Name: direct delivery of mif morpholinos into the zebrafish otocyst by injection and electroporation affects inner ear development
Uploaded: 2011-01-07T18:00:00
Duration: 10 min 40 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Direct Delivery of MIF Morpholinos Into the Zebrafish Otocyst by Injection and Electroporation Affects Inner Ear Development at JoVE.com

Bu çalışma KFB için hibe Sağırlık Araştırma Vakfı Yc S ve NSF (IOS 0.930.096) tarafından desteklenmiştir. KFB: NIH / NINDCD 2 RO1 DC04184, <a href="https://commons.era.nih.gov/commons/genericStatus.do?actionRole=nonPI&amp;applID=7854446&amp;uhf-token=Ugf7JvudZTCbTUW9jSAR1snMUgg%3D">3R01DC004184 08W1</a> , NSF DBI 0.832.862, NSF IOS 0.930.096

1. Elektroporasyon için Elektrotlar yapma <ol><li> Kes uygun uzunluğu 75 mikron çaplı tungsten tel (AM Systems, Inc Carlsborg, WA) (yaklaşık 3-5 cm) </li><li> Molex kablo konektörü (pin damgalı pirinç) ile tungsten tel koyun </li><li> Sarın tungsten teller ve shrink boru (SPC Technology, Chicago, IL) ve Bunsen beki veya ısı tabancası ile daralan boru tel mühür ısı uygulamayın molex kablo konektörü </li><li> Tungsten tel ucu keskinleştirmek için, 1.0 N Sodyum hidroksit içine tel daldırma (Conrad ve ark 1993) ve diğer elektrot olarak bir ataş kullanarak, Kare Dalga Elektroporatör tel elektrolizi. Kullandığımız koşulları bakliyat arasında her biri 50 ms ile 100 ms 5 50 Volt bakliyat. Elektrotlar 15-20 mm çapa kadar bilenmiş olmalıdır </li><li> Elektroporasyon kullanmak için önce kil modelleme halinde preslenmiş oluklar içinde bir tepsi tel tutun </li></ol> 2. Elektroporasyon İstasyonu Kurma <ol><li> Teyp mikromanipülatörler (Dünya Hassas aletler) 75μm tungsten elektrot bilenmiş. </li><li> Diseksiyon mikroskobu aşamasında (Leica) her iki tarafında yerleştirin mikromanipülatörler. </li><li> Koru CUY-21 Düzenle Kare Dalga Elektroporatör (Şekil 1) elektrotlar bağlayın. </li><li> Elektroporatör açın ve elektroporasyon Parametreler, gerilim, darbe süresi ve bakliyat sayısı da dahil olmak üzere ayarlayabilirsiniz. Bu deneme için en etkili parametrelerin her biri Her darbe arasında 100ms ile, 5.0ms süren üç adet 13-volt bakliyat bulundu. Elektroporasyon embriyo hava kabarcıkları oluşturur, darbe süresini azaltır. </li></ol> 3. Zebra balığı Kulakla veziküllü içine Morpholinos Mikroenjeksiyon <ol><li> Hasat zebrafish embriyoların üreme tankından. Embriyolar embriyo-yükselterek ° C gecede 28.5 0.3 PPM metilen mavisi (Westerfield 2005) orta inkübe. </li><li> Sutter P-97 elektrot çektirmesi ile cam iğneler çekin </li><li> Bir agaroz jel tabanı (10 mm Petri kabında balık su içinde% 1 agaroz) - 37 ° C su banyosunda Isınma </li><li> Balık suda ısı% 1 düşük erime noktası agaroz (LMPA) kadar erimiş ve 37 ° C su banyosunda sıcak tutmak. </li><li> Bir morfolino çözüm (GeneTools, Corvallis, OR) ile doldurun ve bir bardak iğne ucu uygun çap kesmek. Bir iğne bir micromanipulator (Kuhn) üzerine monte edin. </li><li> Yaklaşık 10 mm iğne ucu kesin ve ucu morfolino çözüm yeterli teslim imkân vermesini sağlamak için madeni yağ içine enjekte edilir. </li><li> 24 saat postfertilization (hpf) embriyolar Dechorinate ve 0.3 PPM metilen mavisi balık su MS222 (tricaine Sigma) ile onları uyutmak. </li><li> Uygun üniforma analizi için sağ tarafında agaroz jel tabanı üzerine 3 ila 5 anestezi embriyolar hizalayın </li><li> Her embriyo üzerinde% 1 LMPA 1 ile 2 damla koyun ve izin yer embriyo düzeltmek için kuvvetlendirmek </li><li> Otik vezikül sağ tarafta böylece Petri çanağı </li><li> Otik vezikül lümen içine iğne yerleştirin ve bağlı bir nitrojen tankı (Şekil 2) ile morfolino çözüm PV820 Pnömatik PicoPump (Dünya Hassas Aletler) enjekte. </li></ol> 4. Elektroporasyon Prosedürü <ol><li> Hemen enjeksiyondan sonra elektroporasyon istasyona monte embriyolar Taşı </li><li> Otik vezikül sadece arka doku üzerine pozitif elektrot yerleştirin, fakat sadece otik vezikül ön beyin içine nüfuz etmez; negatif elektrot eklemek </li><li> Bir ayak pedalı veya bir anahtar basarak kullanarak uygulayın. </li><li> Agaroz balık su dökün ve dönen ve bir cam pipet ile agaroz embriyolar kaldırmak. Embriyoların zarar vermemek için dikkatli kullanın. Kaldırmak için zor olan embriyo, embriyonun çevresindeki herhangi bir LMPA hafifçe kurtulmak için bir iğne kullanın. </li><li> Embriyolar, metilen mavisi balık su ve analiz için istenen aşamaları (in situ hibridizasyon, etc ve mikroskopik anlaysis, immünohistokimyasal, morfolojik) embriyolar yükseltmek ile bir tabak koyun . </li></ol> 5. Temsilcisi Sonuçlar: <img src="/files/ftp_upload/2466/2466fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1 Elektroporasyon istasyonu. Elektrotlar bilenmiş 75μm Tungsten teller kullanılarak yapılan ve bir koruyun CUY-21 Kare Dalga Düzenle Elektroporatör yol açar bağlı idi. Bu elektrotlar mikromanipülatörler bantlanmış. <img src="/files/ftp_upload/2466/2466fig2.jpg" alt="Şekil 2" /> Şekil 2. Enjeksiyon istasyonu. Tüm embriyolar standardizasyon amaçlar için sağ kulak içine enjekte edildi. <img src="/files/ftp_upload/2466/2466fig3.jpg" alt="Şekil 3" /> Şekil 3 3 dpf&#39;e embriyolar aktin filamentler Phalloidin boyama. (A), 3 dpf&#39;e embriyo injected kontrolü MO ile arka makula (pm) Phalloidin güçlü boyama vardır. (B) kontrolü MO ile enjekte edilir ve sonra electroporated oldu embriyo enjeksiyon sadece embriyolarda am Phalloidin boyama benzer seviyelerde vardı. Elektroporasyon birlikte mif katille enjeksiyon pm (D) Phalloidin boyama dramatik bir azalmaya neden olmuştur (C) yalnız otik vezikül mif katille Enjeksiyon, Phalloidin boyama azaltılması neden yoktu. am anterior makula. <img src="/files/ftp_upload/2466/2466fig4.jpg" alt="Şekil 4" /> Şekil 4, 5 dpf larvaları ile aktin filamentler Phalloidin boyama . Enjeksiyon arasında hiçbir fark sadece (A) ve standart kontrolü morfolino (B) elektroporasyon enjeksiyon. Ancak, mif morpholinos ve electroporated enjekte edilen 5 dpf larvaları sadece mif morpholinos (C enjekte edildi embriyo ile karşılaştırıldığında arka makula (pm) (D) 3 dpf&#39;e daha olsa daha az dramatik Phalloidin boyama, azaltılmış gösterdi .) am anterior makula. <img src="/files/ftp_upload/2466/2466fig5.jpg" alt="Şekil 5" /> Şekil 5 embriyoların 3 dpf&#39;e Asetillendirilmiş tubulin boyama. (A) embriyo herhangi bir enjeksiyon veya elektroporasyon almadı. (B) embriyo electroporated ama hiçbir enjeksiyon aldı. Embriyolar mif morpholinos enjeksiyon ve elektroporasyon (C, D) Her iki alan kontrol grubu ile karşılaştırıldığında gözle görülür bir şekilde azaldı tubulin boyama vardı. (Pm, arka makula). <img src="/files/ftp_upload/2466/2466fig6.jpg" alt="Şekil 6" /> Şekil 6 kontrolü morfolino 3 dpf&#39;e embriyoların Asetillendirilmiş tubulin boyama. (A) herhangi bir tedavi olmadan Embriyo arka makula (pm) ve geniş innervasyon güçlü asetillenmiş tubulin boyama gösterdi. (B) Embriyo kontrolü morfolino ile enjekte edilir. (C) sadece elektroporasyon ile tedavi Embriyo. (D) enjekte edilir ve electroporated kontrolü morfolino Kontrol embriyo hiçbir tedavi kontrolü ile karşılaştırıldığında arka makula ve innervasyon asetillenmiş tubulin benzer seviyesi vardır.

<ol>
	<li>Conrad, G. W., Bee, J. A., Roche, S. M., Teillet, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+microscalpels+by+electrolysis+of+tungsten+wire+in+a+meniscus.">Fabrication of microscalpels by electrolysis of tungsten wire in a meniscus.</a> J Neurosci Methods. 50, 123-127 (1993).</li><li>Suzuki, M., Takamura, Y., Maeno, M., Tochinai, S., Iyaguchi, D., Tanaka, I., Nishihira, J., Ishibashi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenopus+laevis+macrophage+migration+inhibitory+factor+is+essential+for+axis+formation+and+neural+development.">Xenopus laevis macrophage migration inhibitory factor is essential for axis formation and neural development.</a> J Biol Chem. 279, 21406-21414 (2004).</li><li>Barald, K. F., Kelley, M. W., W, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+placode+to+polarization:+new+tunes+in+inner+ear+development.">From placode to polarization: new tunes in inner ear development.</a> Development. 131, 4119-4135 (2004).</li></ol>

Maddenin üretim, video ve metin belirtilen reaktifler üreten Gen Araçlar, LLC tarafından sponsor oldu.

Biz başarıyla 24 hpf zebrafish embriyonun kulak içine antisens oligonükleotid katille girmiştik. Enjeksiyon ve elektroporasyon sonra toplandı Embriyolar yaşayabilir. Embriyoların elektroporasyon kurtuldu, onlar hiçbir tedavi yanı sıra, sadece enjekte edilen ve sadece electroporated olmuştu embriyolar olmuştu embriyolarda almıştı embriyolar göre normal fiyatla büyüdü. Biz Phalloidin ve asetillenmiş tubulin ile etiketleme yoluyla kulak enjeksiyon ve elektroporasyon sonra mif ve mif gibi katille bir etki gözlenmemiştir. Posterior makula duyusal saç hücreleri aktin filamentler Phalloidin boyama saç hücresi ve / veya stereocilia numaraları sadece katille enjekte edildi embriyolar ile kıyaslandığında değişikliğe neden mif ve 24-hpf aşamada mif gibi MO bu elektroporasyon gösterir (Şekil 3). Bu azalma saç hücre sayıları Shen ve arkadaşlarının bulguları ile tutarlıdır. Katille mif ve mif gibi sakküler makula saç hücrelerinin sayısında bir azalmaya neden olduğu (gönderildi). Pratisyenler ve electroporated enjekte edildi embriyolar, bu elektroporasyon göstermek saç hücre sayıları azalmaya ve böylece otik vezikül sadece enjekte edildiği embriyoların karşılaştırıldığında morfolojik etkileri ölçüde artırarak, hücre zarından katille hareketli yardımcı olabilir. Asetillenmiş tubulin boyama yoluyla statoacoustic ganglion morfolojisi değişiklikler gözlenmiştir. Enjekte gösterisi neurites (Şekil 5) dallanma azalma electroporated embriyolar olarak statoacoustic ganglion innervasyon ölçüde etkilendi. Asetillenmiş tubulin boyama embriyolarda enjekte ve electroporated her ikisi de önemli ölçüde azalmış olması nedeniyle de, ganglion hücreleri ve / veya ganglion hücrelerinin sayısı azalmış yoğuşma vardır azalma olabilir. Mif, sinir sistemi gelişimi (Suzuki ve ark, 2004) için kritik olduğu gösterilmiştir Çünkü, mif ve mif gibi neuroblast hücrelerin içine MO çözüm. Artış transfeksiyon elektroporasyon sonra görülen değişiklikler sonucu olabilir Doğrudan gelişmekte olan bir doku içine antisens oligo morpholinos Elektroporasyon embriyo doku gelişimi sırasında, hem de mekansal ve zamansal bir gen ifadesini kontrol etmek için yararlı bir araçtır. Mif ve benzeri iç kulak dokularına katille mif Elektroporasyon arka makula ve statoacoustic ganglion anormal morfoloji sonuçlandı. Embriyolar ile karşılaştırıldığında, ya sadece enjekte edilmiş ya da sadece electroporated embriyolarda ya da hiç tedavi almıştı enjekte electroporated olmuştu embriyolar arka makula duyusal saç hücrelerinin sayısında bir azalma vardı. Statoacoustic ganglion ve SAG boyutunu arka duyusal yama innervasyon derecesi bir azalma vardı. Elektroporasyon istenen dokuya, özellikle DNA, RNA, yada MO birincil etkilerinin gözlenmesi ve diğer dokular üzerindeki ikincil etkileri bu ayrımcı, beyin, nöral krest ve yararı, belirli dokulara makromoleküllerin transfecting için değerli bir yöntem iç kulak geliştirme periotic mezenşimin (Barald ve Kelley, 2004).

<ol><li> Pratisyenler: 0.3 mM, mif, mif gibi MO1 için bir kombinasyonu ve mif gibi MO2 kullanılmıştır. 5&#39;-acatcggcatgactgcgacagagat 3 &#39;mif MO zebrafish mif mRNA&#39;nın başlangıç ​​kodon ücretsiz. Iki katille mif gibi gibi MO1 mif translasyonel başlangıç ​​sitesine ücretsiz: gibi-MO2 mif intron1/exon 2 sınırında ise sırası AS türetilmiş, 5&#39;-GTTTCTATATTTATGAACGGCATGA-3 &#39;: 5&#39;-GATTCATCCTCTGAAGACGTAAGCC &#39;-3. 5&#39;-CCTCTTACCTCAGTTACAATTTATA-3 &#39;Gen Kontrol MO Araçlar şifreli nükleotid dizisi oldu. </li><li> balık suyu metilen mavisi (0.3 ppm) </li><li> MS222 (tricaine, Sigma, balık su içinde 0.64 mM) </li><li> Düşük erime noktası agaroz (LMPA; Roche) </li><li> fenol kırmızısı (Sigma) </li><li> Anti-asetillenmiş tubulin (Sigma) </li><li> Alexa Fluor ® 488 keçi anti-fare ikinci antikor (Moleküler probları) </li><li> Texas kırmızı Phalloidin (Moleküler probları) </li></ol>

direct delivery of mif morpholinos into the zebrafish otocyst by injection and electroporation affects inner ear development

Son yıllarda, elektroporasyon, göz, beyin, ve zebrafish, hücre grubu da dahil olmak üzere çeşitli dokular, içine, DNA, RNA ve morpholinos in vivo transfeksiyon için popüler bir yöntem haline gelmiştir . Elektroporasyon genetik manipülasyon diğer yöntemlere göre avantajı belirli dokuları, elektrik akımı uygulanması makromoleküllerin tanıtımı için, hem mekansal ve zamansal olarak, hedefli olabilir ki. Burada mif zebrafish gelişmekte olan iç kulağın dokularına ve mif gibi morpholinos transfecting elektroporasyon kullanımı açıklanmaktadır. Geçmiş çalışmalarda, mif morfolino 1 embriyolar içine enjekte - 8-hücreli aşamaya yaygın morfolojik değişikliklerin yanı sıra, sinir sistemi ve göz kulak sonuçlandı. Geliştirme sonraki aşamada iç kulak dokuları belirleyerek, diğer dokulara etkisi sonucu ikincil etkileri aksine, gelişmekte olan iç kulak MIF birincil etkileri belirleyebilirsiniz. Nöronlar, nöronal süreçleri ve arka makula ile ilişkili saç hücrelerinin morfolojisini incelemek için boyama Phalloidin ve asetillenmiş tubulin kullanarak, zebrafish iç kulak hedeflenen transfeksiyon için bir yöntem olarak elektroporasyon etkinliğini değerlendirmek mümkün. 24hpf embriyoların otik vezikül morpholinos ve electroporated enjekte edildi ve daha sonra hiçbir tedavi almış veya sadece enjekte veya electroporated olmuştu embriyoların karşılaştırıldı. Enjekte ve electroporated Embriyolar, saç hücre sayıları bir azalma olduğunu gösterdi statoacoustic ganglion (SAG) ve kontrol grupları ile karşılaştırıldığında daha az SAG nöronlar tarafından innervasyon azaldı. Sonuçları, daha sonraki aşamada otocysts içine morpholinos doğrudan teslim non-spesifik bir sinir sistemi ve nöral krest etkileri 1-8 hücre aşamasında teslim morpholinos önler olduğunu gösterdi. Ayrıca, iç kulak ve beyin, nöral krest veya periotic mezenşimin birincil etkileri kulak değil ikincil etkileri yönlendirilir etkilerinin incelenmesi.

Watch this Scientific Journal Video about Direct Delivery of MIF Morpholinos Into the Zebrafish Otocyst by Injection and Electroporation Affects Inner Ear Development at JoVE.com

Direct Delivery of MIF Morpholinos Into the Zebrafish Otocyst by Injection and Electroporation Affects Inner Ear Development

24hpf zebrafish otocyst doğrudan morpholinos sunmak için bir yöntem geliştirilmiştir. Otik vezikül ve penetrasyon etkisi elektroporasyon lümenine morpholinos, mikroenjeksiyon, morpholinos beyin üzerinde etkisi atlayacak ve iç kulak özgü efektler elde etmek mümkün.

Enjeksiyon ve Elektroporasyon Zebra balığı Otocyst içine MIF Morpholinos Stoktan teslim İç Kulak Geliştirme etkiler

In recent years, electroporation has become a popular technique for in vivo transfection of DNA, RNA, and morpholinos into various tissues, including the ...

Research

JoVE Journal

Biology

In Utero Intraventricular Injection and Electroporation of E15 Mouse Embryos

E15 Fare Embriyolar Utero İntraventriküler Enjeksiyon ve Elektroporasyon

In-utero in-vivo injection and electroporation of the embryonic mouse neocortex provides a powerful tool for the manipulation of individual progenitors ...

Electroporation of Mycobacteria

Mikobakteriler, Elektroporasyon

High efficiency transformation is a major limitation in the study of mycobacteria. The genus Mycobacterium can be difficult to transform; this is mainly ...

Gross and Fine Dissection of Inner Ear Sensory Epithelia in Adult Zebrafish (Danio rerio)

Gross and Fine Dissection of Inner Ear Sensory Epithelia in Adult Zebrafish Danio rerio

Yetişkin Zebra balığı İç Kulak Duyu Epiteli Brüt ve Güzel Diseksiyon ( Danio rerio)

Neurosensory epithelia in the inner ear are the crucial structures for hearing and balance functions. Therefore, it is important to understand the ...

Primary Culture and Plasmid Electroporation of the Murine Organ of Corti. 

İlköğretim Kültür ve Corti murin Organ Plazmid Elektroporasyon.

In all mammals, the sensory epithelium for audition is located along the spiraling organ of Corti that resides within the conch shaped cochlea of the ...

Intraperitoneal Injection into Adult Zebrafish

Yetişkin Zebra balığı içine intraperitoneal enjeksiyon

A convenient method for chemically treating zebrafish is to introduce the reagent into the tank water, where it will be taken up by the fish. However, ...

RNAi Interference by dsRNA Injection into Drosophila Embryos

RNAi Interference by dsRNA Injection into Drosophila Embryos

DsRNA Enjeksiyon RNAi Girişim içine Drosophila Embriyolar

Genetic screening is one of the most powerful methods available for gaining insights into complex biological process 1. Over the years many improvements ...

Electroporation of Craniofacial Mesenchyme

Kraniofasial mezenşimin, Elektroporasyon

Electroporation is an efficient method of delivering DNA and other charged macromolecules into tissues at precise time points and in precise locations. ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

Morpholinos in vivo Elektroporasyon Yetişkin Zebra balığı Retina

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

Yenileyici Yetişkin Zebra balığı Tail Fin içine Morpholinos in vivo olarak Elektroporasyon

Certain species of urodeles and teleost fish can regenerate their tissues. Zebrafish have become a widely used model to study the spontaneous regeneration ...

Gene Transfer into Older Chicken Embryos by ex ovo Electroporation

Gene Transfer into Older Chicken Embryos by ex ovo Electroporation

Tarafından Eski Tavuk Embriyolar içine Gen Transferi<em&gt; Ex ovo</em&gt; Elektroporasyon

The chicken embryo provides an  excellent model system for studying gene function and regulation during  embryonic development. In ovo electroporation is ...