Name: direct delivery of mif morpholinos into the zebrafish otocyst by injection and electroporation affects inner ear development
Uploaded: 2011-01-07T18:00:00
Duration: 10 min 40 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Direct Delivery of MIF Morpholinos Into the Zebrafish Otocyst by Injection and Electroporation Affects Inner Ear Development at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door subsidies van de Deafness Research Foundation te Yc S en de NSF (IOS 0.930.096) naar KFB. KFB: NIH / NINDCD 2 RO1 DC04184, <a href="https://commons.era.nih.gov/commons/genericStatus.do?actionRole=nonPI&amp;applID=7854446&amp;uhf-token=Ugf7JvudZTCbTUW9jSAR1snMUgg%3D">3R01DC004184-08W1</a> , NSF DBI 0832862, NSF IOS 0930096

1. Elektroden voor het maken van Elektroporatie <ol><li> Snij 75 micrometer diameter wolfraam draad (AM Systems, Inc Carlsborg, WA) van geschikte lengte (ongeveer 3-5 cm) </li><li> Zet wolfraam draad door molex connector (pin gestempeld messing) </li><li> Wrap wolfraam draden en molex connector met krimpkous (CSP-technologie, Chicago, IL) en verwarmen met een bunsenbrander of warmte kanon van de krimpende slang afdichting op de draad </li><li> Te slijpen van de punt van wolfraam draad, duik de draad in 1,0 N natriumhydroxide (Conrad et al.. 1993) en, met behulp van een paperclip als de andere elektrode, elektrolyse de draad met een blokgolf Electroporator. De voorwaarden die wij gebruiken zijn vijf 50-volt pulsen van telkens 100 ms met 50 ms in tussen de pulsen. Elektroden moeten worden geslepen tot een diameter van 15-20 urn </li><li> Houd de draden in een lade in groeven geperst in boetseerklei voor gebruik in elektroporatie </li></ol> 2. Set Up Elektroporatie Station <ol><li> Tape 75μm wolframelektroden aangescherpt tot micromanipulators (World precisie-instrumenten). </li><li> Plaats micromanipulators aan beide zijden van de dissectiemicroscoop fase (Leica). </li><li> Verbind de elektroden met een Protect CUY-21 Bewerken Square Wave Electroporator (figuur 1). </li><li> Zet de electroporator en de parameters instellen voor elektroporatie, zoals spanning, pulsduur, en het aantal pulsen. De meest effectieve parameters voor dit experiment bleken te zijn drie 13-volt pulsen die elk geduurd 5.0ms, met 100ms tussen elke puls. Als elektroporatie creëert luchtbellen in het embryo, vermindering van de puls lengte. </li></ol> 3. Micro-injectie van Morpholinos Into zebravis Otic Blaasjes <ol><li> Oogst zebravis embryo&#39;s van een kweekbak. Incubeer de embryo&#39;s in embryo-raising medium met 0,3 PPM methyleenblauw (Westerfield, 2005) bij 28,5 ° C gedurende de nacht. </li><li> Trek glas naalden met een Sutter P-97 electrode puller </li><li> Warming-up een agarosegel basis (1% agarose in vis het water in een 10 mm petrischaal) tot 37 ° C in een waterbad </li><li> Verhit 1% laag smeltpunt agarose (LMPA) in vis water tot het gesmolten is en warm in de 37 ° C waterbad te houden. </li><li> Vul een glas met een naald morfolino oplossing (GeneTools, Corvallis, OR) en snijd de tip om juiste diameter. Plaats de injectienaald op een micromanipulator (Kuhn). </li><li> Gesneden naald tot ongeveer 10 urn en injecteer in minerale olie om ervoor te zorgen dat de punt voldoende afname van morfolino oplossing biedt. </li><li> Dechorinate embryo&#39;s op 24 uur postfertilization (HPF) en verdoven ze met MS222 (tricaïne, Sigma) in 0,3 PPM methyleenblauw vis water. </li><li> Lijn 3 tot 5 embryo&#39;s onder narcose op de agarosegel basis met de juiste kant naar boven voor handige uniforme analyse </li><li> Doe 1 tot 2 druppels van 1% LMPA over elke embryo en laat stollen voor het embryo vast te zetten </li><li> Draai de petrischaal, zodat de otic blaasje is aan de rechterkant </li><li> Plaats de naald in het lumen van de otic blaasje en injecteer de morfolino-oplossing met een PV820 Pneumatische PicoPump (World precisie-instrumenten) met een aangesloten stikstof tank (figuur 2) </li></ol> 4. Elektroporatie Procedure <ol><li> Verplaats de gemonteerde&#39;s naar de elektroporatie station onmiddellijk na de injectie </li><li> Plaats de positieve elektrode op het weefsel juist achter het Otic blaasje, maar dringen niet door, steek de negatieve elektrode in de hersenen net anterieur van de otic blaasje </li><li> Van toepassing zijn huidige gebruik van een voetpedaal of door op een schakelaar. </li><li> Giet het water vissen op agarose en verwijder de embryo&#39;s van agarose met wervelende en een glazen pipet. Wees voorzichtig dat u de embryo&#39;s beschadigen. Voor embryo&#39;s die zijn moeilijk te verwijderen, gebruik dan een naald om voorzichtig losmaken een LMPA rond de embryo. </li><li> Plaatsen embryo&#39;s in een plaat met methyleenblauw vis water en verhoog de ​​embryo&#39;s om de gewenste stappen voor de analyse (morfologische, immunohistochemische, in situ hybridisatie, etc en microscopische anlaysis). </li></ol> 5. Representatieve resultaten: <img src="/files/ftp_upload/2466/2466fig1.jpg" alt="Figuur 1" /> Figuur 1. Elektroporatie station. Elektroden werden gemaakt met behulp van geslepen 75μm Tungsten draden en verbonden door leidt tot een Protect CUY-21 Bewerken plein Wave Electroporator. Deze elektroden werden geplakt micromanipulators. <img src="/files/ftp_upload/2466/2466fig2.jpg" alt="Figuur 2" /> Figuur 2. Injectie station. Alle embryo&#39;s werden geïnjecteerd in het rechter oor is voor normalisatie. <img src="/files/ftp_upload/2466/2466fig3.jpg" alt="Figuur 3" /> Figuur 3. Phalloidin kleuring van actine filamenten met 3 DPF embryo&#39;s. (A) De drie DPF embryo injected met controle MO heeft sterke kleuring van phalloidin in het achterste macula (pm). (B) Het embryo dat werd geïnjecteerd met controle MO en daarna geëlectroporeerd vergelijkbare niveaus van phalloidin vlekken had in uur in de injectie alleen embryo&#39;s. (C) Injectie met MIF MO&#39;s in de otic blaasje alleen niet leiden tot vermindering van de phalloidin vlekken, terwijl de injectie van mif MO&#39;s, samen met elektroporatie veroorzaakte een dramatische vermindering van de phalloidin kleuring in de pm (D). am, anterior macula. <img src="/files/ftp_upload/2466/2466fig4.jpg" alt="Figuur 4" /> Figuur 4. Phalloidin kleuring van actine filamenten met 5 DPF larven. Er was geen verschil tussen de injectie (A) en injectie met elektroporatie wanneer de standaard controle morfolino werd gebruikt (B). Echter, toonde de 5 DPF larven die werden geïnjecteerd met MIF morpholinos en geëlektroporeerd verminderde phalloidin kleuring in het achterste macula (pm) (D), maar minder dramatisch dan 3 DPF, in vergelijking met de embryo dat werd geïnjecteerd met MIF morpholinos alleen (C ). am, anterior macula. <img src="/files/ftp_upload/2466/2466fig5.jpg" alt="Figuur 5" /> Figuur 5. Geacetyleerd tubuline kleuring van embryo&#39;s op 3 DPF. Het embryo in (A) kreeg geen injectie of elektroporatie. Het embryo in (B) was geëlektroporeerd maar kreeg geen injectie. Embryo&#39;s die zowel injectie en elektroporatie (C, D) met een MIF morpholinos zienderogen verminderd tubuline vlekken in vergelijking met de controlegroep. (Pm, posterior macula). <img src="/files/ftp_upload/2466/2466fig6.jpg" alt="Figuur 6" /> Figuur 6. Geacetyleerd tubuline kleuring van embryo&#39;s op 3 DPF met controle morfolino. (A) Embryo zonder enige behandeling vertoonde een sterke geacetyleerd tubuline kleuring in het achterste macula (pm) en een uitgebreide innervatie. (B) Embryo geïnjecteerd met controle morfolino. (C) Embryo behandeld met elektroporatie alleen. (D) Controle embryo met controle morfolino geïnjecteerd en geëlektroporeerd heeft een vergelijkbaar niveau van geacetyleerd tubuline in de achterste macula en innervatie in vergelijking met de niet-behandelde controle.

<ol>
	<li>Conrad, G. W., Bee, J. A., Roche, S. M., Teillet, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+microscalpels+by+electrolysis+of+tungsten+wire+in+a+meniscus.">Fabrication of microscalpels by electrolysis of tungsten wire in a meniscus.</a> J Neurosci Methods. 50, 123-127 (1993).</li><li>Suzuki, M., Takamura, Y., Maeno, M., Tochinai, S., Iyaguchi, D., Tanaka, I., Nishihira, J., Ishibashi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenopus+laevis+macrophage+migration+inhibitory+factor+is+essential+for+axis+formation+and+neural+development.">Xenopus laevis macrophage migration inhibitory factor is essential for axis formation and neural development.</a> J Biol Chem. 279, 21406-21414 (2004).</li><li>Barald, K. F., Kelley, M. W., W, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+placode+to+polarization:+new+tunes+in+inner+ear+development.">From placode to polarization: new tunes in inner ear development.</a> Development. 131, 4119-4135 (2004).</li></ol>

De productie van het artikel werd gesponsord door Gene Tools, LLC die produceren reagentia genoemd in de video en tekst.

We hebben met succes geïntroduceerd antisense oligonucleotide MO&#39;s in het oor van de 24 HPF zebravis embryo. Embryo&#39;s die zijn gerezen na de injectie en elektroporatie waren levensvatbaar zijn. Als de embryo&#39;s overleefde de elektroporatie, groeiden ze tegen normale tarieven in vergelijking met embryo&#39;s die waren kreeg geen behandeling, maar ook embryo&#39;s die alleen waren geïnjecteerd en embryo&#39;s die alleen was geweest geëlektroporeerd. We de effecten van MIF en MIF-achtige MO&#39;s waargenomen na oor injectie en elektroporatie door middel van etikettering met phalloidin en geacetyleerde tubuline. Phalloidin kleuring van actine filamenten in sensorische haarcellen van het achterste macula geeft aan dat elektroporatie van de MIF en MIF-achtige MO bij de 24-HPF stadium veroorzaakt veranderingen in haar cel en / of stereocilia cijfers in vergelijking met embryo&#39;s die alleen werden geïnjecteerd met de MO&#39;s (Figuur 3). Deze daling in het haar cel aantallen in overeenstemming is met de bevindingen van Shen et al.. (Ingediend) dat MO&#39;s te MIF en MIF-achtige leiden tot een vermindering van het aantal van de haarcellen in het zakvormig macula. De afname in haar cel aantallen in embryo&#39;s die werden geïnjecteerd met MOS en geëlektroporeerd aantonen dat elektroporatie kunnen helpen bij het verplaatsen van de MO&#39;s over het celmembraan, waardoor de omvang van de morfologische effecten in vergelijking met embryo&#39;s in de otic blaasje enige was geïnjecteerd. Veranderingen in de morfologie van de statoacoustic ganglion werden waargenomen door geacetyleerde tubuline vlekken. De omvang van innervatie door de statoacoustic ganglion werd beïnvloed, omdat embryo&#39;s die werden ingespoten en geëlectroporeerd tonen verminderde vertakking van de neurieten (figuur 5). Er kan ook worden verminderd condensatie van de ganglien-cellen en / of het verminderd aantal ganglioncellen, omdat de geacetyleerde tubuline kleuring is significant verlaagd in embryo&#39;s die zowel geïnjecteerd en geëlectroporeerd. Omdat mif is aangetoond kritisch te zijn voor de ontwikkeling van het zenuwstelsel (Suzuki et al.., 2004), kan de veranderingen gezien na elektroporatie het gevolg zijn van verhoogde transfectie van de MAV en MAV-achtige MO oplossing in het neuroblast cellen. Elektroporatie van antisense oligo morpholinos direct in het ontwikkelen van een weefsel is een nuttig instrument voor het regelen van de expressie van een gen tijdens de ontwikkeling dat weefsel, zowel ruimtelijk als in de tijd, in het embryo. Electroporatie van mif en MIF-achtige MO&#39;s in de weefsels van het binnenoor resulteerde in een abnormale morfologie van zowel de achterste macula en de statoacoustic ganglion. Er was een vermindering van het aantal van sensorische haarcellen in het achterste macula in embryo&#39;s die waren geïnjecteerd en geëlektroporeerd in vergelijking met embryo&#39;s die waren ontvangen geen behandeling of met embryo&#39;s die ofwel slechts geïnjecteerd of alleen geëlektroporeerd. Er was ook een daling in de mate van innervatie van de achterste sensorische patch door de statoacoustic ganglion en de grootte van de SAG. Elektroporatie is een waardevolle methode voor transfecteren macromoleculen in specifieke weefsels, met het voordeel van het observeren van de primaire effecten van dat DNA, RNA, of MO in de gewenste weefsel en onderscheid deze van secundaire effecten op andere weefsels, waaronder de hersenen, neurale lijst en periotic mesenchym op binnenoor ontwikkeling (Barald en Kelley, 2004).

<ol><li> MO: 0,3 mM van een combinatie van voor de MIF, MAV-achtige MO1, en ​​MAV-achtige MO2 werd gebruikt. Mif MO is complementair aan het startcodon van zebravis mif mRNA: 5&#39;-acatcggcatgactgcgacagagat-3 &#39;. Twee MO&#39;s werden gebruikt voor mif-like mif-like MO1 is complementair aan de translationele start site:. 5&#39;-GTTTCTATATTTATGAACGGCATGA-3 &#39;, terwijl de MIV-achtige MO2 afgeleid van AS volgorde op de intron1/exon 2 grens: 5&#39;-GATTCATCCTCTGAAGACGTAAGCC -3 &#39;. Controle MO was het gecodeerde nucleotidesequentie van Gene Tools: 5&#39;-CCTCTTACCTCAGTTACAATTTATA-3 &#39;. </li><li> methyleenblauw (0,3 ppm) in het water vissen </li><li> MS222 (tricaïne, Sigma, 0,64 mM in vis water) </li><li> Lage smeltpunt agarose (LMPA; Roche) </li><li> fenolrood (Sigma) </li><li> Anti-geacetyleerd tubuline (Sigma) </li><li> Alexa Fluor ® 488 geit anti-muis tweede antilichaam (Molecular Probes) </li><li> Texas rood-phalloidin (Molecular Probes) </li></ol>

direct delivery of mif morpholinos into the zebrafish otocyst by injection and electroporation affects inner ear development

In de afgelopen jaren, is elektroporatie uitgegroeid tot een populaire techniek voor in vivo transfectie van DNA, RNA, en morpholinos in verschillende weefsels, waaronder de ogen, de hersenen en somieten van de zebravis. Het voordeel van elektroporatie ten opzichte van andere methoden van genetische manipulatie is dat de specifieke weefsels kan worden gericht, zowel ruimtelijk als in de tijd, voor de invoering van macromoleculen door de toepassing van elektrische stroom. Hier beschrijven we het gebruik van elektroporatie voor transfecteren MIF en mif-achtige morpholinos in het weefsel van de zich ontwikkelende binnenoor van de zebravis. In eerdere studies, mif morfolino geïnjecteerd in embryo&#39;s op de 1 - tot 8-cellig stadium geleid tot grootschalige morfologische veranderingen in het zenuwstelsel en het oog, evenals het oor. Door zich te richten de weefsels van het binnenoor in latere stadia van ontwikkeling, kunnen we bepalen de primaire effecten van de MIF in de ontwikkelingslanden binnenoor, in tegenstelling tot secundaire effecten die kunnen voortvloeien uit de invloed van andere weefsels. Door gebruik te maken phalloidin en geacetyleerd tubuline vlekken op de morfologie van neuronen, neurale processen en haarcellen worden geassocieerd met het achterste macula studie, waren we in staat om de werkzaamheid van elektroporatie te beoordelen als een methode voor gerichte transfectie in de zebravis binnenoor. De blaasjes Otic van 24hpf embryo&#39;s werden ingespoten met morpholinos en geëlektroporeerd en werden vervolgens vergeleken met embryo&#39;s die waren kregen geen behandeling of waren alleen geïnjecteerd of geëlektroporeerd. Embryo&#39;s die werden geïnjecteerd en geëlektroporeerd lieten een afname in haar cel aantallen, verminderd innervatie door de statoacoustic ganglion (SAG) en minder SAG neuronen in vergelijking met controlegroepen. Onze resultaten toonden aan dat de directe levering van morpholinos in otocysts in latere stadia van de niet-specifieke zenuwstelsel en de neurale lijst effecten van morpholinos geleverd op de 1-8 cellig stadium voorkomt. Het staat ook het onderzoek van effecten die zijn gericht op het binnenoor en niet secundaire effecten op het oor van de primaire effecten op de hersenen, neurale lijst of periotic mesenchym.

Watch this Scientific Journal Video about Direct Delivery of MIF Morpholinos Into the Zebrafish Otocyst by Injection and Electroporation Affects Inner Ear Development at JoVE.com

Direct Delivery of MIF Morpholinos Into the Zebrafish Otocyst by Injection and Electroporation Affects Inner Ear Development

Een methode om rechtstreeks te leveren morpholinos in de zebravis otocyst op 24hpf is ontwikkeld. Met behulp van micro-injectie van morpholinos in het lumen van otic blaasje en elektroporatie tegen penetratie effect, waren we in staat om het effect van morpholinos op de hersenen te omzeilen en de effecten die specifiek zijn voor het binnenoor te verkrijgen.

Directe levering van MAV Morpholinos Into the zebravis Otocyst door injectie en elektroporatie van invloed op binnenoor Ontwikkeling

In recent years, electroporation has become a popular technique for in vivo transfection of DNA, RNA, and morpholinos into various tissues, including the ...

Research

JoVE Journal

Biology

In Utero Intraventricular Injection and Electroporation of E15 Mouse Embryos

In Utero Intraventriculaire injectie en elektroporatie van de E15 muizenembryo&#39;s

In-utero in-vivo injection and electroporation of the embryonic mouse neocortex provides a powerful tool for the manipulation of individual progenitors ...

Electroporation of Mycobacteria

Elektroporatie van mycobacteriën

High efficiency transformation is a major limitation in the study of mycobacteria. The genus Mycobacterium can be difficult to transform; this is mainly ...

Gross and Fine Dissection of Inner Ear Sensory Epithelia in Adult Zebrafish (Danio rerio)

Gross and Fine Dissection of Inner Ear Sensory Epithelia in Adult Zebrafish Danio rerio

Grove en fijne Dissectie van binnenoor Sensory epitheel in Adult zebravis ( Danio rerio)

Neurosensory epithelia in the inner ear are the crucial structures for hearing and balance functions. Therefore, it is important to understand the ...

Primary Culture and Plasmid Electroporation of the Murine Organ of Corti. 

Primaire Cultuur en Plasmide Elektroporatie van de muizen orgaan van Corti.

In all mammals, the sensory epithelium for audition is located along the spiraling organ of Corti that resides within the conch shaped cochlea of the ...

Intraperitoneal Injection into Adult Zebrafish

Intraperitoneale injectie in de Adult zebravis

A convenient method for chemically treating zebrafish is to introduce the reagent into the tank water, where it will be taken up by the fish. However, ...

RNAi Interference by dsRNA Injection into Drosophila Embryos

RNAi Interference by dsRNA Injection into Drosophila Embryos

RNAi Interferentie door dsRNA Injectie in Drosophila Embryo&#39;s

Genetic screening is one of the most powerful methods available for gaining insights into complex biological process 1. Over the years many improvements ...

Electroporation of Craniofacial Mesenchyme

Elektroporatie van Craniofaciale Mesenchym

Electroporation is an efficient method of delivering DNA and other charged macromolecules into tissues at precise time points and in precise locations. ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

In vivo Elektroporatie van Morpholinos in de Adult zebravis Retina

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

In vivo Elektroporatie van Morpholinos in het regenereren van Adult Zebravissen Tail Fin

Certain species of urodeles and teleost fish can regenerate their tissues. Zebrafish have become a widely used model to study the spontaneous regeneration ...

Gene Transfer into Older Chicken Embryos by ex ovo Electroporation

Gene Transfer into Older Chicken Embryos by ex ovo Electroporation

Gentransfer in Oudere kippenembryo&#39;s door<em&gt; Ex ovo</em&gt; Elektroporatie

The chicken embryo provides an  excellent model system for studying gene function and regulation during  embryonic development. In ovo electroporation is ...