Name: localizing protein in 3d neural stem cell culture: a hybrid visualization methodology
Uploaded: 2010-12-19T18:00:00
Duration: 21 min 47 s
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Wir danken Evan Dysart und Marc Léonard für technische Unterstützung durch Experten in der Videoproduktion und-bearbeitung, Matt Cooke für die Unterstützung bei der Datenerhebung und Sarah Gelbard für Experten redaktionelle Unterstützung. Die Arbeit wurde durch Betriebskostenzuschüsse von der Canadian Institute of Health Research (CIHR, MOP 62626) zu SALB, eine strategische Training Initiative in Health Research Programm zu gewähren SALB und SF (CIHR Training Program in Neurodegenerative Lipidomics, TGF 9121), und die Infrastruktur finanziert Unterstützung von der kanadischen Stiftung Innovation und Ontario Innovation Trust SF. SI erhielt Ontario Graduate Scholarship in Wissenschaft und Technologie mit Beiträgen der Parkinson Research Consortium. NV erhält Institute of Aging und CIHR Training Program in Neurodegenerative Lipidomics post-professionellen Gemeinschaft. Wir danken für die Bildungs-Software und technischen Support durch Autodesk Forschung zur Verfügung gestellt.

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	<li>Kempermann, G., Jessberger, S., Steiner, B., Kronenberg, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Milestones+of+neuronal+development+in+the+adult+hippocampus.">Milestones of neuronal development in the adult hippocampus.</a> Trends Neurosci. 27, 447-452 (2004).</li><li>Campos, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurospheres:+insights+into+neural+stem+cell+biology.">Neurospheres: insights into neural stem cell biology.</a> J Neurosci Res. 78, 761-769 (2004).</li><li>Imbeault, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+extracellular+matrix+controls+gap+junction+protein+expression+and+function+in+postnatal+hippocampal+neural+progenitor+cells.">The extracellular matrix controls gap junction protein expression and function in postnatal hippocampal neural progenitor cells.</a> BMC Neurosci. 10, 13-13 (2009).</li></ol>

Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien und Vorschriften her von der University of Ottawa Animal Care Committee und der Canadian Council on Animal Care Set durchgeführt.

Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Kultur und seriell Gefrier postnatalen Hippocampus NPCs, lokalisieren Proteinexpression durch Immunodetektion und schließlich zu rekonstruieren und zu analysieren, die topographische Lage der immunpositive Zellen innerhalb des gesamten 3D-Neurosphäre. Durch die Kombination zellbiologischer Kultur-und Verarbeitungstechniken, Mikroskopie (OpenLab, Improvisation und andere Bildanalyse Software), Grafik-Editing-Software-Kapazitäten (Adobe Photoshop) und 3D-Animation und Compositing-Software-Kapazitäten (Autodesk Maya), präsentieren wir eine Methode zur Rekonstruktion gesamte zelluläre Zusammensetzung von 3D-Kulturen aus serielles 2D-Bilder ermöglicht die originalgetreue Rekonstruktion der zellulären Position und Protein-Expression während einer Neurosphäre Kultur. Dieses Protokoll kann mit der gleichen Effektivität, um die Registrierung und die Rekonstruktion der epifluoreszenten dünne Schnittserien oder konfokalen Z-Stapel durch dickere Schnittserien kombiniert werden. Da klonale Expansion einzelner NPCs in Neurosphäre Kultur rekapituliert viele der Stufen im Laufe der Neurogenese und Gliogenese in postnatalen Gehirn beobachtet, stellt die Auswirkungen seiner 3D-Struktur ein wichtiger NPC Schicksal bestimmend in Nachkommen ausgesetzt, um die gleichen experimentellen Milieu 1. Divergenz in Linie und Protein-Expression im Kern und Peripherie von seriellen Neurosphäre Abschnitte darauf hin, dass mehrere physische Faktoren wie Zell Lage, mechanische Belastung und Querkraft spielen eine wichtige Rolle bei der Regulierung der NPC Biologie 2. Darüber hinaus hat Connexin-Protein-Expression, hier analysierten, wurde gezeigt, dass sich je nachdem, wann NPCs sind als 3D-Neurosphären in Suspension oder vergoldet auf Laminin Substrat mit funktionellen Connexin-vermittelter Kommunikation verändert, ob die Zellen auf Kunststoff-und Substrat oder in 3D-frei sind kultivierte kultivierten -schwimmende Kulturen 3. Die Auswirkungen der zellulären Position auf NPC Schicksal bleibt unklar. Es ist technisch anspruchsvoll, um Auswirkungen der räumlichen Lage innerhalb 3D-Kultur zu analysieren auf NPC Biologie gegeben, dass antigenen Beurteilung der Abstammung und Signalproteine ​​Störung der 3D-Architektur zu Zellpermeabilisierung und Antikörper-Zugriff auf alle Zellen zu aktivieren muss. Hier zeigen wir, dass ein Hybrid-Visualisierung Methodik ein Mittel zur Bestimmung, ob bestimmte Proteine ​​einzigartigen Positions-Lokalisierungen Ausstellung in 3D-Kultur bietet, kann man folgern, und testen Protein Funktion und Regulation im Hinblick auf regionale Lokalisation innerhalb der Neurosphäre werden, und, was vielleicht am wichtigsten , bietet die Positionsdaten benötigt, um die Auswirkungen der 3D-Topographie und zellulären Positionierung auf NPC Schicksal in 3D-Kultur zu studieren.

* Alle anderen Standard-chemischen Reagenzien im Protokoll aufgelistet sind von Sigma-Aldrich. Alle anderen Standard-Zellkultur-Reagenzien sind von Invitrogen.

localizing protein in 3d neural stem cell culture: a hybrid visualization methodology

Die Bedeutung der 3-dimensional (3D) Topographie beeinflussen neuralen Stamm-und Progenitorzellen (NPC)-Phänotyp ist allgemein anerkannt, aber schwierig zu studieren. Wenn losgelöst von embryonalen oder postnatale Gehirn, werden einzelne NPCs in Suspension vermehren zu Neurosphären bilden. Tochterzellen innerhalb dieser Kulturen spontan annehmen deutliche Entwicklungsstörungen Linien (Neuronen, Oligodendrozyten und Astrozyten) im Laufe der Expansion trotz der gleichen extrazellulären Milieu ausgesetzt. Diese Entwicklung rekapituliert viele der Stadien beobachtet im Laufe der Neurogenese und Gliogenese in postnatalen Gehirn und wird häufig verwendet, um grundlegende NPC Biologie in einer kontrollierten Umgebung zu studieren. Die Beurteilung der vollen Auswirkungen der 3D-Topographie und zellulären Positionierung innerhalb dieser Kulturen auf NPC Schicksal ist jedoch schwierig. Zur Lokalisierung von Target-Proteinen und identifizieren NPC Linien Immunzytochemie, muss frei schwebenden Neurosphären auf einem Substrat beschichtet werden oder seriell geschnitten. Diese Verarbeitung ist erforderlich, um gleichwertige Zellpermeabilisierung und Antikörper-Zugang im gesamten Gebiet zu gewährleisten. Als Ergebnis können 2D epifluoreszenten Bilder von Gefrierschnitten oder konfokale 3D-Rekonstruktionen von Z-Stapeln nur stellen räumliche Informationen über Zell-Position innerhalb diskreten physischen oder digitalen 3D-Scheiben und nicht visualisieren zelluläre Position im intakten Bereich. Hier, in der die Topographie des Neurosphäre Kultur bekräftigen und erlauben räumliche Analyse der Proteinexpression in der gesamten Kultur präsentieren wir ein Protokoll für die Isolierung, Expansion und serielle Schnitte von postnatalen Hippocampus Neurosphären für epifluoreszenten oder konfokalen Immundetektion der Zielproteine. Connexin29 (Cx29) wird als Beispiel analysiert. Anschließend mit einem Hybrid aus Grafik-Bearbeitung und 3D-Modellierung Software rigoros angewendet, um biologische Detail zu halten, beschreiben wir, wie der Zusammenbau des 3D strukturelle Positionierung der Bilder und digital map markierten Zellen innerhalb der gesamten Neurosphäre. Diese Methode ermöglicht die Visualisierung und Analyse der zellulären Position von Target-Proteinen und Zellen über die gesamte 3D-Topographie und Kultur wird eine detailliertere Analyse der räumlichen Beziehungen zwischen den Zellen im Laufe der Neurogenese und Gliogenese in vitro zu erleichtern. Beide Imbeault und Valenzuela gleichermaßen beigetragen und sollte als gemeinsame Erstautoren werden.

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Localizing Protein in 3D Neural Stem Cell Culture: a Hybrid Visualization Methodology

Hier beschreiben wir, wie zu produzieren, zu erweitern und immunolabel postnatalen Hippocampus neuronale Vorläuferzellen (NPCs) im dreidimensionalen (3D-) Kultur. Als nächstes mit Hybrid-Visualisierungs-Technologien, demonstrieren wir, wie digitale Bilder von immunolabelled Kryoschnitten verwendet werden, um zu rekonstruieren und Karte der räumlichen Lage der immunpositive Zellen über die gesamte 3D-Neurosphäre werden.

Lokalisieren von Protein in 3D Neural Stem Cell Culture: Ein Hybrid Visualisierung Methodology

The importance of 3-dimensional (3D) topography in influencing neural stem and progenitor cell (NPC) phenotype is widely acknowledged yet challenging to ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Dissection und Kultur kommissuralen Nervenzellen aus embryonalen Rückenmark

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Forschung

Neurowissenschaften

Growth and Differentiation of Adult Hippocampal Arctic Ground Squirrel Neural Stem Cells

Wachstum und Differenzierung von adulten Hippocampus Arctic Ground Squirrel Neural Stem Cells

Arctic ground squirrels (Urocitellus parryii, AGS) are unique in their ability to hibernate with a core body temperature near or below freezing 1. These ...

Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay

Gründung Embryonale Maus Neural Stem Cell Culture Mit dem Neurosphäre Assay

In mammalians, stem cells acts as a source of undifferentiated cells to maintain cell genesis and renewal in different tissues and organs during the life ...

Neural-Colony Forming Cell Assay: An Assay To Discriminate Bona Fide Neural Stem Cells from Neural Progenitor Cells

Neural-Colony Forming Zell-Assay: Ein Test zur Bona Fide neuralen Stammzellen aus neuralen Vorläuferzellen Discriminate

The neurosphere assay (NSA) is one of the most frequently used methods to isolate, expand and also calculate the frequency of neural stem cells (NSCs). ...

Isolation and Culture of Neural Crest Stem Cells from Human Hair Follicles

Isolation und Kultur von Neural Crest Stem Cells aus menschlichen Haarfollikeln

Hair follicles undergo lifelong growth and hair cycle is a well-controlled process involving stem cell proliferation and quiescence. Hair bulge is a ...

The Neuroblast Assay: An Assay for the Generation and Enrichment of Neuronal Progenitor Cells from Differentiating Neural Stem Cell Progeny Using Flow Cytometry

Die Neuroblast Assay: Ein Test für die Erzeugung und Anreicherung von neuronalen Vorläuferzellen aus neuralen Stammzellen differenzieren Progeny mittels Durchflusszytometrie

Neural stem cells (NSCs) can be isolated and expanded in large-scale, using the neurosphere assay and differentiated into the three major cell types of ...

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

Isolierung und Kultivierung von Zellen der Neuralleiste aus embryonalen murinen Neuralrohr

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

Enumeration of Neural Stem Cells Using Clonal Assays

Enumeration neuraler Stammzellen verwenden Geklonte Assays

Neural stem cells (NSCs) have the ability to self-renew and generate the three major neural lineages &#8212; astrocytes, neurons and oligodendrocytes. ...

Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Mouse Subcallosal Zone

Isolierung und Kultur von adulten neuralen Stammzellen aus der Maus subcallosa Zone

Adult neural stem cells (aNSCs) can be used for the regeneration of damaged brain tissue. NSCs have the potential for differentiation and proliferation ...

Development of a Refined Protocol for Trans-scleral Subretinal Transplantation of Human Retinal Pigment Epithelial Cells into Rat Eyes

Entwicklung eines raffinierten Protokolls für Trans-skleralen subretinalen Transplantation von menschlichen retinalen Pigment Epithelzellen in Ratte Augen

Degenerative retinal diseases such as age-related macular degeneration (AMD) are the leading cause of irreversible vision loss worldwide. AMD is ...