Name: a high throughput screen for biomining cellulase activity from metagenomic libraries
Uploaded: 2011-02-01T17:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A High Throughput Screen for Biomining Cellulase Activity from Metagenomic Libraries at JoVE.com

Les auteurs tiennent à remercier le Dr Steve Withers et Hong-Ming Chen pour fournir des DNP-cellobioside substrat.

Avant de commencer ce protocole, vous aurez besoin de votre banque métagénomique stockées dans un format de 384 plaque de bien. Dans notre étude, nous avons utilisé le vecteur pCC1 exemplaire de contrôle fosmide en combinaison avec le phage T1 résistant TransforMax EPI300-T1 R E. cellules coli comme hôte bibliothèque et stockées dans nos assiettes à -80 ° C 11. 1. La réplication des plaques banque métagénomique <ol><li> Décongeler les...

<ol>
	<li>Rubin, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomics+of+cellulosic+biofuels.">Genomics of cellulosic biofuels.</a> Nature. 454, 841-845 (2008).</li><li>Voget, S., Steele, H. L., Streit, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+metagenome+derived+halotolerant+cellulase.">Characterization of a metagenome derived halotolerant cellulase.</a> J. Biotechnol. 126, 26-36 (2006).</li><li>Duan, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+partial+characterization+of+novel+genes+encoding+acidic+cellulases+from+metagenomes+of+buffalo+rumens.">Isolation and partial characterization of novel genes encoding acidic cellulases from metagenomes of buffalo rumens.</a> J. Appl. Microbiol. 107, 245-256 (2009).</li><li>Zhang, Y. H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outlook+for+cellulase+improvement:+Screening+and+selection+strategies.">Outlook for cellulase improvement: Screening and selection strategies.</a> Biotech. Advances. 24, 452-481 (2006).</li><li>Teather, R. M., Wood, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+congo+red-polysaccharide+interactions+in+enumeration+and+characterization+of+cellulolytic+bacteria+from+the+bovine+rumen.">Use of congo red-polysaccharide interactions in enumeration and characterization of cellulolytic bacteria from the bovine rumen.</a> Appl. And Environ. Microbiol. 43, 777-780 (1982).</li><li>Sharrock, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellulase+assay+methods:+a+review.">Cellulase assay methods: a review.</a> J. Biochem and Biophys Methods. 17, 81-106 (1988).</li><li>Kasana, R. C., Salwan, R., Dhar, H., Dutt, S., Gulati, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+easy+method+for+detection+of+microbial+cellulases+on+agar+plates+using+Gram's+Iodine.">A rapid and easy method for detection of microbial cellulases on agar plates using Gram's Iodine.</a> Curr. Microbiology. 57, 503-507 (2008).</li><li>Huang, J. S., Tang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitive+assay+for+cellulase+and+dextranase.">Sensitive assay for cellulase and dextranase.</a> Anal. Biochem. 73, 369-377 (1976).</li><li>Tull, D., Withers, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+cellulases+and+xylanases:+A+detailed+kinetic+study+of+the+exo-beta-1,4-glycanase+from+Cellulomonas+fimi.">Mechanisms of cellulases and xylanases: A detailed kinetic study of the exo-beta-1,4-glycanase from Cellulomonas fimi.</a> Biochemistry. 33, 6363-6370 (1994).</li><li>Martinez, A., Bradley, A. S., Waldbauer, J. R., Summons, R. E., DeLong, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteorhodopsin+photosystem+gene+expression+enables+photophosphorylation+in+a+heterologous+host.">Proteorhodopsin photosystem gene expression enables photophosphorylation in a heterologous host.</a> PNAS. 104, 5590-5595 (2007).</li><li>Taupp, M., Lee, S., Hawley, A., Yang, J., Hallam, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+Insert+Environmental+Genomic+Library+Production.">Large Insert Environmental Genomic Library Production.</a> J Vis Exp. , (2009).</li><li>Martinez, A., Tyson, G. W., DeLong, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+known+and+novel+phosphonate+utilization+pathways+in+marine+bacteria+revealed+by+functional+screening+and+metagenomic+analyses.">Widespread known and novel phosphonate utilization pathways in marine bacteria revealed by functional screening and metagenomic analyses.</a> Environ Microbiol. 12, 222-238 (2010).</li><li>Wild, J., Hradecna, Z., Szybalski, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditionally+amplifiable+BACs:+Switching+from+single-copy+to+high-copy+vectors+and+genomic+clones.">Conditionally amplifiable BACs: Switching from single-copy to high-copy vectors and genomic clones.</a> Genome Research. 12, 1434-1444 (2002).</li><li>Johnson, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sacchirification+of+complex+cellulosic+substrates+by+the+cellulase+system+from+Clostridium+thermocellum.">Sacchirification of complex cellulosic substrates by the cellulase system from Clostridium thermocellum.</a> Appl Environ Microbiology. 43, 1125-1132 (1982).</li><li>Stutzenberger, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellulase+Production+by+Thermomonospora+curvata+isolated+from+municipal+solid+waste+compost.">Cellulase Production by Thermomonospora curvata isolated from municipal solid waste compost.</a> Appl Environ Microbiol. 22, 147-152 (1971).</li></ol>

Un écran à haut débit pour la détection rapide de l&#39;activité cellulolytique partir d&#39;une bibliothèque génomique insérez métagénomique grandes ADN exprimée dans E. coli est décrite dans ce protocole. Cette méthode est une amélioration par rapport au dosage de CMC / rouge Congo couramment utilisé dans la littérature. C&#39;est une solution basée, et permet pour un pot de dépistage chimie en plaques 384 puits, avec la sortie finale lectures d&#39;absorbance à partir d&#39;un lecteur de p...

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>qPix2</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Genetix</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>With 384-pin gridding head</td>
</tr>
<tr>
<td>qFill3</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Genetix</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>With 384-well manifold</td>
</tr>
<tr>
<td>Varioskan</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo-Fisher</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>RapidStak</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo-Fisher</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Connected to Varioskan</td>
</tr>
<tr>
<td>Micro90 Detergent</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cole-Parmer</td>
<td>18100-00</td>
<td>Diluted to 2% in water</td>
</tr>
<tr>
<td>Ethanol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Major Lab Supplier</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Diluted to 80% in water</td>
</tr>
<tr>
<td>Chloramphenicol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>C0378</td>
<td>12.5mg/mL in ethanol</td>
</tr>
<tr>
<td>LB broth, Miller</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>BP1426-2</td>
<td>25g/L, autoclaved</td>
</tr>
<tr>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>384-well flat bottom plates</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Corning</td>
<td>3680</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L-(+)-Arabinose</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>A3256</td>
<td>100mg/mL in water</td>
</tr>
<tr>
<td>Potassium Acetate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>P171</td>
<td>50mM in water, autoclaved, adjusted to pH 5.5 with HCl</td>
</tr>
<tr>
<td>Triton X-100</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>BP151</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Trizma hydrochloride</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>T3253</td>
<td>In TE buffer solution, 100mM</td>
</tr>
<tr>
<td>EDTA disodium salt</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>E5134</td>
<td>In TE buffer solution, 10mM</td>
</tr>
<tr>
<td>2,4-dinitrophenyl cellobioside</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Provided by Dr. Steve Withers, UBC</td>
</tr>
<tr>
<td>Dimethyl Sulfoxide</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>D8418</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

a high throughput screen for biomining cellulase activity from metagenomic libraries

La cellulose, la source la plus abondante de carbone organique sur la planète, possède une vaste applications industrielles avec un accent croissant sur ​​la production de biocarburants 1. Les méthodes chimiques de modifier ou de dégrader la cellulose exigent généralement les acides forts et des températures élevées. En tant que tel, les méthodes enzymatiques sont devenus importants dans le processus de bioconversion. Alors que l&#39;identification des cellulases actifs à partir d&#39;isolats bactériens et fongiques a été quelque peu efficaces, la grande majorité des microbes dans la nature résister à la culture en laboratoire. Génomique environnementale, aussi connu comme des approches métagénomique, de dépistage ont un grand potentiel pour combler le fossé de culture dans la recherche d&#39;enzymes de bioconversion roman. Approches de dépistage métagénomique ont réussi à récupérer les cellulases roman d&#39;environnements aussi variés que les sols 2, 3 buffles du rumen et l&#39;intestin postérieur des termites 4 en utilisant des plaques d&#39;agar carboxyméthylcellulose (CMC) tachés avec le Congo colorant rouge (basé sur la méthode de Teather et Wood 5). Cependant, la méthode MCC est limité dans le débit, n&#39;est pas quantitatif et manifeste un signal faible à 6 bruit. D&#39;autres méthodes ont été signalés, mais 7,8 chacun utiliser une plaque de gélose de base de test, qui est indésirable pour criblage à haut débit des grandes banques génomiques d&#39;insertion. Nous présentons ici une solution à base d&#39;écran pour l&#39;activité cellulase en utilisant un dinitrophénol chromogène (DNP)-cellobioside substrat 9. Notre bibliothèque a été cloné dans le contrôle pCC1 copie fosmide pour augmenter la sensibilité du dosage par induction du nombre de copies 10. La méthode utilise un pot de chimie en microplaques 384 puits avec la lecture finale fournie comme une mesure d&#39;absorbance. Cette lecture est quantitative, sensible et automatisé avec un débit allant jusqu&#39;à 384 plaques 100X-même par jour en utilisant un gestionnaire de liquide et de lecteur de plaque avec le système d&#39;empilage ci-joint.

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A High Throughput Screen for Biomining Cellulase Activity from Metagenomic Libraries

Ce protocole décrit un écran haut débit pour l&#39;activité cellulolytique d&#39;une banque métagénomique exprimé dans Escherichia coli. L&#39;écran est la solution basée et hautement automatisé et utilise un pot de chimie dans des microplaques 384 puits avec la lecture finale comme une mesure d&#39;absorbance.

Un écran à haut débit pour la bioprospection minière activité cellulase à partir des bibliothèques métagénomique

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