaCl2*2H2O</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>C5080</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DMEM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>12430</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>HI FBS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>10438</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Penicillin/Streptomycin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15140</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>OPTI-MEM I Medium</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>31985</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Protease inhibitor cocktail</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche</td>
<td>11836170001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ni-NTA Superflow</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Qiagen</td>
<td>30450</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sigma adjuvant system</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>S6322</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Luciferase assay system</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Promega</td>
<td>E1501</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Luciferase cell culture lysis reagent (5X)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Promega</td>
<td>E1531</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Amicon Ultra - 15</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Millipore</td>
<td>UFC901024</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microfluor 96-well plates</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Scientific</td>
<td>7905</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ultra 384 luminometer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Tecan Systems</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

protocol for recombinant rbd-based sars vaccines: protein preparation, animal vaccination and neutralization detection

Baserat på deras säkerhetsprofil och förmåga att inducera potent immunsvar mot infektioner, har subenhet vaccin använts som kandidater för en mängd olika patogener 1-3. Eftersom däggdjursceller systemet klarar av post-translationell modifiering, och utgör därmed ordentligt vikta och glykosylerade proteiner har rekombinanta proteiner som uttrycks i däggdjursceller visat störst potential att hålla en hög antigenicitet och immunogenicitet 4-6. Även om inga nya fall av sars har rapporterats sedan 2004, framtida utbrott är ett ständigt hot, och därför är utvecklingen av vaccin mot sars-CoV en försiktig förebyggande åtgärd och bör genomföras. I RBD av sars-CoV S protein spelar en viktig roll i receptorbindning och induktion av specifika neutraliserande antikroppar mot virusinfektion 7-9. Därför, i detta protokoll, beskriver vi nya metoder för att utveckla en RBD-baserad subenheten vaccin mot sars. Kortfattat var det rekombinanta RBD protein (rRBD) uttryckt i supernatant av däggdjurs-293T celler för att få en korrekt vikt protein med korrekt exteriör och hög immunogenicitet 6. Den transfektion av rekombinant plasmid kodning RBD till cellerna var då utförs med hjälp av ett kalcium metod fosfat transfektion 6,10 med vissa ändringar. Jämfört med lipid transfektion metoden 11,12, detta är modifierad kalciumfosfat transfektion metoden billigare, lättare att hantera, och har potential att nå hög effekt när en transfektion komplex med lämplig storlek och form bildas 13,14. Slutligen var en sars pseudovirus neutralisering test infördes i protokollet och används för att upptäcka de neutraliserande aktivitet i serum av möss vaccinerade med rRBD protein. Denna analys är relativt säker, inte innebär en smittsam sars-CoV, och kan utföras utan krav på en biosäkerhet-3 laboratorium 15. Protokollet som beskrivs här kan också användas för att utforma och studera rekombinanta subenheten vacciner mot andra virus med klass I fusionsproteiner, till exempel HIV, RS-virus (RSV), ebolavirus influensavirus, liksom Nipah och Handra virus. Dessutom kan metoderna för att generera en pseudovirus och därefter upprättande av en analys pseudovirus neutralisering tillämpas på alla dessa virus.

Watch this Scientific Journal Video about Protocol for Recombinant RBD-based SARS Vaccines: Protein Preparation, Animal Vaccination and Neutralization Detection at JoVE.com

Protocol for Recombinant RBD-based SARS Vaccines: Protein Preparation, Animal Vaccination and Neutralization Detection

Detta protokoll beskriver ett allmänt förfarande för att studera rekombinant receptor-bindande domän (RBD)-baserade subenheten vaccin mot sars. Den innehåller metoder för transfektion och uttryck RBD protein i 293T celler, immunisering av möss med RBD och detektering av neutralisering aktiviteten av mus serum med hjälp av en etablerad sars-analys pseudovirus neutralisering.

Protokoll för rekombinant RBD-baserade SARS Vaccines: Protein Förberedelser, Animal Vaccination och neutralisering Detection

Based on their safety profile and ability to induce potent immune responses against infections, subunit vaccines have been used as candidates for a wide ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

Kombination av självhäftande tejp grundad på provtagning och fluorescens På plats Hybridisering för snabb upptäckt av Salmonella På färskvaror

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in ...

Whole-animal Imaging and Flow Cytometric Techniques for Analysis of Antigen-specific CD8+ T Cell Responses after Nanoparticle Vaccination

Hel-djur Imaging och Flödescytometrisk Tekniker för analys av antigen-specifika CD8 + T-cellssvar efter Nanoparticle Vaccination

Traditional vaccine adjuvants, such as alum, elicit suboptimal CD8+ T cell responses. To address this major challenge in vaccine development, various ...

Intranasal Administration of Recombinant Influenza Vaccines in Chimeric Mouse Models to Study Mucosal Immunity

Intranasal administration av rekombinant influensavacciner i chimär musmodeller för att studera slemhinneimmunitet

Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the ...

High-throughput Detection of Respiratory Pathogens in Animal Specimens by Nanoscale PCR

Hög genomströmning Upptäckt av luftvägspatogener i Animal Prover av nano PCR

Nanoliter scale real-time PCR uses spatial multiplexing to allow multiple assays to be run in parallel on a single plate without the typical drawbacks of ...

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

In Vivo Test för påvisande av Antigen-specifika T-cell cytolytisk funktion använder en Vaccination modell

Current methodologies for antigen-specific killing are limited to in vitro use or utilized in infectious disease models. However, there is not a protocol ...

Generating Recombinant Avian Herpesvirus Vectors with CRISPR/Cas9 Gene Editing

Generera rekombinant aviär Herpesvirus vektorer med CRISPR/Cas9 gen redigering

Herpesvirus of turkeys (HVT) is an ideal viral vector for the generation of recombinant vaccines against a number of avian diseases, such as avian ...

Analysis of Iophenoxic Acid Analogues in Small Indian Mongoose (Herpestes Auropunctatus) Sera for Use as an Oral Rabies Vaccination Biological Marker

Analysis of Iophenoxic Acid Analogues in Small Indian Mongoose Herpestes Auropunctatus Sera for Use as an Oral Rabies Vaccination Biological Marker

Analys av Iophenoxic Acid-analoger i små indiska Mongoose (Herpestes auropunctatus) sera för användning som en oral rabiesvaccination biologisk markör

The small Indian mongoose (Herpestes auropunctatus) is a reservoir of rabies virus (RABV) in Puerto Rico and comprises over 70% of animal rabies cases ...

A Rapid, Multiplex Dual Reporter IgG and IgM SARS-CoV-2 Neutralization Assay for a Multiplexed Bead-Based Flow Analysis System

En snabb, Multiplex Dual Reporter IgG och IgM SARS-CoV-2 neutraliseringsanalys för ett multiplexerat pärlbaserat flödesanalyssystem

The COVID-19 pandemic has underscored the need for rapid high-throughput methods for sensitive and specific serological detection of infection with novel ...

Detection of SARS-CoV-2 Receptor-Binding Domain Antibody using a HiBiT-Based Bioreporter

Detektion av SARS-CoV-2 receptorbindande domänantikropp med hjälp av en Hibit-baserad bioreportör

The emergence of the COVID-19 pandemic has increased the need for better serological detection methods to determine the epidemiologic impact of severe ...

Live Imaging and Quantification of Viral Infection in K18 hACE2 Transgenic Mice Using Reporter-Expressing Recombinant SARS-CoV-2

Levande avbildning och kvantifiering av virusinfektion i K18 hACE2 transgena möss med reporteruttryckande rekombinant SARS-CoV-2

The coronavirus disease 2019 (COVID-19) pandemic has been caused by severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2). To date, SARS-CoV-2 has ...