Name: a high throughput screen for biomining cellulase activity from metagenomic libraries
Uploaded: 2011-02-01T17:00:00
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लेखकों DNP - Cellobioside सब्सट्रेट प्रदान करने के लिए डॉ. स्टीव मुरझाए और हांगकांग मिंग चेन धन्यवाद देना चाहूंगा.

इस प्रोटोकॉल शुरू करने से पहले, आप अपने metagenomic एक 384 अच्छी तरह से थाली स्वरूप में संग्रहीत पुस्तकालय की आवश्यकता होगी. हमारे अध्ययन में, हम T1 प्रतिरोधी फेज EPI300 T1 TransforMax आर ई के साथ संयोजन में pCC1 प्रतिलिपि ...

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	<li>Rubin, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomics+of+cellulosic+biofuels.">Genomics of cellulosic biofuels.</a> Nature. 454, 841-845 (2008).</li><li>Voget, S., Steele, H. L., Streit, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+metagenome+derived+halotolerant+cellulase.">Characterization of a metagenome derived halotolerant cellulase.</a> J. Biotechnol. 126, 26-36 (2006).</li><li>Duan, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+partial+characterization+of+novel+genes+encoding+acidic+cellulases+from+metagenomes+of+buffalo+rumens.">Isolation and partial characterization of novel genes encoding acidic cellulases from metagenomes of buffalo rumens.</a> J. Appl. Microbiol. 107, 245-256 (2009).</li><li>Zhang, Y. H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outlook+for+cellulase+improvement:+Screening+and+selection+strategies.">Outlook for cellulase improvement: Screening and selection strategies.</a> Biotech. Advances. 24, 452-481 (2006).</li><li>Teather, R. M., Wood, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+congo+red-polysaccharide+interactions+in+enumeration+and+characterization+of+cellulolytic+bacteria+from+the+bovine+rumen.">Use of congo red-polysaccharide interactions in enumeration and characterization of cellulolytic bacteria from the bovine rumen.</a> Appl. And Environ. Microbiol. 43, 777-780 (1982).</li><li>Sharrock, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellulase+assay+methods:+a+review.">Cellulase assay methods: a review.</a> J. Biochem and Biophys Methods. 17, 81-106 (1988).</li><li>Kasana, R. C., Salwan, R., Dhar, H., Dutt, S., Gulati, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+easy+method+for+detection+of+microbial+cellulases+on+agar+plates+using+Gram's+Iodine.">A rapid and easy method for detection of microbial cellulases on agar plates using Gram's Iodine.</a> Curr. Microbiology. 57, 503-507 (2008).</li><li>Huang, J. S., Tang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitive+assay+for+cellulase+and+dextranase.">Sensitive assay for cellulase and dextranase.</a> Anal. Biochem. 73, 369-377 (1976).</li><li>Tull, D., Withers, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+cellulases+and+xylanases:+A+detailed+kinetic+study+of+the+exo-beta-1,4-glycanase+from+Cellulomonas+fimi.">Mechanisms of cellulases and xylanases: A detailed kinetic study of the exo-beta-1,4-glycanase from Cellulomonas fimi.</a> Biochemistry. 33, 6363-6370 (1994).</li><li>Martinez, A., Bradley, A. S., Waldbauer, J. R., Summons, R. E., DeLong, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteorhodopsin+photosystem+gene+expression+enables+photophosphorylation+in+a+heterologous+host.">Proteorhodopsin photosystem gene expression enables photophosphorylation in a heterologous host.</a> PNAS. 104, 5590-5595 (2007).</li><li>Taupp, M., Lee, S., Hawley, A., Yang, J., Hallam, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+Insert+Environmental+Genomic+Library+Production.">Large Insert Environmental Genomic Library Production.</a> J Vis Exp. , (2009).</li><li>Martinez, A., Tyson, G. W., DeLong, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+known+and+novel+phosphonate+utilization+pathways+in+marine+bacteria+revealed+by+functional+screening+and+metagenomic+analyses.">Widespread known and novel phosphonate utilization pathways in marine bacteria revealed by functional screening and metagenomic analyses.</a> Environ Microbiol. 12, 222-238 (2010).</li><li>Wild, J., Hradecna, Z., Szybalski, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditionally+amplifiable+BACs:+Switching+from+single-copy+to+high-copy+vectors+and+genomic+clones.">Conditionally amplifiable BACs: Switching from single-copy to high-copy vectors and genomic clones.</a> Genome Research. 12, 1434-1444 (2002).</li><li>Johnson, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sacchirification+of+complex+cellulosic+substrates+by+the+cellulase+system+from+Clostridium+thermocellum.">Sacchirification of complex cellulosic substrates by the cellulase system from Clostridium thermocellum.</a> Appl Environ Microbiology. 43, 1125-1132 (1982).</li><li>Stutzenberger, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellulase+Production+by+Thermomonospora+curvata+isolated+from+municipal+solid+waste+compost.">Cellulase Production by Thermomonospora curvata isolated from municipal solid waste compost.</a> Appl Environ Microbiol. 22, 147-152 (1971).</li></ol>

एक बड़े डालने के जीनोमिक डीएनए metagenomic पुस्तकालय से cellulolytic गतिविधि के तेजी से पता लगाने के लिए एक उच्च throughput स्क्रीन ई. में व्यक्त कोलाई इस प्रोटोकॉल में वर्णित है. इस विधि / सीएमसी कांगो लाल परख सामान्य?...

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>qPix2</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Genetix</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>With 384-pin gridding head</td>
</tr>
<tr>
<td>qFill3</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Genetix</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>With 384-well manifold</td>
</tr>
<tr>
<td>Varioskan</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo-Fisher</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>RapidStak</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo-Fisher</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Connected to Varioskan</td>
</tr>
<tr>
<td>Micro90 Detergent</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cole-Parmer</td>
<td>18100-00</td>
<td>Diluted to 2% in water</td>
</tr>
<tr>
<td>Ethanol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Major Lab Supplier</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Diluted to 80% in water</td>
</tr>
<tr>
<td>Chloramphenicol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>C0378</td>
<td>12.5mg/mL in ethanol</td>
</tr>
<tr>
<td>LB broth, Miller</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>BP1426-2</td>
<td>25g/L, autoclaved</td>
</tr>
<tr>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>384-well flat bottom plates</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Corning</td>
<td>3680</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L-(+)-Arabinose</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>A3256</td>
<td>100mg/mL in water</td>
</tr>
<tr>
<td>Potassium Acetate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>P171</td>
<td>50mM in water, autoclaved, adjusted to pH 5.5 with HCl</td>
</tr>
<tr>
<td>Triton X-100</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>BP151</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Trizma hydrochloride</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>T3253</td>
<td>In TE buffer solution, 100mM</td>
</tr>
<tr>
<td>EDTA disodium salt</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>E5134</td>
<td>In TE buffer solution, 10mM</td>
</tr>
<tr>
<td>2,4-dinitrophenyl cellobioside</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Provided by Dr. Steve Withers, UBC</td>
</tr>
<tr>
<td>Dimethyl Sulfoxide</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>D8418</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

a high throughput screen for biomining cellulase activity from metagenomic libraries

सेलूलोज़, ग्रह पर कार्बनिक कार्बन का सबसे प्रचुर स्रोत, जैव ईंधन उत्पादन 1 पर बढ़ते जोर देने के साथ व्यापक औद्योगिक अनुप्रयोगों है. रासायनिक तरीकों को संशोधित करने या सेलूलोज़ नीचा आम तौर पर मजबूत एसिड और उच्च तापमान की आवश्यकता है. जैसे, enzymatic तरीकों bioconversion प्रक्रिया में प्रमुख बन गए हैं. जबकि जीवाणु और कवक आइसोलेट्स से सक्रिय cellulases की पहचान कुछ हद तक प्रभावी किया गया है, प्रकृति में रोगाणुओं के विशाल बहुमत प्रयोगशाला खेती का विरोध. पर्यावरण जीनोमिक metagenomic स्क्रीनिंग दृष्टिकोण के रूप में भी जाना जाता है उपन्यास bioconversion एंजाइमों के लिए खोज में खेती अंतर को पूरा करने में महान वादा है. Metagenomic स्क्रीनिंग दृष्टिकोण सफलतापूर्वक वातावरण से उपन्यास cellulases बरामद 2 मिट्टी, भैंस रूमेण 3 और हिंद - पेट दीमक 4 का उपयोग carboxymethylcellulose (सीएमसी) अगर कांगो लाल रंग (teather और 5 लकड़ी की विधि के आधार पर) के साथ दाग प्लेटों के रूप में विविध के रूप में. हालांकि, सीएमसी विधि throughput में सीमित है, मात्रात्मक और शोर अनुपात 6 के लिए नहीं है एक कम संकेत प्रकट होता है. अन्य तरीकों 7,8 सूचित किया गया है, लेकिन प्रत्येक उपयोग अगर परख थाली आधारित है, जो बड़े डालने जीनोमिक पुस्तकालयों के उच्च throughput स्क्रीनिंग लिए अवांछनीय है. यहाँ हम एक cellulase chromogenic (DNP) dinitrophenol cellobioside 9 सब्सट्रेट का उपयोग कर गतिविधि के लिए समाधान आधारित स्क्रीन उपस्थित थे . हमारे पुस्तकालय pCC1 प्रतिलिपि प्रतिलिपि संख्या 10 प्रेरण के माध्यम से परख संवेदनशीलता को बढ़ाने के लिए fosmid नियंत्रण में क्लोन किया गया था. विधि अंतिम एक absorbance के माप के रूप में प्रदान की readout के साथ 384 अच्छी तरह से microplates में एक बर्तन रसायन का उपयोग करता है. इस readout मात्रात्मक, संवेदनशील और अप करने के प्रति दिन 100X 384 अच्छी तरह प्लेटें एक तरल और संलग्न stacking प्रणाली के साथ प्लेट पाठक हैंडलर का उपयोग करने के लिए throughput के साथ स्वचालित है.

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A High Throughput Screen for Biomining Cellulase Activity from Metagenomic Libraries

इस प्रोटोकॉल के एक metagenomic Escherichia कोलाई में व्यक्त पुस्तकालय से cellulolytic गतिविधि के लिए एक उच्च throughput स्क्रीन का वर्णन करता है. स्क्रीन आधारित है और अत्यधिक स्वचालित समाधान है, और एक absorbance के माप के रूप में अंतिम readout के साथ 384 अच्छी तरह से microplates में एक बर्तन रसायन का उपयोग करता है.

Metagenomic पुस्तकालय से Cellulase गतिविधि Biomining के लिए एक उच्च Throughput स्क्रीन

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High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

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