Name: localizing protein in 3d neural stem cell culture: a hybrid visualization methodology
Uploaded: 2010-12-19T18:00:00
Duration: 21 min 47 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Localizing Protein in 3D Neural Stem Cell Culture: a Hybrid Visualization Methodology at JoVE.com

Мы благодарим Эвана Дайсарт и Марк Леонард для экспертной технической помощи в производстве и редактирования видео, Мэтт Кук за помощь в сборе данных, и Сара Гелбард за помощью редакционной эксперт. Работа финансировалась операционная грантов от Канадского института исследований в области здравоохранения (CIHR, СС 62 626) до SALB, стратегическая инициатива обучения в сфере научных исследований программу грантов для SALB и SF (CIHR Программа обучения в нейродегенеративных Lipidomics, TGF 9121), и инфраструктура поддержке Канадского фонда инноваций и Онтарио Инновации Доверие к SF. С. И. получил стипендию Онтарио Высшее в области науки и технологий при участии консорциума Исследования Паркинсона. Н. В. получает института старения и CIHR Программа обучения в нейродегенеративных Lipidomics после профессионального общения. Мы глубоко признательны образовательную поддержку программного обеспечения и технической предоставляемые AutoDesk исследований.

<ol>
	<li>Kempermann, G., Jessberger, S., Steiner, B., Kronenberg, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Milestones+of+neuronal+development+in+the+adult+hippocampus.">Milestones of neuronal development in the adult hippocampus.</a> Trends Neurosci. 27, 447-452 (2004).</li><li>Campos, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurospheres:+insights+into+neural+stem+cell+biology.">Neurospheres: insights into neural stem cell biology.</a> J Neurosci Res. 78, 761-769 (2004).</li><li>Imbeault, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+extracellular+matrix+controls+gap+junction+protein+expression+and+function+in+postnatal+hippocampal+neural+progenitor+cells.">The extracellular matrix controls gap junction protein expression and function in postnatal hippocampal neural progenitor cells.</a> BMC Neurosci. 10, 13-13 (2009).</li></ol>

Все эксперименты на животных были проведены в соответствии с руководящими принципами и правилами, установленными Университета Оттавы Animal Care комитета и Канадского совета по уходу за животными.

Этот протокол описывает процедуру культуры и серийно cryosection послеродовой гиппокампа NPC, локализовать экспрессии белка от иммунологического и, наконец, реконструкция и анализ топографических положение иммунопозитивных клеток в течение всей 3D neurosphere. Объединив культуру клеток биологии и методов обработки, микроскопия томография (OpenLab, импровизация и другие программного обеспечения для анализа изображений), графическое программное обеспечение для редактирования мощностей (Adobe Photoshop), и 3D-анимации и возможности композитинга программного обеспечения (Autodesk Maya), приведем методику для восстановления весь клеточный состав 3D культур от серийного 2D-изображений позволяет верная реконструкция клеточных положение и экспрессии белка всей neurosphere культуры. Этот протокол может быть объединен с одинаковой эффективностью для регистрации и реконструкции epifluorescent тонкие серийных срезов или конфокальной Z-стеки через толстые серийных срезов. Потому что клональной экспансии одного NPC, в neurosphere повторяет культуру многих этапах наблюдается в течение нейрогенеза и gliogenesis в послеродовой мозга, воздействие ее 3D-структура представляет важный фактор, определяющий судьбу NPC в потомстве подвергаются той же экспериментальной среде 1. Дивергенция в линии и экспрессии белка в ядро и периферию серийных срезов neurosphere предполагает, что несколько физических факторов, включая сотовые положении, механическим нагрузкам, и поперечной силы играют важную роль в регулировании NPC биологии 2. Более того, коннексин экспрессии белка, проанализированы здесь, как было показано, меняются в зависимости от того, когда NPC, культивируют как 3D нейросферы в суспензии или высевают на ламинин подложки с функциональными коннексин-опосредованной коммуникации изменили ли клетки культивируют на пластике и субстрат или в 3D свободный плавающего культур 3. Воздействие сотовой позицию по NPC судьба остается неясной. Это технически сложно анализировать влияние пространственного расположения в 3D культуры на NPC биологии, учитывая, что антигенные оценки происхождения и сигнальных белков требует разрушения 3D архитектуру, чтобы пермеабилизации клеток и антител доступ ко всем клеткам. Здесь мы показываем, что гибридная методика визуализации обеспечивает средства определения того, некоторые белки выставку уникальных позиционных локализаций в 3D-культуры, может быть использована для вывода и протестировать функцию белка и регулирования в отношении региональных локализации в neurosphere, и, пожалуй, самое главное , обеспечивает позиционных данных, необходимых для изучения влияния 3D топографии и клеточной позиционирование на NPC судьбу в 3D культуры.

* Все остальные стандартные химические реактивы, перечисленные в протоколе от Sigma-Aldrich. Все остальные стандартные реагенты культуре ткани из Invitrogen.

localizing protein in 3d neural stem cell culture: a hybrid visualization methodology

Важность 3-мерные (3D) топографии в формировании нейронных стволовых и клеток-предшественников (NPC) фенотип широкое признание еще сложных для изучения. При отрыве от эмбриона или послеродовой мозга, один НПС будут распространяться в виде суспензии для формирования нейросферы. Дочь клеток в этих культурах спонтанно принимать различные развитием линий (нейроны, олигодендроциты и астроциты) в течение расширения несмотря на то, подвержены тем же внеклеточной среде. Эта прогрессия повторяет многие из этапов наблюдается в течение нейрогенеза и gliogenesis в послеродовой мозга и часто используется для изучения фундаментальной биологии NPC в контролируемой среде. Оценка полное влияние 3D топографии и клеточной позиционирование в рамках этих культур на NPC судьбы, однако, трудно. Для локализации белков-мишеней и определить NPC линий по иммуноцитохимия, свободно плавающих нейросферы должны быть покрыты на подложке или последовательно секционного. Такая обработка необходима для обеспечения эквивалентного пермеабилизации клеток и антител доступа на всей территории области. В результате, 2D epifluorescent образы cryosections или конфокальной реконструкции 3D-Z-стеки могут обеспечить только пространственную информацию о ячейке позиции в дискретных физических или цифровых 3D ломтиками и не визуализировать сотовой позиции в нетронутой сферой. Здесь вновь топографии neurosphere культуры и разрешить пространственный анализ экспрессии белка в течение всего культура, мы представляем протокол для изоляции, расширение, и серийный секционирования послеродовой гиппокампа нейросферы подходит для epifluorescent или конфокальной иммунодетекции белков-мишеней. Connexin29 (Cx29) анализируется в качестве примера. Далее, используя гибрид графического редактирования и 3D моделирования программного обеспечения строгого применения для целей сохранения биологического подробно мы расскажем, как повторно собрать 3D структурных позиционирование этих изображений и цифровой карте меченых клеток в полной neurosphere. Эта методика дает возможность визуализации и анализа сотовой положение целевых белков и клеток в течение всего 3D топография культуры и будет способствовать более детальный анализ пространственных отношений между клетками в течение нейрогенеза и gliogenesis в пробирке. Оба Imbeault и Валенсуэла способствовали в равной степени и должны быть рассмотрены совместные первых авторов.

Watch this Scientific Journal Video about Localizing Protein in 3D Neural Stem Cell Culture: a Hybrid Visualization Methodology at JoVE.com

Localizing Protein in 3D Neural Stem Cell Culture: a Hybrid Visualization Methodology

Здесь мы описываем, как производить, расширять и immunolabel послеродовой гиппокампа нейронных клеток-предшественников (НПК) в трехмерной (3D) культуры. Далее, используя гибридные технологии визуализации, мы показали, как цифровые изображения immunolabelled cryosections может быть использован для реконструкции и карта пространственного положения иммунопозитивных клетки на протяжении всего neurosphere 3D.

Локализация белка в 3D нейронные культуры стволовых клеток: Гибридные Методология Визуализация

The importance of 3-dimensional (3D) topography in influencing neural stem and progenitor cell (NPC) phenotype is widely acknowledged yet challenging to ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Разбор и культуры спаечный Нейроны из эмбриональных спинного мозга

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Growth and Differentiation of Adult Hippocampal Arctic Ground Squirrel Neural Stem Cells

Роста и дифференцировки взрослых гиппокампа земли Арктики Белка нервные стволовые клетки

Arctic ground squirrels (Urocitellus parryii, AGS) are unique in their ability to hibernate with a core body temperature near or below freezing 1. These ...

Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay

Создание эмбриональных Мышь нейронные культуры стволовых клеток Использование Neurosphere Пробирной

In mammalians, stem cells acts as a source of undifferentiated cells to maintain cell genesis and renewal in different tissues and organs during the life ...

Neural-Colony Forming Cell Assay: An Assay To Discriminate Bona Fide Neural Stem Cells from Neural Progenitor Cells

Neural-колония Формирование анализа клеточной: Пробирной различать Добросовестный нервные стволовые клетки из нервных клеток-предшественников

The neurosphere assay (NSA) is one of the most frequently used methods to isolate, expand and also calculate the frequency of neural stem cells (NSCs). ...

Isolation and Culture of Neural Crest Stem Cells from Human Hair Follicles

Выделение и культуры нервного гребня стволовых клеток из человеческих волоса

Hair follicles undergo lifelong growth and hair cycle is a well-controlled process involving stem cell proliferation and quiescence. Hair bulge is a ...

The Neuroblast Assay: An Assay for the Generation and Enrichment of Neuronal Progenitor Cells from Differentiating Neural Stem Cell Progeny Using Flow Cytometry

Нейробластов Анализ: Анализ для создания и обогащения нейронов клетки-предшественники из Дифференцируя нейронных потомков стволовых клеток методом проточной цитометрии

Neural stem cells (NSCs) can be isolated and expanded in large-scale, using the neurosphere assay and differentiated into the three major cell types of ...

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

Выделение и культуры клеток нервного гребня из эмбриональных мышей нервной трубки

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

Enumeration of Neural Stem Cells Using Clonal Assays

Перечень нервных стволовых клеток, с помощью клоновых Assays

Neural stem cells (NSCs) have the ability to self-renew and generate the three major neural lineages &#8212; astrocytes, neurons and oligodendrocytes. ...

Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Mouse Subcallosal Zone

Выделение и культуры взрослых нервные стволовые клетки от мыши зоны расположенный под мозолистым телом

Adult neural stem cells (aNSCs) can be used for the regeneration of damaged brain tissue. NSCs have the potential for differentiation and proliferation ...

Development of a Refined Protocol for Trans-scleral Subretinal Transplantation of Human Retinal Pigment Epithelial Cells into Rat Eyes

Разработка изысканный протокола для транс склеры субретинальное трансплантации эпителиальных клеток человека пигмента сетчатки глаза крыс

Degenerative retinal diseases such as age-related macular degeneration (AMD) are the leading cause of irreversible vision loss worldwide. AMD is ...