Name: localizing protein in 3d neural stem cell culture: a hybrid visualization methodology
Uploaded: 2010-12-19T18:00:00
Duration: 21 min 47 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Localizing Protein in 3D Neural Stem Cell Culture: a Hybrid Visualization Methodology at JoVE.com

אנו מודים אוון Dysart ומארק לאונרד לסיוע מומחה טכני הפקת וידאו ועריכה, מאט קוק לסיוע באיסוף הנתונים, ושרה גלברד לסיוע מערכת מומחה. העבודה מומנה על ידי מענקים מהמכון ההפעלה הקנדי לבריאות מחקר (CIHR, MOP 62,626) כדי SALB, יוזמה אימון אסטרטגי ומחקר בריאות התוכנית להעניק SALB ו SF (CIHR תוכנית הכשרה Lipidomics ניווניות, TGF 9121), תשתיות תמיכה של הקרן הקנדית אונטריו חדשנות חדשנות אמון על המדע הבדיוני. ת&quot;י קיבל מלגת בוגר אונטריו במדע וטכנולוגיה עם תרומות של הקונסורציום לחקר מחלת הפרקינסון. NV מקבל המכון הזדקנות CIHR תוכנית הכשרה Lipidomics ניווניות שלאחר מקצועי המילגה. אנו בתודה להכיר תמיכה חינוכית תוכנה טכני המסופקים על ידי Autodesk המחקר.

<ol>
	<li>Kempermann, G., Jessberger, S., Steiner, B., Kronenberg, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Milestones+of+neuronal+development+in+the+adult+hippocampus.">Milestones of neuronal development in the adult hippocampus.</a> Trends Neurosci. 27, 447-452 (2004).</li><li>Campos, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurospheres:+insights+into+neural+stem+cell+biology.">Neurospheres: insights into neural stem cell biology.</a> J Neurosci Res. 78, 761-769 (2004).</li><li>Imbeault, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+extracellular+matrix+controls+gap+junction+protein+expression+and+function+in+postnatal+hippocampal+neural+progenitor+cells.">The extracellular matrix controls gap junction protein expression and function in postnatal hippocampal neural progenitor cells.</a> BMC Neurosci. 10, 13-13 (2009).</li></ol>

כל הניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם להנחיות והתקנות שנקבעו על ידי אוניברסיטת אוטווה Animal Care הוועדה והמועצה הקנדית על טיפול בבעלי חיים.

פרוטוקול זה מתאר הליך לתרבות סדרתי שלאחר הלידה cryosection NPCs בהיפוקמפוס, בתרגום ביטוי החלבון על ידי immunodetection, ולבסוף לשחזר ולנתח את המיקום הטופוגרפי של תאים immunopositive בתוך neurosphere 3D כולו. על ידי שילוב של ביולוגיה של התא תרבות וטכניקות עיבוד, הדמיה מיקרוסקופית (OpenLab, אימפרוביזציה ועוד תוכנות ניתוח התמונה), תוכנת עריכת גרפיקה יכולות (Adobe Photoshop), ו 3D אנימציה והתוכנה יכולות compositing (Autodesk Maya), אנו מציגים מתודולוגיה לשחזר את הרכב הסלולר כולו של תרבויות 3D מ 2 ד תמונות סידורי המאפשר שחזור נאמן של עמדת הסלולר ביטוי חלבון בכל תרבות neurosphere. פרוטוקול זה יכול להיות בשילוב עם יעילות שווה ההרשמה ושיקום epifluorescent סעיפים סדרתי דק או confocal Z-ערימות דרך קטעים סדרתי עבה. בגלל התרחבות המשובטים של NPCs אחת משחזר תרבות neurosphere רבים בשלבים נצפתה במהלך הנוירוגנזה gliogenesis במוח שלאחר הלידה, את ההשפעה של מבנה 3D שלה מייצג NPC חשוב גורל הקובע צאצאים שנחשפו בסביבה ניסויית אותו 1. סטייה בשושלת וביטוי חלבון הליבה והפריפריה סעיפים neurosphere סדרתי מציע כי גורמים פיזיים מרובים לרבות העמדה התא, לחץ מכני, וכוח גזירה תפקיד חשוב בוויסות NPC ביולוגיה 2. יתר על כן, הביטוי connexin חלבון, ניתחו כאן, הוכח לשנות בהתאם NPCs כאשר הם מתורבתים כמו neurospheres 3D של השעיה או מצופה על מצע laminin עם תקשורת connexin בתיווך פונקציונלי שונה אם התאים בתרבית על מצע פלסטיק או 3D בחינם צף תרבויות 3. ההשפעה של עמדת הסלולר על גורל NPC עדיין לא ברור. זה מאתגר מבחינה טכנית כדי לנתח את ההשפעה של מיקום מרחבי בתוך התרבות 3D על הביולוגיה NPC בהתחשב בכך הערכה antigenic השושלת ו איתות חלבונים דורש שיבוש של ארכיטקטורת 3D כדי לאפשר permeabilization התא נוגדנים גישה לכל התאים. כאן, אנו מראים כי מתודולוגיה להדמיה היברידית מספק אמצעי לקבוע אם חלבונים מסוימים התערוכה לגרסאות המגוירות מיקומית ייחודי בתרבות 3D, ניתן להשתמש בהם כדי להסיק ולבדוק תפקוד החלבון ופיקוח ביחס לוקליזציה אזוריים בתוך neurosphere, וגם, ואולי הכי חשוב , מספק את הנתונים מיקומית נדרש ללמוד את ההשפעה של הטופוגרפיה 3D ומיצוב הסלולר על גורל NPC בתרבות 3D.

* כל ריאגנטים כימיים אחרים סטנדרטיים מופיע בפרוטוקול הם מן סיגמא אולדריץ. כל שאר תקן תרבות ריאגנטים רקמה מן Invitrogen.

localizing protein in 3d neural stem cell culture: a hybrid visualization methodology

חשיבותה של טופוגרפיה (3D) 3 מימדי להשפיע גזע עצביים תא אב (NPC) הוא נרחב פנוטיפ הודה עדיין מאתגר ללמוד. כאשר ניתק מן המוח העוברי או שלאחר הלידה, NPCs יחיד יתרבו ההשעיה כדי ליצור neurospheres. לתאי הבת בתוך תרבויות אלה באופן ספונטני לאמץ שושלות התפתחותיים שונים (נוירונים, oligodendrocytes, האסטרוציטים ו) במהלך התרחבות למרות היותו חשוף הסביבה תאיים אותו. זה משחזר את התקדמות בשלבים רבים של שנצפה במהלך הנוירוגנזה gliogenesis במוח שלאחר הלידה והוא משמש לעתים קרובות ללמוד ביולוגיה NPC בתוך בסיסי בסביבה מבוקרת. הערכת ההשפעה המלאה של הטופוגרפיה 3D ומיצוב הסלולר בתוך תרבויות אלה על גורל NPC עם זאת, קשה. כדי למקם חלבונים היעד ולזהות שושלות NPC ידי immunocytochemistry, ריחוף ללא neurospheres חייב להיות מצופה על מצע או מחולק סדרתי. עיבוד זה נדרש כדי להבטיח permeabilization תא המקבילה וגישה נוגדן בכל תחום. כתוצאה מכך, תמונות של cryosections epifluorescent 2D או 3D שחזורים confocal של Z-ערימות יכול רק לספק מידע מרחבי על המיקום בתוך תא נפרד פרוסות 3D פיזי או דיגיטלי ולא לדמיין עמדה בתחום הסלולר ללא פגע. כאן, לחזור על הטופוגרפיה של התרבות neurosphere היתר ניתוח מרחבי של ביטוי חלבון לאורך התרבות כולה, אנו מציגים פרוטוקול לבידוד, הרחבה, חתך הסידורי של שלאחר הלידה neurospheres בהיפוקמפוס מתאים immunodetection epifluorescent או confocal של חלבונים היעד. Connexin29 (Cx29) הוא ניתח כדוגמה. בשלב הבא, באמצעות שילוב של עריכה גרפית ו מודלים 3D תוכנות ליישם בקפדנות כדי לשמור על פרט ביולוגיים, אנו מתארים כיצד להרכיב מחדש את המיקום המבני 3D של דימויים אלה מפה דיגיטלית תאים שכותרתו בתוך neurosphere המלא. מתודולוגיה זו מאפשרת הדמיה וניתוח של העמדה של חלבונים היעד תאים ברחבי הטופוגרפיה התרבות כולה 3D ותאפשר ניתוח מפורט יותר של יחסים מרחביים בין תאים במהלך הנוירוגנזה gliogenesis במבחנה. שני Imbeault ו Valenzuela תרמו באותה מידה יש ​​לשקול המחברים first משותף.

Watch this Scientific Journal Video about Localizing Protein in 3D Neural Stem Cell Culture: a Hybrid Visualization Methodology at JoVE.com

Localizing Protein in 3D Neural Stem Cell Culture: a Hybrid Visualization Methodology

כאן אנו מתארים כיצד לייצר, להתרחב, immunolabel תאים בהיפוקמפוס לאחר הלידה אבי עצביים (NPCs) בתרבות (3D) תלת ממדי. בשלב הבא, תוך שימוש בטכנולוגיות הדמיה היברידית, אנו מדגימים כיצד תמונות דיגיטליות של cryosections immunolabelled יכול לשמש כדי לשחזר ולמפות את המיקום המרחבי של תאים immunopositive ברחבי neurosphere 3D כולו.

חלבון לוקליזציה ב 3D תרבות גזע עצביים נייד: מתודולוגיה ויזואליזציה היברידי

The importance of 3-dimensional (3D) topography in influencing neural stem and progenitor cell (NPC) phenotype is widely acknowledged yet challenging to ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Dissection והתרבות של נוירונים Commissural מחוט השדרה עובריים

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Growth and Differentiation of Adult Hippocampal Arctic Ground Squirrel Neural Stem Cells

גדילה והתמיינות של מבוגרים בהיפוקמפוס סנאי הארקטי קרקע תאים גזע עצביים

Arctic ground squirrels (Urocitellus parryii, AGS) are unique in their ability to hibernate with a core body temperature near or below freezing 1. These ...

Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay

הקמת עכבר עובריים גזע עצביים תרבית תאים באמצעות Assay Neurosphere

In mammalians, stem cells acts as a source of undifferentiated cells to maintain cell genesis and renewal in different tissues and organs during the life ...

Neural-Colony Forming Cell Assay: An Assay To Discriminate Bona Fide Neural Stem Cells from Neural Progenitor Cells

עצבית, המושבה יצירת Assay נייד: Assay להפלות בונה תאים בתום גזע עצביים מן ובתאים עצבית

The neurosphere assay (NSA) is one of the most frequently used methods to isolate, expand and also calculate the frequency of neural stem cells (NSCs). ...

Isolation and Culture of Neural Crest Stem Cells from Human Hair Follicles

בידוד ותרבות של תאי גזע עצביים קרסט מזקיקי שיער אנושיים

Hair follicles undergo lifelong growth and hair cycle is a well-controlled process involving stem cell proliferation and quiescence. Hair bulge is a ...

The Neuroblast Assay: An Assay for the Generation and Enrichment of Neuronal Progenitor Cells from Differentiating Neural Stem Cell Progeny Using Flow Cytometry

Assay Neuroblast: Assay לדור והעשרה של ובתאים העצבית הבחנה בין צאצאיהם גזע עצביים Cell שימוש cytometry זרימה

Neural stem cells (NSCs) can be isolated and expanded in large-scale, using the neurosphere assay and differentiated into the three major cell types of ...

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

בידוד והתרבות של תאים עצביים לפסגה מהצינור עובריים עצבית Murine

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

Enumeration of Neural Stem Cells Using Clonal Assays

ספירת בתאי גזע עצביים באמצעות מבחני המשובטים

Neural stem cells (NSCs) have the ability to self-renew and generate the three major neural lineages &#8212; astrocytes, neurons and oligodendrocytes. ...

Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Mouse Subcallosal Zone

בידוד והתרבות של תאי גזע בוגרים עצביים מאזור העכבר Subcallosal

Adult neural stem cells (aNSCs) can be used for the regeneration of damaged brain tissue. NSCs have the potential for differentiation and proliferation ...

Development of a Refined Protocol for Trans-scleral Subretinal Transplantation of Human Retinal Pigment Epithelial Cells into Rat Eyes

פיתוחו של פרוטוקול מעודן עבור השתלת Subretinal טרנס-scleral של תאי אפיתל הפיגמנט ברשתית האנושי בעיניים עכברוש

Degenerative retinal diseases such as age-related macular degeneration (AMD) are the leading cause of irreversible vision loss worldwide. AMD is ...