Name: quantification of dsdna using the hitachi f-7000 fluorescence spectrophotometer and picogreen dye
Uploaded: 2010-11-05T17:00:00
Duration: 7 min 44 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantification of dsDNA using the Hitachi F-7000 Fluorescence Spectrophotometer and PicoGreen Dye at JoVE.com

1. Configuração do Instrumento <ol><li> Ligue o espectrofluorímetro e deixe aquecer por 1 hora. </li><li> Usando o Excel cria um arquivo com as Normas e os dados da amostra, como mostrado na Figura 1 e salve-o em comma separated values ​​&quot;csv&quot; formato. <img src="/files/ftp_upload/2465/2465fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Padrões e dados de amostras. </li><li> Configurar fluorímetro da seguinte forma: <ol><li> Clique na <img src="/files/ftp_upload/2465/2465icon1.jpg" alt="Ícone de uma" /> botão, isto irá abrir a janela de Método de Análise, mostrado na Figura 2. <img src="/files/ftp_upload/2465/2465fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Janela Método de Análise, na guia Geral. Faça as seguintes seleções: <ul><li> Na &quot;medição&quot; de campo, selecione Fotometria do menu suspenso. </li><li> Em &quot;Operador&quot;, digite o nome do operador apropriado. </li><li> Não há necessidade de inserir informações no &quot;Instrumento&quot; campo. Esta é selecionado automaticamente pelo software. </li><li> A &quot;amostragem&quot; de campo é inativa quando se utiliza o leitor de microplacas. </li><li> Digite comentários que você pode querer incluir no relatório no campo &quot;Comentários&quot;. </li><li> No &quot;acessório&quot; de campo, insira as informações relacionadas com os acessórios utilizados para este teste. </li><li> Nota os botões do lado direito da janela. </li><li> O botão &quot;Load&quot; permite carregar Métodos de Análise salvo anteriormente. </li><li> O botão &quot;Salvar&quot; permite a atualização de um conjunto de parâmetros de teste ou método de análise anteriormente salvo e carregado, usando o mesmo nome. </li><li> O &quot;Salvar como&quot; botão permite salvar um novo conjunto de parâmetros de teste ou Método de Análise com um nome desejado. </li></ul> Agora clique em &quot;quantificação&quot; guia, veja a Figura 3 e faça as seguintes seleções. <img src="/files/ftp_upload/2465/2465fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Janela Método de Análise, guia quantitativa. <ul><li> No &quot;A determinação quantitativa do tipo&quot; campo, selecione Wavelength. Isto indica a leitura de fluorescência será feita utilizando o comprimento de onda selecionado. </li><li> Na &quot;calibragem&quot; tipo de campo, selecione 1 ª ordem. </li><li> No &quot;Número de comprimentos de onda&quot; de campo, selecione 1. </li><li> Na &quot;Concentração unidade&quot; de campo, entrar ng / mL. </li><li> Deixe desmarcado as caixas para &quot;Manual de Calibração&quot; e &quot;Força através da curva de zero&quot;. </li><li> No &quot;Digit após ponto decimal&quot; campo, selecione 2. </li><li> Na &quot;Baixa-limite de concentração&quot;, digite 0. </li><li> No campo limite &quot;superior de concentração, digite 10000. </li></ul> Agora clique em &quot;Instrumento&quot; guia e faça as seguintes seleções. <img src="/files/ftp_upload/2465/2465fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. Janela de análise do método, guia Instrumento <ul><li> No &quot;modo de dados:&quot; campo, selecione Fluorescência. </li><li> O &quot;Chopping velocidade&quot; campo está inativo no momento, ele é usado somente para medições de fosforescência. </li><li> No &quot;modo de comprimento de onda&quot; de campo, selecione Ambos fixo WL. </li><li> Na &quot;EX / WL1&quot; field entrar 480nm. </li><li> No &quot;EM / WL1&quot; field entrar 520nm. </li><li> Todos os outros campos sob EX e EM estão inativos no momento. </li><li> Na &quot;EX fenda&quot; campo selecione 5.0nm do menu suspenso. </li><li> No &quot;EM fenda&quot; campo selecione 5.0nm do menu suspenso. </li><li> Deixe desmarcada a caixa na frente da &quot;Tensão PMT 1-1000V&quot; campo. </li><li> No &quot;PMT Voltage&quot; campo, selecione 700V do menu suspenso. </li><li> No &quot;Auto calc estatística. Número&quot; campo selecione 2. </li><li> No &quot;Replica&quot; campo selecione 1. </li><li> No &quot;tempo de integração&quot; campo selecionar 0.1s. &lt;/ Li&gt; <li> No &quot;Delay&quot; campo de digitar ou selecionar 0s. </li></ul> Clique no separador &quot;Monitor&quot;. <img src="/files/ftp_upload/2465/2465fig5.jpg" alt="Figura 5" /> Figura 5. Janela de análise do método, guia Monitor. <ul><li> No &quot;eixo Y&quot;, &quot;Max:&quot; campo, selecione 10000 </li><li> No &quot;eixo Y&quot;, &quot;Min:&quot; campo, selecione 0. </li><li> Selecione a caixa à esquerda do &quot;Aberto de processamento de dados após a aquisição de dados&quot;. </li><li> Deixe desmarcada a caixa à esquerda do &quot;relatório de impressão depois de aquisição de dados&quot;, a menos que você queira um relatório a ser impresso automaticamente após as leituras sejam concluídas. </li></ul> Clique no botão &quot;Report&quot; guia, veja a Figura 6. <img src="/files/ftp_upload/2465/2465fig6.jpg" alt="Figura 6" /> Figura 6. Janela de análise do método, guia do relatório. <ul><li> Na &quot;saída&quot; de campo, selecionar Imprimir relatório do menu suspenso. Você também pode selecionar &quot;Use Microsoft Excel&quot; se você deseja que os dados exportados para o Excel, ou &quot;Use Folha Generator Imprimir&quot; se estiver usando o suplemento opcional no Gerador de Relatórios programa que permitirá gerar relatórios personalizados feitos. </li><li> Clique nas caixas para os itens que você quer ser incluído no relatório. </li><li> Para salvar todos os parâmetros selecionados nas diferentes guias do &quot;Método de Análise&quot; janela, clique novamente na guia &quot;Geral&quot; e salvá-las sob um nome de arquivo e em um local onde você pode encontrá-los para uso futuro, e clique no botão &quot; OK &quot;para fechar esta janela. </li><li> Isso completa a criação de parâmetros de teste do instrumento. </li><li> Agora vamos configurar o leitor de microplaca. </li><li> Clique na <img src="/files/ftp_upload/2465/2465icon2.jpg" alt="Ícone 2" /> botão, que trará a janela de configuração do MPR em cima. </li></ul> Selecione poços para os Padrões e amostras na guia Configurar MPR Window / Plate, como mostrado na Figura 7. <img src="/files/ftp_upload/2465/2465fig7.jpg" alt="Figura 7" /> Figura 7. MPR janela de instalação, guia Plate. <ul><li> Clique na posição A1 e arraste o mouse para E1, em seguida, clique na <img src="/files/ftp_upload/2465/2465icon3.jpg" alt="Ícone 3" /> botão. Isso irá selecionar as posições a serem utilizados para os padrões. Essas posições será destaque na cor verde. </li><li> Agora, precisamos selecionar as posições a F1 H3 para as amostras. Clique e arraste o mouse a partir de F1 posição, a posição H3 e depois clique no <img src="/files/ftp_upload/2465/2465icon4.jpg" alt="Ícone 4" /> botão, isto irá destacar as posições na cor amarela. </li><li> Em seguida, repita a mesma operação para os cargos de A2 E3, para selecionar as posições para medições da amostra. </li><li> Agora, vamos carregar o arquivo Comma Separated arquivo (csv) Variável preparado com antecedência com as Normas e informação de amostra. </li></ul> Clique no botão &quot;Bem informações&quot; guia da &quot;janela de configuração do MPR&quot;, como mostrado na Figura 8. <img src="/files/ftp_upload/2465/2465fig8.jpg" alt="Figura 8" /> Figura 8. MPR janela de instalação, guia de informação bem. <ul><li> Em seguida, clique na <img src="/files/ftp_upload/2465/2465icon5.jpg" alt="Ícone 5" /> botão. Uma janela do Windows Explorer será aberto que, como mostrado na Figura 9, o que permitirá localizar o &quot;Bem information.csv&quot; arquivo e carregá-lo. <img src="/files/ftp_upload/2465/2465fig9.jpg" alt="Figura 9" /> Figura 9. Carregando informações de amostra bem. Depois de carregar o &quot;Bem informações&quot; arquivo, a &quot;informação Bem&quot; vai olhar como mostrado na Figura 10 <img src="/files/ftp_upload/2465/2465fig10.jpg" alt="Figura 10" /> Figura 10. Carregado de informações de amostra bem. </li></ul></li></ol></li></ol> 2. Picogreen Preparação de amostras de Ensaio <ol><li> Prepare 1X tampão TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA), adicionando 1 mL de 20 X tampão TEa 19 mL dI H 2 O. </li><li> Prepare PicoGreen Solução Reagente pela adição de 50 mL 200 X Reagente PicoGreen para 9,95 1 X mL tampão TE. </li><li> Elaborar normas (Lambda dsDNA) fazendo diluições em série de ações dsDNA (100 mcg / mL). Primeiro preparar uma solução de 50 mg / mL dsDNA adicionando 25 mL de estoque dsDNA (100 mcg / mL) e 25 mL 1 x tampão TE. Em seguida, preparar as soluções padrão, adicionando os volumes indicados de dsDNA e buffer como listadas na tabela abaixo: <table border="1"><tbody><tr><td> Concentração de dsDNA </td><td> Volume de dsDNA </td><td> Volume de Tampão </td></tr><tr><td> 1 mg / mL </td><td> 20 mL de 50 mcg / mL dsDNA </td><td> 980 mL 1 X tampão TE </td></tr><tr><td> 0,1 g / mL </td><td> 100 L de 1 mg / mL dsDNA </td><td> 900 mL 1 X tampão TE </td></tr><tr><td> 0,01 mcg / mL </td><td> 100 L de 0,1 mcg / mL dsDNA </td><td> 900 mL 1 X tampão TE </td></tr><tr><td> 0,001 mg / mL </td><td> 100 L de 0,01 mcg / mL dsDNA </td><td> 900 mL 1 X tampão TE </td></tr></tbody></table></li></ol> 3. Medição de Padrões e fluorescência da amostra <ol><li> Pipetar 150 mL de cada padrão em poços A1-E1 de uma placa de 96 poços, por Figura 7, e de acordo com a tabela a seguir: <table border="1"><tbody><tr><td> Bem </td><td> Padrão </td></tr><tr><td> A1 </td><td> 1 mg / mL </td></tr><tr><td> B1 </td><td> 0,1 g / mL </td></tr><tr><td> C1 </td><td> 0,01 mcg / mL </td></tr><tr><td> D1 </td><td> 0,001 mg / mL </td></tr><tr><td> E1 </td><td> 1 X tampão TE </td></tr></tbody></table></li><li> Pipetar 150 mL amostras desconhecidas em poços de F1 H3, mostrado na Figura 7 </li><li> Despeje PicoGreen solução preparada na etapa 1,2 em uma calha projetado para multi-canal de uso da pipeta. Use uma pipeta multi-canal para fornecer solução de 150 mL PicoGreen aos poços A1-H3. Solução de misturar e padrões cuidadosamente com pipeta. </li><li> Colocar a placa na área escura e esperar 2-5 minutos para a reação para se desenvolver. </li></ol> 4. Resultados representante A curva de calibração bom é avaliado utilizando os diferentes parâmetros fornecidos pelo software F-7000 em cima da medida das normas e cálculo da curva de calibração pelo software. O coeficiente de determinação indica a qualidade do ajuste dos padrões de medida e calculada a curva de calibração. Quanto mais próximo este valor é &quot;1&quot;, melhor o ajuste do valor medido e curva de calibração. Se o valor está longe de &quot;1&quot;, as normas devem ser reavaliados, preparado novamente, ou a adequação da curva de calibração mudou. A Figura 11 mostra um exemplo de uma curva de calibração com um coeficiente de determinação calculado = 0,99993, obtidos para a quantificação de dsDNA usando PicoGreen corante. <img src="/files/ftp_upload/2465/2465fig11.jpg" alt="Figura 11" /> Figura 11. Exemplo de dsDNA curva de calibração.

<ol>
	<li>Singer, V. L., Jones, L. J., Yue, S. T., Haugland, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+PicoGreen+reagent+and+development+of+a+fluorescence-based+solution+assay+for+double-stranded+DNA+quantitation.">Characterization of PicoGreen reagent and development of a fluorescence-based solution assay for double-stranded DNA quantitation.</a> Analytical Biochemistry. 249 (2), 228-238 (1997).</li></ol>

Luis A. Moreno e Kendra L. Cox são empregados por Hitachi High Technologies Latina que produz o instrumento utilizado neste artigo.

Pipetagem cuidadosa durante a preparação da amostra, bem como a utilização de um espectrofotômetro de fluorescência estável e sensível é essencial para obter bons resultados e reprodutíveis. No caso do espectrofotômetro de fluorescência utilizado para este teste, sugere-se com 300 mL de amostra de volume final no leitor de microplacas. Menor volume diminui a sensibilidade, e um volume maior pode causar contaminação cruzada entre os poços.

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Distilled H2O</td>
<td>Reagent</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Quant-iT Picogreen dsDNA Assay Kit from Invitrogen</td>
<td>Reagent</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>P7589</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Nalge Nunc Fluorescence Microplates p/n 237108</td>
<td>Supply</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>237108</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>12 Channel Eppendorf Micropipette</td>
<td>Supply</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>3516677</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1000 &mu;L Eppendorf Pipette</td>
<td>Supply</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>200 &mu;L Eppendorf Pipette </td>
<td>Supply</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>10 mL serological pipet</td>
<td>Supply</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Aluminum foil</td>
<td>Supply</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Pipette tips</td>
<td>Supply</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hitachi F-7000 Fluorescence Spectrophotometer with FL Solutions 2.1</td>
<td>Equipment</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>5J1-0003</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microplate Reader Accessory for F-7000</td>
<td>Equipment</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>5J0-0139</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

quantification of dsdna using the hitachi f-7000 fluorescence spectrophotometer and picogreen dye

Quantificação de DNA, especialmente em pequenas concentrações, é uma tarefa importante, com uma ampla gama de aplicações biológicas, incluindo padrão ensaios de biologia molecular, tais como síntese e purificação do DNA, aplicações de diagnóstico, tais como a quantificação de produtos de amplificação de DNA, e detecção de moléculas de DNA em drogas preparações. Durante este vídeo vamos demonstrar a capacidade do espectrofotômetro Hitachi F-7000 de fluorescência equipado com um acessório Placa Micro Reader para realizar dsDNA quantificação usando Molecular Probes Quant-it PicoGreen kit reagente corante. O Espectrofotômetro de Fluorescência F-7000 oferece alta sensibilidade e medições em alta velocidade. É um sistema altamente flexível, capaz de medir a fluorescência, luminescência, e fosforescência. Vários modos de medição estão disponíveis, incluindo comprimento de onda de digitalização, digitalizar tempo, fotometria e 3-D de medição de varredura. O espectrofotômetro tem sensibilidade na faixa de 50 picomoles de fluoresceína quando se utiliza um volume de amostra 300 mL na microplaca, e é capaz de medir velocidades de digitalização de 60.000 nm / minuto. Ele também tem uma ampla faixa dinâmica de até 5 ordens de magnitude, que permite o uso de curvas de calibração em uma ampla faixa de concentrações. O sistema óptico utiliza todos óptica reflexiva para o máximo de energia e sensibilidade. A faixa de comprimento de onda padrão é de 200 a 750 nm, e pode ser estendido a 900 nm quando se usa um dos opcionais perto fotomultiplicadores infravermelho. O sistema permite o controle de temperatura opcional para o leitor de placas 5-60 graus Celsius usando um externo opcional de temperatura controlada circulador de líquido. O leitor de microplaca permite o uso de 96 microplacas bem, ea velocidade de medição para 96 ​​poços é menos de 60 segundos ao usar o modo cinética. Controles de software para a F-7000 e Leitor de Microplacas também são altamente flexíveis. As amostras podem ser definidos em formatos uma coluna ou linha, e qualquer combinação de poços podem ser escolhidas para medições da amostra. Isto permite uma utilização óptima da microplaca. Além disso, o software permite importar as configurações da placa micro amostra criados no Excel e salvas em valores separados por vírgula, ou &quot;csv&quot; formato. Configurações microplaca de medição podem ser salvas e recuperadas pelo software para a conveniência e aumento da produtividade. Resultados dos dados pode ser saída para um relatório padrão, para o Excel, ou para um programa opcional Report Generator.

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Quantification of dsDNA using the Hitachi F-7000 Fluorescence Spectrophotometer and PicoGreen Dye

Demonstração de quantificação de dsDNA usando Molecular Probes PicoGreen corante e Hitachi Espectrofotômetro de Fluorescência F-7000 equipado com um acessório de leitor de microplacas.

Quantificação de dsDNA usando a Hitachi F-7000 Espectrofotômetro de Fluorescência e PicoGreen Dye

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