Name: dissection of human vitreous body elements for proteomic analysis
Uploaded: 2011-01-23T17:45:00
Duration: 5 min 5 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Dissection of Human Vitreous Body Elements for Proteomic Analysis at JoVE.com

Il finanziamento è stato fornito da Lotta per la vista. I tessuti sono stati ottenuti dalla Banca degli occhi Lions Iowa.

1. Segmento dissezione anteriore. <ol><li> La cornea viene rimosso facendo prima un&#39;incisione al limbus, in camera anteriore con una lama di 15 ° (Figura 1). Poi una lama ricurva di cornea-sclerale forbici viene inserito nella camera anteriore. Circonferenziale tagli sono fatti a cornea, appena anteriormente al limbus. </li><li> 0,12 Colibri pinze e forbici Westcott sono usati per tagliare l&#39;iride circonferenza anteriore del corpo ciliare. </li><li> Il nucleo dell&#39;obiettivo sia stato rimosso con pinza 0,12 Colibri o una lama di 15 ° (supersharp) e la corteccia e la capsula con le pinze. </li></ol> 2. Nucleo aspirazione vitreo. <ol><li> Un 23-gauge a 5-cc siringa è inserita nella metà del vitreo (Figura 1). </li><li> Circa 1 ml o più di nucleo vitreo è delicatamente aspirato. </li><li> Il campione viene quindi posto in una provetta per microcentrifuga e poi in azoto liquido. </li></ol> 3. Anteriore Hyaloid Dissection. <ol><li> Il hyaloid anteriore è visto come un semi-anello trasparente regolando la luce incidente da una luce microscopio collo d&#39;oca. Aspirazione precedente del nucleo vitreo separa il hyaloid anteriore da altre strutture per una più facile identificazione. </li><li> Il foglio di tessuto elastico viene accuratamente tirato fuori dal corpo ciliare con Colibri o pinze spogliatoio e tagliato con le forbici Vännäs. Questa manovra viene ripetuta. </li><li> Il campione viene quindi posto in una provetta per microcentrifuga e poi in azoto liquido. </li></ol> 4. Base Dissection vitreo. <ol><li> Utilizzando 0,12 pinze per stabilizzare l&#39;oculare, forbici Westcott sono usati per &quot;fiore&quot; l&#39;occhio facendo quattro equidistanti antistress tagli dal corpo ciliare verso la testa del nervo ottico. </li><li> La pars plicata del corpo ciliare (Figura 2) viene rimosso da ciascuno dei quadranti con le forbici Westcott. </li><li> La base del vitreo viene poi afferrato su entrambi i lati della serrata con una pinza il pars plana e la retina (Figura 2). </li><li> Trazione continua sulla base del vitreo è applicato con le pinze. Taglio sequenziale con le forbici Westcott estratti di un semi-trasparente tessuto con un aspetto &quot;filo di perle&quot;, come viene asportato. </li><li> Il campione viene quindi posto in una provetta per microcentrifuga e poi in azoto liquido. </li></ol> 5. Cortex rimozione vitreo. <ol><li> La pars plana è asportato da ciascuno dei quadranti Westcott con le forbici, tagliando il foglio di circa 3 mm posteriormente al serrata (Figura 2). </li><li> Tra i volantini dei tessuti, la corteccia vitreo è visualizzato come una pellicola semi trasparente. </li><li> Il film elastico può essere afferrato con pinze 0,12 o detenuti da adesione ad una Weck-Cel spugna chirurgica. La corteccia vitreo è poi tirato via dalla retina e asportato con le forbici Westcott (Figura 1). </li><li> Il campione è posto in una provetta per microcentrifuga e poi in azoto liquido. Tutti i campioni sono conservati a -80 ° C fino al momento utilizzato per la sperimentazione. </li></ol> 6. Rappresentante Risultati Campioni di tessuto possono essere elaborati da una varietà di metodi per esperimenti specifici. Nel nostro caso, i campioni sono stati sottoposti ad analisi delle proteine ​​mediante SDS-PAGE (Figura 3). <img src="/files/ftp_upload/2455/2455fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Vista in sezione trasversale dell&#39;occhio umano raffigurante sottostrutture diverse del corpo vitreo. Il vitreo più anteriore è un sottile strato di collagene chiamato hyaloid anteriore. Il nucleo vitreo comprende l&#39;intera regione centrale del corpo vitreo. Questa porzione del vitreo è più acquoso in contrasto con la base del vitreo, che è abbastanza viscoso per essere afferrato con pinze ed è saldamente attaccato al corpo ciliare e la retina sottostante. Che comprende il nucleo vitreo è un guscio molto sottile collagene chiamata corteccia vitreo. <img src="/files/ftp_upload/2455/2455fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Anatomia base del vitreo. La base del vitreo è un semi-trasparente sottostruttura del corpo vitreo situato lungo la serrata (frecce bianche), che è la linea di demarcazione che separa il corpo ciliare e la retina. Il margine anteriore della base del vitreo si estende su la pars plana (linea bianca) del corpo ciliare. Il bordo posteriore della base del vitreo si estende 2-3-mm posteriormente al serrata (trattino bianco). Per accise base del vitreo, pinze sono utilizzati per afferrare il tessuto e tirarlo via dal corpo ciliare e la retina sottostante. Una volta elevato, forbici Westcott sono usati per tagliare lungo la base. <img src="/files/ftp_upload/2455/2455fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Monodimensionale SDS-PAGE di elementi del corpo vitreo. Concentrazioni di proteine ​​totali del hyaloid anteriore, base del vitreo, vitnucleo reous, e la corteccia vitreo sono stati 11,24, 20.1, 16,61, 14,24 mg / ml, rispettivamente. Elettroforesi su gel è stata effettuata a 200 kV per 45 minuti, colorati con Flamingo (Bio-Rad), e visualizzati utilizzando un sistema VersaDoc Imaging (Bio-Rad). I profili per i diversi tessuti mostrano diversi gruppi simili, indicando sia conservata o cross-contaminazione delle proteine, così come unica band (asterisco), indicando proteine ​​differenzialmente localizzate.

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	<li>Bishop, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+macromolecules+and+supramolecular+organisation+of+the+vitreous+gel.">Structural macromolecules and supramolecular organisation of the vitreous gel.</a> Prog Retin Eye Res. 19, 323-344 (2000).</li><li>Sebag, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+biology+of+pharmacologic+vitreolysis.">Molecular biology of pharmacologic vitreolysis.</a> Trans Am Ophthalmol Soc. 103, 473-494 (2005).</li><li>Yoshimura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+analysis+of+inflammatory+immune+mediators+in+vitreoretinal+diseases.">Comprehensive analysis of inflammatory immune mediators in vitreoretinal diseases.</a> PLoS One. 4, e8158-e8158 (2009).</li><li>Gao, B. B., Chen, X., Timothy, N., Aiello, L. P., Feener, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+vitreous+proteome+in+diabetes+without+diabetic+retinopathy+and+diabetes+with+proliferative+diabetic+retinopathy.">Characterization of the vitreous proteome in diabetes without diabetic retinopathy and diabetes with proliferative diabetic retinopathy.</a> J Proteome Res. 7, 2516-2525 (2008).</li><li>Izuta, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+SOD+and+VEGF+are+increased+in+vitreous+bodies+from+proliferative+diabetic+retinopathy+patients.">Extracellular SOD and VEGF are increased in vitreous bodies from proliferative diabetic retinopathy patients.</a> Mol Vis. 15, 2663-2672 (2009).</li><li>Azimzadeh, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formalin-fixed+paraffin-embedded+(FFPE)+proteome+analysis+using+gel-free+and+gel-based+proteomics.">Formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) proteome analysis using gel-free and gel-based proteomics.</a> J Proteome Res. 9, 4710-4720 (2010).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Il corpo vitreo è un gel semitrasparente cui composizione molecolare è poco conosciuta, soprattutto a livello delle sue sottostrutture: la base del vitreo, core, corteccia, e hyaloid anteriore. Il nucleo vitreo contiene collagene II, V, IX e XI, insieme con proteoglicani condroitin solfato, solfato di eparan proteoglicani e acido ialuronico. 1,2 biomarcatori proteine ​​nel nucleo vitreo sono stati associati a malattie come la retinopatia diabetica. 3-5 Come queste proteine ​​sono differenzialmente espressi in ciascuna delle sottostrutture, e in molti casi l&#39;identità specifica proteina, non sono noti. Questi dettagli può dare qualche idea per l&#39;origine delle proteine ​​associate a specifiche patologie vitreo-retinica e contribuire a future terapie target. Nonostante l&#39;ottimo intervallo post mortem per la dissezione dei tessuti non è stata determinata, la degradazione delle proteine ​​possono influenzare gli esperimenti a valle. Per esempio, l&#39;immunoistochimica è influenzato in 12 ore gli occhi post mortem ed alcune specifiche attività enzimatiche può essere ridotta entro poche ore (osservazione inedita). Tutti i tessuti in questo studio sono stati raccolti tra 2 e 8 ore di morte senza significativi cambiamenti nell&#39;espressione delle proteine ​​o idoneità per analsyis proteomica. Il metodo di congelamento azoto liquido di conservazione viene scelto più di fissaggio per evitare piccoli cambiamenti nella struttura delle proteine ​​causata da fissativo reticolazione, che è stato dimostrato in altri tessuti da LC-MS/MS. 6 studi di proteomica dipenderà dalla capacità di precisione sezionare i diversi compartimenti del vitreo, come dimostrato in questo esperimento video. Abbiamo convalidato la tecnica di dissezione con 1-dimensionale SDS-PAGE. Come i nostri risultati suggeriscono, ci sono proteine ​​differenzialmente espressi nelle diverse sottostrutture corpo vitreo. Identificare queste proteine ​​fornirà una comprensione più dettagliata di compartimentazione vitreo.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td></tr><tr><td> 0,12 forcipe </td><td> Storz oftalmica </td><td> E1502 </td></tr><tr><td> 5-cc siringa </td><td> Becton Dickinson- </td><td> 309603 </td></tr><tr><td> Pinza diritta spogliatoio con dentellature </td><td> Storz oftalmica </td><td> E1400 </td></tr><tr><td> 23 gauge </td><td> Becton Dickinson- </td><td> 305145 </td></tr><tr><td> Colibri forcipe </td><td> Storz oftalmica </td><td> 2 / 132 </td></tr><tr><td> Castroviejo forbici angolata corneale </td><td> Storz oftalmica </td><td> E3223 </td></tr><tr><td> Vännäs Forbici capsulotomia curvo </td><td> Storz oftalmica </td><td> E3387 </td></tr><tr><td> Weck-Cel chirurgico lance </td><td> Medtronic </td><td> 0008680 </td></tr><tr><td> Forbici Tenotomia Westcott curvo </td><td> Storz oftalmica </td><td> E3320 </td></tr></tbody></table>

dissection of human vitreous body elements for proteomic analysis

Il vitreo è una otticamente chiaro, matrice di collagene extracellulare che riempie l&#39;interno dell&#39;occhio e sovrappone la retina. 1,2 interazioni anomale tra sottostrutture vitreo e la retina alla base di diverse patologie vitreo-retinica, tra cui rottura retinica e distacco, pucker maculare, foro maculare, età degenerazione maculare, la trazione vitreomacular, proliferazione vitreoretinica, retinopatia diabetica proliferativa, e vitreoretinopathies ereditato. 1,2 La composizione molecolare delle sottostrutture vitreo non è noto. Poiché il corpo vitreo è trasparente con limitato accesso chirurgico, è stato difficile studiare le sue sottostrutture a livello molecolare. Abbiamo sviluppato un metodo per separare e conservare questi tessuti per l&#39;analisi proteomica e biochimica. La tecnica di dissezione in questo video sperimentale mostra come isolare base del vitreo, hyaloid anteriore, centrale vitreo, e la corteccia vitreo da occhi umani post-mortem. Monodimensionale SDS-PAGE analisi di ogni componente vitreo ha dimostrato che la nostra tecnica dissezione portato a quattro profili proteici uniche corrispondenti a ciascuna sottostruttura del corpo vitreo umano. Identificazione di proteine ​​differenzialmente compartimenti rivelerà molecole candidate sottostante varie malattie vitreo-retinica.

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Dissection of Human Vitreous Body Elements for Proteomic Analysis

Questo video mostra una tecnica efficace per differenziare e sezionare le varie semitrasparente strutture del corpo vitreo in post mortem occhi.

Dissezione di Human Elements corpo vitreo per l&#39;analisi proteomica

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