Name: localizing protein in 3d neural stem cell culture: a hybrid visualization methodology
Uploaded: 2010-12-19T18:00:00
Duration: 21 min 47 s
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我々は専門家の編集支援のためのデータ収集の支援のためにマットクック、ビデオ制作や編集の専門家の技術支援のためにエヴァンディザートとマークレオナールに感謝、そしてサラGelbard。仕事はSALB、SALBとSFの健康研究プログラムの助成金の戦略的トレーニングイニシアティブ（TGF神経変性脂質メタボロームのCIHRのトレーニングプログラム、9121）、およびインフラストラクチャへの健康研究のカナダ研究所（CIHR、MOP 62626）から営業の補助金によって賄われていたカナダの財団イノベーションとオンタリオ州イノベーショントラストからSFまでサポート。 SIは、パーキンソンの研究コンソーシアムからの拠出金と科学技術のオンタリオ大学院奨学金を受け取りました。 NVは、神経変性リピドミクス、ポストプロのフェローシップで老化研究所とCIHRのトレーニングプログラムを受け取ります。我々は感謝してAutoDesk社リサーチが提供する教育用ソフトウェアと技術サポートを認めます。

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	<li>Kempermann, G., Jessberger, S., Steiner, B., Kronenberg, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Milestones+of+neuronal+development+in+the+adult+hippocampus.">Milestones of neuronal development in the adult hippocampus.</a> Trends Neurosci. 27, 447-452 (2004).</li><li>Campos, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurospheres:+insights+into+neural+stem+cell+biology.">Neurospheres: insights into neural stem cell biology.</a> J Neurosci Res. 78, 761-769 (2004).</li><li>Imbeault, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+extracellular+matrix+controls+gap+junction+protein+expression+and+function+in+postnatal+hippocampal+neural+progenitor+cells.">The extracellular matrix controls gap junction protein expression and function in postnatal hippocampal neural progenitor cells.</a> BMC Neurosci. 10, 13-13 (2009).</li></ol>

動物での実験はすべてオタワアニマルケア委員会の大学や動物ケアに関するカナダの理事会が定めるガイドラインおよび規則に従って行った。

このプロトコルは、文化とシリアル凍結切片産後海馬のNPCに手順を説明し、免疫検出によるタンパク質の発現をローカライズする、そして最終的に全体の3Dニューロスフィア内に免疫陽性細胞の地形の位置を再構築し、分析する。 、グラフィック編集ソフトウェア容量（アドビフォトショップ）、そして3Dアニメーションとの合成ソフトウェア容量（Autodesk Mayaを）細胞生物学の文化と加工技術、顕微鏡画像（オープンラボ、即興と他の画像解析ソフト）を組み合わせることにより、我々は、再構築する方法論を提示ニューロスフェア培養を通して細胞の位置およびタンパク質発現の忠実な再建を可能にするシリアル2D画像から3Dの文化の全体の細胞組成。このプロトコルは、登録と厚い連続切片を介して落射蛍光薄連続切片または共焦点Z -スタックの再建に等しい効果と組み合わせることができます。出生後の脳における神経新生とgliogenesisの経過観察の段階のニューロスフェア培養用反復する単一のNPCのクローン増殖が多いため、その立体構造の影響は、同じ実験環境1にさらさ後代における重要なNPCの運命決定因子を表しています。シリアルロスフェアのセクションのコアと周辺部で系統およびタンパク質発現の相違は、そのセルの位置、機械的応力、及びせん断力を含む複数の物理的要因はNPCの生物学2を調節する上で重要な役割を果たすことを示唆している。さらに、コネキシン蛋白質の発現は、、ここで解析のNPCが細胞をプラスチックや基板上または3Dを無料で培養されているかどうかを変更機能コネキシンを介したコミュニケーションによるラミニン基質上にサスペンションやメッキで3Dロスフェアとして培養されるときに応じて変更することが示されているフローティング文化3。 NPCの運命上の細胞の位置の影響は不明なままである。それは技術的に系統およびシグナル伝達タンパク質の抗原性の評価は、3次元構造の破壊は、細胞浸透性とすべてのセルへの抗体のアクセスを有効にするために必要な特定のNPCの生物学上の3次元文化の中で空間的な位置の影響を分析するために挑戦している。ここで、我々はハイブリッド視覚化手法は、おそらく最も重要なの、、特定の蛋白質が立体文化の中でユニークな位置ローカライゼーションを示すかどうかを決定する手段を提供するニューロスフェアの中で局所的配置に関連してタンパク質の機能と規制を推測し、テストするために使用することができる、としていることを示し、3次元培養におけるNPCの運命の3D地形や携帯電話の位置の影響を研究するために必要な位置データを提供します。

プロトコールに記載されている*他のすべての標準的な化学試薬はSigma - Aldrichからです。他のすべての標準組織培養試薬はInvitrogenからです。

localizing protein in 3d neural stem cell culture: a hybrid visualization methodology

神経幹細胞および前駆細胞に影響を及ぼす3次元（3D）地形の重要性（NPC）表現型は、広く研究するために挑戦はまだ認められている。胎児または出生後の脳からのときは解離、単一のNPCはニューロスフェアを形成するために、懸濁液中で増殖される。これらの培養物内の娘細胞は、自発的に同一の細胞外環境にさらされているにもかかわらず、拡大の過程で明確な発達系統を（ニューロン、オリゴデンドロサイト、アストロサイト）を採用。この進行の反復するには、ステージの多くは、出生後の脳における神経新生とgliogenesisの経過観察と​​、多くの場合、制御された環境の中で基本的なNPCの生物学を研究するために使用されます。 NPCの運命上のこれらの培養物内の3D地形や携帯電話の位置の完全な影響を評価する、しかし、難しいです。標的タンパク質をローカライズし、免疫細胞化学によってNPCの系統を識別するには、フリーフローティングニューロスフェアは、基板上に播種したり、シリアルに区分されている必要があります。この処理は、球全体に相当する細胞浸透性および抗体のアクセスを確保するために必要です。その結果、凍結切片または3D Z -スタックの共焦点再建の2D落射蛍光画像は、離散的な物理的またはデジタル3Dスライス内のセルの位置に関する空間的な情報を提供することができますし、無傷の球の細胞の位置を視覚化していない。ここでは、ニューロスフェアの文化の地形をあらためて表明し、全体の文化を通して蛋白質の発現の空間的な分析を可能にするために、我々は分離、展開、および標的タンパク質の落射蛍光または共焦点免疫検出に適した生後海馬ニューロスフェアのシリアルセクショニングのためのプロトコルを提示する。 Connexin29は（Cx29）の例として分析される。次に、グラフィックの編集と厳密に生物学的な詳細を維持するために適用される3Dモデリングソフトのハイブリッドを使用して、我々はどのようにこれらのイメージの再アセンブル3次元構造の位置へとデジタル完全なニューロスフェアの中で標識された細胞をマッピングについて説明します。この方法論は、全体の3次元文化の地形全体の標的蛋白質と細胞の細胞位置の可視化と分析を可能にし、in vitroで神経新生とgliogenesisの過程で細胞間の空間関係のより詳細な分析を容易にするでしょう。 Imbeaultとバレンスエラ両方が均等に貢献し、共同第一著者を考慮する必要があります。

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Localizing Protein in 3D Neural Stem Cell Culture: a Hybrid Visualization Methodology

ここで、我々は3次元（3D）文化の中で、生産の拡大、およびimmunolabel生後海馬の神経前駆細胞（NPCに）する方法について説明します。次に、ハイブリッド可視化技術を使用して、我々はimmunolabelled凍結切片のデジタル画像が全体の3Dニューロスフィアを通して免疫陽性細胞の空間的位置を再構築し、マップするために使用することができる方法を示します。

3D神経幹細胞培養におけるローカライズたんぱく質：ハイブリッド可視化手法

The importance of 3-dimensional (3D) topography in influencing neural stem and progenitor cell (NPC) phenotype is widely acknowledged yet challenging to ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

胚の脊髄から交連ニューロンの解剖と文化

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Growth and Differentiation of Adult Hippocampal Arctic Ground Squirrel Neural Stem Cells

成人海馬ホッキョクジリス神経幹細胞の増殖と分化

Arctic ground squirrels (Urocitellus parryii, AGS) are unique in their ability to hibernate with a core body temperature near or below freezing 1. These ...

Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay

ニューロスフェアのアッセイを使用してマウス胎児神経幹細胞培養の確立

In mammalians, stem cells acts as a source of undifferentiated cells to maintain cell genesis and renewal in different tissues and organs during the life ...

Neural-Colony Forming Cell Assay: An Assay To Discriminate Bona Fide Neural Stem Cells from Neural Progenitor Cells

神経コロニー形成細胞アッセイ：神経前駆細胞から善意の神経幹細胞を区別するアッセイ

The neurosphere assay (NSA) is one of the most frequently used methods to isolate, expand and also calculate the frequency of neural stem cells (NSCs). ...

Isolation and Culture of Neural Crest Stem Cells from Human Hair Follicles

人間の毛包から神経堤幹細胞の単離および培養

Hair follicles undergo lifelong growth and hair cycle is a well-controlled process involving stem cell proliferation and quiescence. Hair bulge is a ...

The Neuroblast Assay: An Assay for the Generation and Enrichment of Neuronal Progenitor Cells from Differentiating Neural Stem Cell Progeny Using Flow Cytometry

神経芽細胞アッセイ：フローサイトメトリーを用いて神経幹細胞の子孫を差別から神経前駆細胞の生成と濃縮のためのアッセイ

Neural stem cells (NSCs) can be isolated and expanded in large-scale, using the neurosphere assay and differentiated into the three major cell types of ...

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

胎児マウス神経管から神経堤細胞の単離および培養

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

Enumeration of Neural Stem Cells Using Clonal Assays

クローンのアッセイを用いて神経幹細胞の列挙

Neural stem cells (NSCs) have the ability to self-renew and generate the three major neural lineages &#8212; astrocytes, neurons and oligodendrocytes. ...

Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Mouse Subcallosal Zone

マウス梁下ゾーンから成体神経幹細胞の単離および培養

Adult neural stem cells (aNSCs) can be used for the regeneration of damaged brain tissue. NSCs have the potential for differentiation and proliferation ...

Development of a Refined Protocol for Trans-scleral Subretinal Transplantation of Human Retinal Pigment Epithelial Cells into Rat Eyes

強膜網膜移植ひと網膜色素上皮細胞のラットの目の洗練されたプロトコルの開発

Degenerative retinal diseases such as age-related macular degeneration (AMD) are the leading cause of irreversible vision loss worldwide. AMD is ...