Name: localizing protein in 3d neural stem cell culture: a hybrid visualization methodology
Uploaded: 2010-12-19T18:00:00
Duration: 21 min 47 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Localizing Protein in 3D Neural Stem Cell Culture: a Hybrid Visualization Methodology at JoVE.com

نشكر ايفان دسرت] ومارك ليونارد للحصول على المساعدة من الخبراء التقنيين في مجال إنتاج الفيديو وتحريرها ، ومات كوك للحصول على المساعدة في جمع البيانات ، وسارة Gelbard للمساعدة التحرير الخبراء. وقد تم تمويل العمل من المنح التي تعمل من المعهد الكندي للبحوث الصحية (CIHR ، MOP 62626) لSALB ، وهي مبادرة للتدريب في مجال البحوث الاستراتيجية الصحية لبرنامج المنح وSALB SF (CIHR برنامج التدريب في Lipidomics الاعصاب ، TGF 9121) ، والبنية التحتية بدعم من مؤسسة الابتكار وأونتاريو الكندية الاستئماني الابتكار لسادس. تلقت منحة دراسية عليا SI أونتاريو في مجال العلوم والتكنولوجيا بمساهمات من اتحاد البحوث باركنسون. NV يتلقى معهد الشيخوخة وCIHR برنامج التدريب في Lipidomics الاعصاب بعد الزمالة المهنية. نحن نعترف بامتنان دعم البرامج التعليمية والتقنية التي تقدمها أبحاث أوتوديسك.

<ol>
	<li>Kempermann, G., Jessberger, S., Steiner, B., Kronenberg, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Milestones+of+neuronal+development+in+the+adult+hippocampus.">Milestones of neuronal development in the adult hippocampus.</a> Trends Neurosci. 27, 447-452 (2004).</li><li>Campos, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurospheres:+insights+into+neural+stem+cell+biology.">Neurospheres: insights into neural stem cell biology.</a> J Neurosci Res. 78, 761-769 (2004).</li><li>Imbeault, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+extracellular+matrix+controls+gap+junction+protein+expression+and+function+in+postnatal+hippocampal+neural+progenitor+cells.">The extracellular matrix controls gap junction protein expression and function in postnatal hippocampal neural progenitor cells.</a> BMC Neurosci. 10, 13-13 (2009).</li></ol>

أجريت جميع التجارب على الحيوانات وفقا للمبادئ التوجيهية واللوائح التي وضعتها جامعة أوتاوا جنة رعاية الحيوان والمجلس الكندي للرعاية الحيوان.

يصف هذا البروتوكول إجراء للثقافة ومتسلسل cryosection بعد الولادة الشخصيات الحصين وتوطين التعبير بواسطة بروتين مناعي ، وأخيرا إعادة بناء وتحليل الموقف الطوبوغرافية للخلايا داخل immunopositive neurosphere في 3D بأكمله. عن طريق الجمع بين الخلية والبيولوجيا ثقافة تقنيات المعالجة ، والتصوير المجهري (OpenLab ، الإرتجال وغيرها من برامج تحليل الصور) ، أو رسم برامج تحرير قدرات (أدوبي فوتوشوب) ، والرسوم المتحركة وقدرات 3D compositing البرمجيات (أوتوديسك مايا) ، ونحن تقديم منهجية لإعادة بناء الخليوي تكوين الثقافات كلها من الصور 3D 2D المسلسل السماح لاعادة اعمار لموقف المؤمنين الخلوية وبروتين تعبير في جميع أنحاء ثقافة neurosphere. ويمكن الجمع بين هذا البروتوكول مع فعالية مساوية للتسجيل وإعادة بناء أجزاء المسلسل epifluorescent رقيقة أو مبائر مداخن Z - سمكا من خلال المقاطع التسلسلي. لأن التوسع النسيلي من الشخصيات واحد في الثقافة neurosphere يلخص العديد من مراحل لوحظ على مدى تكوين الخلايا العصبية وgliogenesis في مرحلة ما بعد الولادة في الدماغ ، وتأثير هيكلها 3D يمثل مصير مجلس الشعب محددا هاما في ذرية يتعرضون لنفس الوسط التجريبية 1. الاختلاف في نسب البروتين والتعبير في القلب والمحيط الخارجي للأقسام neurosphere المسلسل يوحي بأن العوامل المادية متعددة بما في ذلك موقف الخلية ، والإجهاد الميكانيكية ، وقوة القص تلعب أدوارا هامة في تنظيم المجلس الوطنى البيولوجيا 2. علاوة على ذلك ، وقد تبين connexin تعبير البروتين ، وتحليلها هنا ، لتغيير تبعا عند المثقف والشخصيات neurospheres 3D في تعليق أو مطلية على ركيزة laminin الاتصالات مع connexin بوساطة تغيير وظيفي سواء مثقف الخلايا على البلاستيك وركيزة أو في 3D مجانا العائمة الثقافات 3. أثر موقف الخليوي في مصير المجلس الوطنى لا يزال غير واضح. فمن الصعب فنيا لتحليل تأثير الموقع المكاني داخل الثقافة 3D على الأحياء نظرا إلى أن المجلس الوطنى لتقييم مستضدي الانساب والبروتينات يتطلب إشارات اختلال البنية 3D لتمكين permeabilization الخلية والوصول إلى جميع خلايا الجسم المضاد. هنا ، وتبين لنا أن منهجية التصور الهجين يوفر وسيلة لتحديد ما إذا كان يحمل بروتينات معينة تعريب الموضعية فريدة من نوعها في الثقافة 3D ، يمكن استخدامها لاستنتاج واختبار وظيفة البروتين والتنظيم فيما يتعلق توطين الإقليمية داخل neurosphere ، وربما الأهم من ذلك ويوفر البيانات اللازمة لالموضعية دراسة تأثير التضاريس وتحديد المواقع 3D الخليوي في مجلس الشعب في مصير الثقافة 3D.

* جميع الكواشف الكيماوية القياسية الأخرى المدرجة في البروتوكول هي من سيغما الدريخ. سائر زراعة الأنسجة القياسية هي من الكواشف Invitrogen.

localizing protein in 3d neural stem cell culture: a hybrid visualization methodology

أهمية الطوبوغرافيا (3D) 3 الابعاد في التأثير على الخلايا الجذعية العصبية والسلف (مجلس الشعب) هو النمط الظاهري على نطاق واسع حتى الآن اعترف تحديا للدراسة. عندما ينفصل عن المخ الجنينية أو بعد الولادة ، واحد الشخصيات تتكاثر في تعليق لتشكيل neurospheres. الخلايا الوليدة داخل هذه الثقافات اعتماد عفويا الأنساب تنموية متميزة (الخلايا العصبية ، oligodendrocytes ، والنجمية) على مدى التوسع على الرغم من أن تتعرض لنفس الوسط خارج الخلية. يلخص هذا التطور لاحظ العديد من المراحل على مدى تكوين الخلايا العصبية وgliogenesis في مرحلة ما بعد الولادة الدماغ وغالبا ما تستخدم لدراسة البيولوجيا الأساسية للمجلس الوطنى ضمن بيئة تسيطر عليها. تقييم الأثر الكامل للتضاريس 3D وتحديد المواقع الخلوية داخل هذه الثقافات على مصير مجلس الشعب ، على أية حال ، من الصعب. في توطين البروتينات المستهدفة وتحديد الأنساب مجلس الشعب التي كيمياء سيتولوجية مناعية ، يجب أن يكون مطلي التعويم الحر neurospheres على ركيزة مقطوع أو متسلسل. هذا أمر مطلوب لضمان تجهيز يعادل permeabilization الخلية وصول الأجسام المضادة في جميع أنحاء المجال. ونتيجة لذلك ، يمكن للصور epifluorescent 2D أو إعادة البناء من cryosections مبائر من مداخن 3D - Z سوى تقديم المعلومات المكانية عن موقف شرائح منفصلة داخل الخلية الجسدية أو 3D الرقمية ولا تصور الموقف الخلوية في المجال سليمة. هنا ، أن أؤكد مجددا على تضاريس الثقافة neurosphere والسماح التحليل المكاني للتعبير البروتين في جميع أنحاء ثقافة بأكملها ، نقدم بروتوكول للعزلة ، والتوسع ، وsectioning المسلسل في مرحلة ما بعد الولادة neurospheres الحصين مناسبة للمناعي epifluorescent مبائر أو البروتينات الهدف. ويتم تحليل Connexin29 (Cx29) كمثال على ذلك. المقبل ، وذلك باستخدام مزيج من تحرير الرسم والنمذجة 3D برامج التطبيق الصارم للحفاظ على التفاصيل البيولوجية ، ونحن تصف كيفية إعادة تجميع المواقع 3D الهيكلية لهذه الصور والخرائط رقميا الخلايا المسمى داخل neurosphere كاملة. هذه المنهجية يمكن تصور وتحليل للموقف من البروتينات الخلوية والخلايا المستهدفة في جميع أنحاء 3D التضاريس ثقافة بأكملها ، وسوف يسهل تحليل أكثر تفصيلا للالعلاقات المكانية بين الخلايا على مدى تكوين الخلايا العصبية وgliogenesis في المختبر. وساهم كل من Imbeault فالنزويلا على قدم المساواة وينبغي النظر في الكتاب المشترك الأول.

Watch this Scientific Journal Video about Localizing Protein in 3D Neural Stem Cell Culture: a Hybrid Visualization Methodology at JoVE.com

Localizing Protein in 3D Neural Stem Cell Culture: a Hybrid Visualization Methodology

هنا ، نحن تصف كيفية إنتاج ، وتوسيع ، وبعدها immunolabel الحصين الخلايا العصبية السلف (الشخصيات) في الثقافة (3D) ثلاثي الأبعاد. المقبل ، وذلك باستخدام تقنيات التصور الهجين ، علينا أن نظهر كيف يمكن استخدام الصور الرقمية من cryosections immunolabelled لإعادة بناء ورسم خريطة للموقف المكاني للخلايا في جميع أنحاء immunopositive neurosphere 3D بأكمله.

إضفاء الطابع المحلي على البروتين في 3D الجذعية العصبية خلية الثقافة : منهجية التصور الهجين

The importance of 3-dimensional (3D) topography in influencing neural stem and progenitor cell (NPC) phenotype is widely acknowledged yet challenging to ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

تشريح والثقافة من الخلايا العصبية من النخاع الشوكي صواري الجنينية

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Growth and Differentiation of Adult Hippocampal Arctic Ground Squirrel Neural Stem Cells

نمو وتمايز الخلايا القطب الشمالي الأرضي الكبار السنجاب الجذعية العصبية الحصين

Arctic ground squirrels (Urocitellus parryii, AGS) are unique in their ability to hibernate with a core body temperature near or below freezing 1. These ...

Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay

تأسيس الخلايا الجذعية الجنينية الماوس العصبية الثقافة باستخدام الفحص Neurosphere

In mammalians, stem cells acts as a source of undifferentiated cells to maintain cell genesis and renewal in different tissues and organs during the life ...

Neural-Colony Forming Cell Assay: An Assay To Discriminate Bona Fide Neural Stem Cells from Neural Progenitor Cells

العصبية تشكيل مستعمرة الفحص الخلوي : إن الفحص تميز بحسن نية الخلايا الجذعية العصبية من الخلايا العصبية السلف

The neurosphere assay (NSA) is one of the most frequently used methods to isolate, expand and also calculate the frequency of neural stem cells (NSCs). ...

Isolation and Culture of Neural Crest Stem Cells from Human Hair Follicles

العزلة وثقافة العصبية الخلايا الجذعية من بصيلات الشعر كريست الإنسان

Hair follicles undergo lifelong growth and hair cycle is a well-controlled process involving stem cell proliferation and quiescence. Hair bulge is a ...

The Neuroblast Assay: An Assay for the Generation and Enrichment of Neuronal Progenitor Cells from Differentiating Neural Stem Cell Progeny Using Flow Cytometry

الفحص Neuroblast: والفحص للانشاء وإثراء خلايا متعلق بالخلايا العصبية السلف من التفريق العصبية الجذعية آله الخلية باستخدام التدفق الخلوي

Neural stem cells (NSCs) can be isolated and expanded in large-scale, using the neurosphere assay and differentiated into the three major cell types of ...

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

العزلة والثقافة من الخلايا العصبية كريست من الأنبوبة العصبية الجنينية الفئران

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

Enumeration of Neural Stem Cells Using Clonal Assays

تعداد الخلايا الجذعية العصبية باستخدام نسيلي فحوصات

Neural stem cells (NSCs) have the ability to self-renew and generate the three major neural lineages &#8212; astrocytes, neurons and oligodendrocytes. ...

Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Mouse Subcallosal Zone

العزلة والثقافة من الخلايا الجذعية البالغة العصبية من المنطقة تحت الثفني ماوس

Adult neural stem cells (aNSCs) can be used for the regeneration of damaged brain tissue. NSCs have the potential for differentiation and proliferation ...

Development of a Refined Protocol for Trans-scleral Subretinal Transplantation of Human Retinal Pigment Epithelial Cells into Rat Eyes

وضع البروتوكول المكرر لزرع الخلايا الظهارية الصبغية الشبكية البشرية ترانس-سكليرال سوبريتينال في عيون الفئران

Degenerative retinal diseases such as age-related macular degeneration (AMD) are the leading cause of irreversible vision loss worldwide. AMD is ...