Name: localizing protein in 3d neural stem cell culture: a hybrid visualization methodology
Uploaded: 2010-12-19T18:00:00
Duration: 21 min 47 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Localizing Protein in 3D Neural Stem Cell Culture: a Hybrid Visualization Methodology at JoVE.com

Vi tackar Evan Dysart och Marc Léonard för teknisk experthjälp i videoproduktion och redigering, Matt Cooke för hjälp med insamling av data, och Sarah Gelbard för expert redaktionell hjälp. Arbetet har finansierats av driftsbidrag från den kanadensiska Institute of Health Research (CIHR, MOP 62.626) för att SALB, en strategisk utbildningsinitiativ inom hälso Forskningsprogram bidrag till SALB och SF (CIHR utbildning i Neurodegenerativa Lipidomics, TGF 9121), och infrastruktur stöd från den kanadensiska stiftelsen Innovation och Ontario Innovation Tillit till SF. SI fick en Ontario Graduate Scholarship inom vetenskap och teknik med bidrag från Parkinson Research Consortium. NV får ett institut för åldrande och CIHR utbildningsprogram i Neurodegenerativa Lipidomics efter professionell gemenskap. Vi erkänner tacksamt de pedagogiska programvaror och teknisk support tillhandahålls av Autodesk Research.

<ol>
	<li>Kempermann, G., Jessberger, S., Steiner, B., Kronenberg, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Milestones+of+neuronal+development+in+the+adult+hippocampus.">Milestones of neuronal development in the adult hippocampus.</a> Trends Neurosci. 27, 447-452 (2004).</li><li>Campos, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurospheres:+insights+into+neural+stem+cell+biology.">Neurospheres: insights into neural stem cell biology.</a> J Neurosci Res. 78, 761-769 (2004).</li><li>Imbeault, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+extracellular+matrix+controls+gap+junction+protein+expression+and+function+in+postnatal+hippocampal+neural+progenitor+cells.">The extracellular matrix controls gap junction protein expression and function in postnatal hippocampal neural progenitor cells.</a> BMC Neurosci. 10, 13-13 (2009).</li></ol>

Alla experiment på djur har utförts i enlighet med de riktlinjer och regler som anges av University of Ottawa Djurvård kommittén och kanadensiska rådet om Animal Care.

Detta protokoll beskriver en procedur till kultur och serie cryosection postnatal hippocampus NPC, lokalisera proteinuttryck av immunodetection och slutligen rekonstruera och analysera topografiska läge immunopositive celler i hela 3D neurosphere. Genom att kombinera kultur cellbiologi och tekniker bearbetning, mikroskopi imaging (OpenLab, improvisation och annan bild mjukvaror analys), grafiska redigeringsprogram kapacitet (Adobe Photoshop), och 3D-animering och montage kapacitet programvara (Autodesk Maya) presenterar vi en metod för att rekonstruera Hela cellulära sammansättning av 3D kulturer från seriella 2D-bilder gör det möjligt att troende återuppbyggnaden av cellulära position och proteinuttryck under en neurosphere kultur. Detta protokoll kan kombineras med samma effektivitet till registrering och rekonstruktion av epifluorescent tunna serie avsnitt eller konfokala Z-stackar genom tjockare serie avsnitt. Eftersom klonal expansion av enstaka NPCs i neurosphere kultur rekapitulerar många av de stadier som observerats under loppet av neurogenes och gliogenesis i postnatal hjärna, representerar effekterna av dess 3D-struktur en viktig bestämningsfaktor NPC öde i avkomman utsatts för samma experimentella miljön 1. Skillnader i härstamning och proteinuttryck i centrum och periferi seriella neurosphere avsnitt tyder på att flera fysiska faktorer inklusive cell position, mekanisk stress och tvärkraft spelar en viktig roll i regleringen av NPC biologi 2. Dessutom har connexin proteinuttryck, analyseras här, visat att ändras beroende på när NPC odlas som 3D neurospheres i suspension eller pläterade på en laminin substrat med funktionell connexin-medierad kommunikation förändras om celler odlas på plast och substrat eller i 3D gratis -flytande kulturer 3. Effekten av cellulära position på NPC öde är fortfarande oklart. Det är tekniskt utmanande att analysera effekterna av fysisk plats inom 3D-kultur på NPC biologi med tanke på att antigen bedömning av härstamning och signalproteiner kräver avbrott i 3D-strukturen för att aktivera cellen permeabilization och antikroppar tillgång till alla celler. Här visar vi att en hybrid visualisering metodik ger en möjlighet att avgöra om vissa proteiner har mycket speciella positionella lokaliseringar i 3D kulturen, kan användas för att dra slutsatser och testa proteiners funktion och reglering med hänsyn till regionala lokalisering inom neurosphere, och, kanske viktigast av allt ger positionsdata som krävs för att studera effekten av 3D-topografi och cellulära placering på NPC öde i 3D kultur.

* Alla andra vanliga kemiska reagenser anges i protokollet är från Sigma-Aldrich. Alla andra vanliga vävnadsodling reagenser är från Invitrogen.

localizing protein in 3d neural stem cell culture: a hybrid visualization methodology

Vikten av 3-dimensionell (3D) topografi att påverka neurala stamceller och stamceller (NPC) som är fenotyp allmänt känt men utmanande att studera. När skiljas från embryonala eller postnatal hjärna kommer enda NPCs föröka sig i suspension att bilda neurospheres. Dotter celler inom dessa kulturer antar spontant tydliga utvecklings härstamningar (nervceller, oligodendrocyter och astrocyter) under loppet av expansion trots att utsättas för samma extracellulära miljön. Denna progression rekapitulerar många av de stadier som observerats under loppet av neurogenes och gliogenesis i postnatal hjärnan och används ofta för att studera grundläggande NPC biologi i en kontrollerad miljö. Bedöma den fulla effekten av 3D-topografi och cellulära positionering inom dessa kulturer på NPC öde är dock svårt. För att lokalisera målproteiner och identifiera NPC härstamningar genom immuncytokemi måste fritt flytande neurospheres beläggas på ett substrat eller serie snittades. Denna bearbetning krävs för att säkerställa likvärdig cell permeabilization och antikroppar på hela klotet. Som ett resultat kan 2D epifluorescent bilder av kryosnitt eller konfokala rekonstruktioner av 3D Z-staplar ger bara geografisk information om cellens position inom diskreta fysiska eller digitala 3D-skivor och inte visualisera cellulära position i den intakta sfären. Här upprepa topografi neurosphere kultur och tillåta rumslig analys av protein uttryck i hela kulturen, presenterar vi ett protokoll för isolering, expansion och seriell sektionering av postnatal hippocampus neurospheres lämplig för epifluorescent eller konfokala immunodetection av målproteiner. Connexin29 (Cx29) analyseras som ett exempel. Nästa, programvaror med hjälp av en hybrid av grafisk redigering och 3D-modellering tillämpas strikt för att bevara den biologiska detalj beskriver vi hur att återmontera 3D strukturella placeringen av dessa bilder och digitalt karta märkta celler i hela neurosphere. Denna metod gör det möjligt för visualisering och analys av cellulära ställning målproteiner och celler i hela 3D-kulturen topografi och kommer att underlätta en mer detaljerad analys av rumsliga relationer mellan celler under loppet av neurogenes och gliogenesis in vitro. Både Imbeault och Valenzuela bidragit lika och bör betraktas gemensamt första författare.

Watch this Scientific Journal Video about Localizing Protein in 3D Neural Stem Cell Culture: a Hybrid Visualization Methodology at JoVE.com

Localizing Protein in 3D Neural Stem Cell Culture: a Hybrid Visualization Methodology

Här beskriver vi hur man kan producera, expandera och immunolabel postnatal hippocampus neurala progenitorceller (NPC) i tre-dimensionell (3D) kultur. Nästa, med hjälp av hybrid-visualisering teknik, visar vi hur digitala bilder av immunolabelled kryosnitt kan användas för att rekonstruera och kartlägga de rumsliga position immunopositive celler i hela 3D neurosphere.

Lokalisera Protein i 3D Neural Stem Cell Culture: en hybrid Visualisering Methodology

The importance of 3-dimensional (3D) topography in influencing neural stem and progenitor cell (NPC) phenotype is widely acknowledged yet challenging to ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Dissektion och kultur commissural neuroner från embryonala ryggmärg

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Growth and Differentiation of Adult Hippocampal Arctic Ground Squirrel Neural Stem Cells

Tillväxt och differentiering av vuxna hippocampus Arctic Neurala jordekorre Stamceller

Arctic ground squirrels (Urocitellus parryii, AGS) are unique in their ability to hibernate with a core body temperature near or below freezing 1. These ...

Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay

Etablera Embryonala Mus Neurala Kultur Stem Cell Använda Neurosphere analys

In mammalians, stem cells acts as a source of undifferentiated cells to maintain cell genesis and renewal in different tissues and organs during the life ...

Neural-Colony Forming Cell Assay: An Assay To Discriminate Bona Fide Neural Stem Cells from Neural Progenitor Cells

Neural-kolonibildande Cell-analys: en analys att diskriminera Bona Fide neuronala stamceller från neurala stamceller

The neurosphere assay (NSA) is one of the most frequently used methods to isolate, expand and also calculate the frequency of neural stem cells (NSCs). ...

Isolation and Culture of Neural Crest Stem Cells from Human Hair Follicles

Isolering och odling av neurala celler Crest härrör från mänskliga hårsäckar

Hair follicles undergo lifelong growth and hair cycle is a well-controlled process involving stem cell proliferation and quiescence. Hair bulge is a ...

The Neuroblast Assay: An Assay for the Generation and Enrichment of Neuronal Progenitor Cells from Differentiating Neural Stem Cell Progeny Using Flow Cytometry

Den Neuroblast Analys: En analys för generering och anrikning av neuronala progenitorceller från Skilja Neural Stem Cell Progeny med hjälp av flödescytometri

Neural stem cells (NSCs) can be isolated and expanded in large-scale, using the neurosphere assay and differentiated into the three major cell types of ...

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

Isolering och odling av neurallistceller från embryonala Murine Neural Tube

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

Enumeration of Neural Stem Cells Using Clonal Assays

Räkning av neurala stamceller Använda Klon Analyser

Neural stem cells (NSCs) have the ability to self-renew and generate the three major neural lineages &#8212; astrocytes, neurons and oligodendrocytes. ...

Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Mouse Subcallosal Zone

Isolering och kultur av vuxna neurala stamceller från mus Subcallosal Zone

Adult neural stem cells (aNSCs) can be used for the regeneration of damaged brain tissue. NSCs have the potential for differentiation and proliferation ...

Development of a Refined Protocol for Trans-scleral Subretinal Transplantation of Human Retinal Pigment Epithelial Cells into Rat Eyes

Utveckling av ett raffinerat protokoll för Trans-skleral Subretinal Transplantation av mänskliga Retinal Pigment epitelceller i råtta ögon

Degenerative retinal diseases such as age-related macular degeneration (AMD) are the leading cause of irreversible vision loss worldwide. AMD is ...