Name: localizing protein in 3d neural stem cell culture: a hybrid visualization methodology
Uploaded: 2010-12-19T18:00:00
Duration: 21 min 47 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Localizing Protein in 3D Neural Stem Cell Culture: a Hybrid Visualization Methodology at JoVE.com

Wij danken Evan Dysart en Marc Leonard voor deskundige technische bijstand in video-productie en redactie, Matt Cooke voor hulp bij het verzamelen van gegevens, en Sarah Gelbard voor deskundige redactionele hulp. Het werk werd gefinancierd door exploitatiesubsidies van het Canadese Institute of Health Research (CIHR, MOP 62626) om SALB, een strategisch opleidingsbeleid initiatief in Health Research programma te verlenen aan SALB en SF (CIHR Training Program in Neurodegeneratieve Lipidomics, TGF 9.121), en infrastructuur steun van de Canadese Stichting Innovatie en Ontario innovatie Trust SF. SI ontvangen een Ontario Graduate Scholarship in wetenschap en technologie met bijdragen van de Parkinson Research Consortium. NV ontvangt een Institute of Aging en CIHR Training Program in Neurodegeneratieve Lipidomics post-professionele gemeenschap. Wij dankbaar erkennen de educatieve software en technische ondersteuning door AutoDesk Research.

<ol>
	<li>Kempermann, G., Jessberger, S., Steiner, B., Kronenberg, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Milestones+of+neuronal+development+in+the+adult+hippocampus.">Milestones of neuronal development in the adult hippocampus.</a> Trends Neurosci. 27, 447-452 (2004).</li><li>Campos, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurospheres:+insights+into+neural+stem+cell+biology.">Neurospheres: insights into neural stem cell biology.</a> J Neurosci Res. 78, 761-769 (2004).</li><li>Imbeault, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+extracellular+matrix+controls+gap+junction+protein+expression+and+function+in+postnatal+hippocampal+neural+progenitor+cells.">The extracellular matrix controls gap junction protein expression and function in postnatal hippocampal neural progenitor cells.</a> BMC Neurosci. 10, 13-13 (2009).</li></ol>

Alle experimenten op dieren werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen en voorschriften uiteengezet door de Universiteit van Ottawa Animal Care Comite en de Canadese Raad voor Dierenaangelegenheden Care set.

Dit protocol beschrijft een procedure om cultuur en serieel cryosection postnatale hippocampus NPCs, lokaliseren eiwit-expressie door immunodetectie, en tenslotte te reconstrueren en analyseren van de topografische positie van immunopositive cellen in de hele 3D-neurosphere. Door de combinatie van celbiologie cultuur en verwerkingstechnieken, microscopie beeldvorming (Openlab, Improvisatie en andere beeldanalyse software), grafische editing software capaciteiten (Adobe Photoshop), en 3D-animatie en compositing software capaciteiten (Autodesk Maya), presenteren we een methodiek om de te reconstrueren gehele cellulaire samenstelling van de 3D-culturen uit serie 2D beelden waardoor de getrouwe reconstructie van cellulaire functie en eiwit expressie gedurende een neurosphere cultuur. Dit protocol kan gecombineerd worden met gelijk doeltreffendheid om de registratie en de wederopbouw van epifluorescerende dunne seriële secties of confocale Z-stacks door dikkere seriële secties. Omdat de klonale expansie van enkele NPC&#39;s in neurosphere cultuur recapituleert veel van de podia die gedurende de loop van de neurogenese en gliogenesis in post-natale hersenen, de impact van zijn 3D-structuur is een belangrijke NPC lot determinant in het nageslacht blootgesteld aan dezelfde experimentele milieu 1. Divergentie in afkomst en proteïne-expressie in de kern en de periferie van de seriële neurosphere secties suggereert dat meerdere fysieke factoren, waaronder de cel positie, mechanische stress, en dwarskracht een belangrijke rol spelen in het reguleren van NPC biologie 2. Bovendien heeft connexine eiwit expressie, geanalyseerd hier, is aangetoond dat ze veranderen afhankelijk van wanneer NPC&#39;s worden gekweekt als 3D neurospheres in suspensie of uitgeplaat op een laminine substraat met functionele connexine-gemedieerde communicatie veranderde of cellen worden gekweekt op plastic en substraat of in 3D gratis -drijvende culturen 3. De impact van cellulaire positie op NPC lot blijft onduidelijk. Het is technisch een uitdaging om de impact van de ruimtelijke locatie te analyseren binnen de 3D-cultuur op de NPC biologie gezien het feit dat antigene beoordeling van de afstamming en signaaleiwitten vereist verstoring van de 3D-architectuur in staat te stellen cel permeabilisatie en antilichaam toegang tot alle cellen. Hier laten we zien dat een hybride visualisatie methodiek een middel om te bepalen of bepaalde eiwitten unieke positie lokalisaties tentoonstelling in 3D cultuur biedt, kan worden afgeleid en eiwit functie en regulatie test met betrekking tot de regionale lokalisatie binnen de neurosphere, en, misschien wel het allerbelangrijkste , biedt de positionele gegevens die nodig zijn om de impact van 3D topografie en cellulaire positionering op NPC lot in 3D cultuur te bestuderen.

* Alle andere standaard chemische reagentia die in het protocol zijn van Sigma-Aldrich. Alle andere standaard weefselkweek reagentia zijn van Invitrogen.

localizing protein in 3d neural stem cell culture: a hybrid visualization methodology

Het belang van 3-dimensionale (3D) topografie in het beïnvloeden van neurale stamcellen en voorlopercellen cel (NPC) fenotype is algemeen bekend toch uitdagend om te studeren. Bij het los van embryonale of postnatale brein, zal enkele NPC&#39;s verspreiden in suspensie te neurospheres te vormen. Dochter cellen binnen deze culturen spontaan vast te stellen verschillende ontwikkelings lineages (neuronen, oligodendrocyten en astrocyten) in de loop van de uitbreiding ondanks het feit dat bloot aan dezelfde extracellulaire milieu. Deze progressie recapituleert veel van de podia die gedurende de loop van de neurogenese en gliogenesis in post-natale hersenen en wordt vaak gebruikt om elementaire NPC biologie studeren binnen een gecontroleerde omgeving. Het beoordelen van de volledige impact van 3D topografie en cellulaire positionering binnen deze culturen op NPC lot is echter moeilijk. Te lokaliseren doelwit eiwitten en NPC lijnen door middel van immunocytochemie te identificeren, moet vrij zwevende neurospheres worden uitgeplaat op een substraat of serie coupes. Deze verwerking is nodig om gelijkwaardige cel permeabilisatie en antistoffen in het hele gebied te garanderen. Als gevolg hiervan kan 2D epifluorescerende beelden van vriescoupes of confocale reconstructies van 3D Z-stacks alleen ruimtelijke informatie over de cel positie in discrete fysieke of digitale 3D-plakken en niet te visualiseren cellulaire positie in het intacte sfeer. Hier, aan de topografie van het neurosphere cultuur herhalen en laten ruimtelijke analyse van proteïne-expressie in de hele cultuur, presenteren we een protocol voor isolatie, uitbreiding, en seriële snijden van post-natale hippocampus neurospheres geschikt voor epifluorescerende of confocale immunodetectie van target eiwitten. Connexin29 (Cx29) is geanalyseerd als een voorbeeld. Vervolgens met een hybride van grafische bewerking en 3D-modeling software streng toegepast op biologisch detail te behouden, beschrijven we hoe de 3D-structurele positionering van deze beelden opnieuw te monteren en digitaal kaart gelabelde cellen binnen de gehele neurosphere. Deze methodologie maakt visualisatie en analyse van de cellulaire positie van target eiwitten en cellen in het gehele 3D-cultuur topografie en vergemakkelijkt een meer gedetailleerde analyse van de ruimtelijke relaties tussen de cellen in de loop van neurogenese en gliogenesis in vitro. Zowel Imbeault en Valenzuela droegen gelijk en moeten worden beschouwd joint eerste auteurs.

Watch this Scientific Journal Video about Localizing Protein in 3D Neural Stem Cell Culture: a Hybrid Visualization Methodology at JoVE.com

Localizing Protein in 3D Neural Stem Cell Culture: a Hybrid Visualization Methodology

Hier beschrijven we hoe te produceren, uit te breiden, en immunolabel postnatale hippocampus neurale progenitor cellen (NPC&#39;s) in drie-dimensionale (3D) cultuur. Vervolgens met behulp van hybride visualisatie technieken, laten we zien hoe digitale beelden van immunolabelled vriescoupes kunnen worden gebruikt om te reconstrueren en in kaart van de ruimtelijke positie van immunopositive cellen in het gehele 3D-neurosphere.

Het lokaliseren van Eiwit in 3D Neural Stem Cell Culture: een hybride Visualisatie Methodologie

The importance of 3-dimensional (3D) topography in influencing neural stem and progenitor cell (NPC) phenotype is widely acknowledged yet challenging to ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Dissectie en Cultuur van Commissural neuronen van het ruggenmerg Embryonic

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Growth and Differentiation of Adult Hippocampal Arctic Ground Squirrel Neural Stem Cells

Groei en differentiatie van volwassen hippocampus Arctic grondeekhoorn neurale stamcellen

Arctic ground squirrels (Urocitellus parryii, AGS) are unique in their ability to hibernate with a core body temperature near or below freezing 1. These ...

Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay

Tot vaststelling van Embryonale Mouse Neural Stem Cell Culture Met behulp van de Neurosphere Assay

In mammalians, stem cells acts as a source of undifferentiated cells to maintain cell genesis and renewal in different tissues and organs during the life ...

Neural-Colony Forming Cell Assay: An Assay To Discriminate Bona Fide Neural Stem Cells from Neural Progenitor Cells

Neurale-Colony Forming Cell-test: Een test om Bona Fide neurale stamcellen van Neural Progenitor Cellen Discrimineer

The neurosphere assay (NSA) is one of the most frequently used methods to isolate, expand and also calculate the frequency of neural stem cells (NSCs). ...

Isolation and Culture of Neural Crest Stem Cells from Human Hair Follicles

Isolatie en Cultuur van neurale stamcellen uit menselijke haarzakjes

Hair follicles undergo lifelong growth and hair cycle is a well-controlled process involving stem cell proliferation and quiescence. Hair bulge is a ...

The Neuroblast Assay: An Assay for the Generation and Enrichment of Neuronal Progenitor Cells from Differentiating Neural Stem Cell Progeny Using Flow Cytometry

De Neuroblast test: een test voor de generatie en de verrijking van Neuronale stamcellen uit Onderscheidende factor voor neurale stamcellen Nakomelingen met behulp van flowcytometrie

Neural stem cells (NSCs) can be isolated and expanded in large-scale, using the neurosphere assay and differentiated into the three major cell types of ...

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

Isolatie en Cultuur van neurale lijst cellen van embryonale Murine Neural Tube

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

Enumeration of Neural Stem Cells Using Clonal Assays

Opsomming van neurale stamcellen Met behulp van klonen Testen

Neural stem cells (NSCs) have the ability to self-renew and generate the three major neural lineages &#8212; astrocytes, neurons and oligodendrocytes. ...

Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Mouse Subcallosal Zone

Isolatie en cultuur van de volwassen neurale stamcellen van de muis Subcallosal Zone

Adult neural stem cells (aNSCs) can be used for the regeneration of damaged brain tissue. NSCs have the potential for differentiation and proliferation ...

Development of a Refined Protocol for Trans-scleral Subretinal Transplantation of Human Retinal Pigment Epithelial Cells into Rat Eyes

Ontwikkeling van een verfijnde Protocol voor Trans-scleral Subretinal transplantatie van menselijke retinale Pigment epitheliale cellen in de ogen van de Rat

Degenerative retinal diseases such as age-related macular degeneration (AMD) are the leading cause of irreversible vision loss worldwide. AMD is ...