Name: isolation of mouse salivary gland stem cells
Uploaded: 2011-02-08T18:00:00
Duration: 9 min 52 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Mouse Salivary Gland Stem Cells at JoVE.com

1. Regent Voorbereiding <ol><li> Buffer: 1% (w / v) bovine serum albumine in gebalanceerde zoutoplossing Hank&#39;s </li><li> Reconstrueren enzymen. Hyaluronidase enzym: 40 mg / ml, opgelost in buffer. Collagenase II: 23 mg / ml, opgelost in buffer. Gebruik vers bereide oplossingen enzym vers voor elke isolatie. Toen opgelost, bewaren bij 4 ° C tot gebruik voor de spijsvertering. </li><li> 50 mM calciumchloride in gedestilleerd water. Filter steriliseren door een 0,2 uM poriegrootte filter. </li><li> Muis speekselklier (MSG) cultuur medium: DMEM: F12 met penicilline (100 IU / ml), streptomycine (100 ug / ml), Glutamax (2 mM), epidermale groeifactor-2 (20 ng / ml), fibroblast groeifactor -2 (20 ng / ml), N2 supplement (1%), insuline (10 ug / ml) en dexamethason (1 uM). </li></ol> 2. Mechanische en enzymatische Tissue Spijsvertering <ol><li> Weeg de ontleed speekselklieren. </li><li> Hak klieren in een homogene pulp met gebruikmaking van steriele gebogen dissectie schaar in een kleine petrischaal. </li><li> Verzamel gehakt weefsel in 14 ml buizen, met behulp van 1 ml van de buffer per 80 mg submandibulaire weefsel. Spoel de petrischaaltjes schoon van weefsel met behulp van een aantal van de buffer. </li><li> Voeg nog een 1 ml buffer per 80 mg weefsel, gevolgd door 25 pi collagenase II enzymoplossing, 25 il hyaluronidase enzymoplossing en 250 uL calciumchloride oplossing per 80 mg weefsel. Als het werken met grote hoeveelheden weefsel, op een steenworp 2,4 tot 2,9 kan worden uitgevoerd in T25 weefselkweek flessen voor het gemak. </li><li> Incubeer in een schuddend waterbad ingesteld op 37 ° C gedurende 20 minuten. Verwijder de buizen en vermaal met een pipet om grondig te mengen enzym door het weefsel opnieuw. </li><li> Vervang in waterbad voor nog eens 20 minuten. </li><li> Verzamel materiaal door middel van centrifugatie bij 400 xg, 8 minuten. Gooi supernatant. </li><li> Resuspendeer in 2 mL buffer voor elke 80 mg weefsel, en herhaal enzym en calciumchloride aanvulling als hierboven. Incubeer 20 minuten in schudwaterbad. Verwijder de buizen en vermaal met een pipet om grondig te mengen enzymen. </li><li> Incubeer voor de laatste 20 minuten in schudwaterbad. Verzamel cellen door centrifugeren, zoals hierboven, gooi supernatant. </li></ol> 3. Wasstappen <ol><li> Resuspendeer elk 80 mg van het weefsel in 2 mL buffer en pipet aan het weefsel vrij van enzymen te wassen. </li><li> Centrifuge, zoals eerder te verzamelen. Gooi supernatant. </li><li> Herhaal wassen met behulp van een mL buffer per 80 mg weefsel. Centrifuge te verzamelen, supernatant weggooien. </li></ol> 4. Filteren <ol><li> Resuspendeer weefsel oplossing in 1 ml buffer per 80 mg weefsel. </li><li> Voeg oplossing tot 100 urn poriegrootte filter geplaatst over 50 ml Falcon buis. Niet van toepassing meer dan 3 ml van gehakt weefsel oplossing per kolom, zoals filters verstopt kunnen raken. Laat sijpelen door. Verwijder gefilterd materiaal opknoping aan de onderkant van het filter met een pipet, en toe te voegen aan filtraat. </li><li> Gebruik injectiespuit met 26 gauge naald te filtraat te nemen van 50 ml buizen en tot 50 urn poriegrootte filters op 5 ml buizen toe te passen. Laat filteren door middel van, helpen door het losdraaien van deksels indien nodig. </li><li> Centrifugebuizen zoals eerder te verzamelen. Gooi supernatant. </li></ol> 5. Plating-en Kleinbedrijf <ol><li> Combineer alle pellets in een volume. Tellen met behulp van geautomatiseerde cel-counter of hemocytometer. </li><li> Plaat cellen op dichtheid van 0,4 x 10 6 cellen per putje van 12-well plaat, of 2,67 x 10 6 cellen per T25 weefselkweek kolf. Voeg 1 mL MSG medium aan elk putje of 6 mL aan elke T25 fles. </li><li> Incubeer bij 37 ° C. Bollen moet duidelijk zichtbaar zijn op dag 2. </li></ol> 6. Representatieve resultaten: Na twee tot drie dagen in cultuur, zullen kleine aggregaten van cellen (salispheres) blijken in de culturen. Salispheres zal blijven in omvang te groeien in een periode van tien dagen in cultuur. Vertegenwoordiger van fase contrast microscopie beelden van salispheres zijn weergegeven in figuur 1. Delende cellen die stamcel-geassocieerde marker eiwitten kunnen worden geïsoleerd uit deze sferen, optimaal tussen de dagen 3-5 na de isolatie, en zijn in staat van differentiatie in functionele, speeksel produceren acinaire cellen. <img src="/files/ftp_upload/2484/2484fig1.jpg" alt="Figuur 1" /> Figuur 1. Salisphere vorming in vitro. Na de mechanische en enzymatische vertering met behulp van het huidige protocol, kan sferen van toenemende grootte te vinden in de zwevende culturen. Panelen zijn representatief voor fase-contrast-microscopie beelden van de bollen van dag 0 (A), 4 (B), 7 (C) en 10 (D). Schaalbalk = 50 pm.

<ol>
	<li>Vissink, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral+Sequelae+of+Head+and+Neck+Radiotherapy.">Oral Sequelae of Head and Neck Radiotherapy.</a> Crit Rev Oral Biol Med. 14, 199-212 (2003).</li><li>Nape&amp;ntilde, a. s., J, J., Brennan, M. T., Fox, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnosis+and+treatment+of+xerostomia+(dry+mouth).">Diagnosis and treatment of xerostomia (dry mouth).</a> Odontology. 97, 76-83 (2009).</li><li>Denny, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parenchymal+cell+proliferation+and+mechanisms+for+maintenance+of+granular+duct+and+acinar+cell+populations+in+adult+male+mouse+submandibular+gland.">Parenchymal cell proliferation and mechanisms for maintenance of granular duct and acinar cell populations in adult male mouse submandibular gland.</a> 235, 475-485 (2005).</li><li>Man, Y. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistence+of+a+perinatal+cellular+phenotype+in+submandibular+glands+of+adult+rat.">Persistence of a perinatal cellular phenotype in submandibular glands of adult rat.</a> J. Histochem. Cytochem. 43, 1203-1215 (1995).</li><li>Cotroneo, E., Proctor, G. B., Carpenter, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+acinar+cells+following+ligation+of+rat+submandibular+gland+retraces+the+embryonic-perinatal+pathway+of+cytodifferentiation.">Regeneration of acinar cells following ligation of rat submandibular gland retraces the embryonic-perinatal pathway of cytodifferentiation.</a> Differentiation. 79, 120-130 (2010).</li><li>Eirew, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+quantifying+normal+human+mammary+epithelial+stem+cells+with+in+vivo+regenerative+ability.">A method for quantifying normal human mammary epithelial stem cells with in vivo regenerative ability.</a> Nat Med. 14, 1384-1389 (2008).</li><li>Gorjup, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glandular+tissue+from+human+pancreas+and+salivary+gland+yields+similar+stem+cell+populations.">Glandular tissue from human pancreas and salivary gland yields similar stem cell populations.</a> European Journal of Cell Biology. 88, 409-421 (2009).</li><li>Alonso, L., Fuchs, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells+of+the+skin+epithelium.">Stem cells of the skin epithelium.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 11830-11835 (2003).</li><li>Lombaert, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rescue+of+salivary+gland+function+after+stem+cell+transplantation+in+irradiated+glands.">Rescue of salivary gland function after stem cell transplantation in irradiated glands.</a> Plos One. 3, e2063-e2063 (2008).</li><li>Coppes, R. P., Goot, A. v. a. n. d. e. r., Lombaert, I. M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+Cell+Therapy+to+Reduce+Radiation-Induced+Normal+Tissue+Damage.">Stem Cell Therapy to Reduce Radiation-Induced Normal Tissue Damage.</a> Seminars in Radiation Oncology. 19, 112-121 (2009).</li></ol>

De weefselkweek hier beschreven methode is een reproduceerbaar protocol voor de isolatie van stamcellen-bevattende salispheres uit de speekselklieren van muizen. Studies met behulp van cellen die geïsoleerd op deze manier hebben gewezen op de regeneratieve capaciteit van de speekselklier stamcellen 9. Transplantatie van honderd van de c-Kit + cellen, afkomstig van de salispheres geïnduceerde functionele herstel van bestraalde muis speekselklieren. Deze gegevens zijn spannend en bieden een uitgangspunt voor het onderzoek van de stam-cel-gebaseerde therapie voor xerostomie. Veel wegen nog moet echter worden onderzocht, inclusief de volledige marker-eiwit expressie profiel van de stamcellen, het vermogen van submandibulaire klieren aan de functie van bestraalde parotis speekselklieren en vice versa te redden, en de karakterisering van de vermeende in vivo stamcellen niche van de cellen. Uiteindelijk is de vertaling van dit protocol om menselijk weefsel monsters en de daaropvolgende potentieel voor de behandeling van xerostomie in menselijke patiënten met behulp van de geïsoleerde cellen is de meest opwindende toepassing van de beschreven methode.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Hyaluronidase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>H3506</td>
<td>Store at &#x2013; 20 &deg;C</td>
</tr>
<tr>
<td>Collagenase II</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>17101-015</td>
<td>Store at 4 &deg;C</td>
</tr>
<tr>
<td>Epidermal Growth Factor-2</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>E9644</td>
<td>Make a stock of 10 &mu;g / mL in phosphate buffered saline (PBS). Store at &#x2013; 20 &deg;C in single use aliquots.</td>
</tr>
<tr>
<td>Fibroblast Growth Factor-2</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>F0291</td>
<td>Make stock of 25 &mu;g / mL in PBS. Store at &#x2013; 20 &deg;C in single use aliquots.</td>
</tr>
<tr>
<td>N2 supplement</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>17502-048</td>
<td>As manufacturer instructions.</td>
</tr>
<tr>
<td>Insulin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>I6634</td>
<td>Make stock of 2 mg / mL in tap water. Adjust water to pH 2-3 using glacial acetic acid prior to dissolving.</td>
</tr>
<tr>
<td>Dexamethasone</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>D4902</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>100 &mu;M pore-size sterile cell strainers</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Falcon</td>
<td>352360</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Polystyrene round-bottomed tubes with cell strainer caps (50 &mu;M pore size)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Falcon</td>
<td>352235</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

isolation of mouse salivary gland stem cells

Ouder speekselklieren van zowel mens en muis oorsprong bestaan ​​uit een minimum van vijf celtypen, die elk de productie en de uitscheiding van speeksel vergemakkelijkt in de mondholte. Sereuze en slijmvliezen acinaire cellen zijn de eiwit en slijmvliezen produceren de fabrieken van de klier respectievelijk, en vertegenwoordigen de herkomst van de speekselproductie. Eenmaal gesynthetiseerd, worden de verschillende enzymatische en andere eiwitachtige componenten van speeksel uitgescheiden door middel van een serie van ductale cellen die epitheliale-type morfologie, tot de uiteindelijke verdrijving van het speeksel door middel van een grote buis in de holte van de mond. De samenstelling van het speeksel is ook aangepast door de ductale cellen tijdens dit proces. In de manifestatie van ziekten zoals het syndroom van Sjögren, en in sommige klinische situaties zoals radiotherapie de behandeling van hoofd-halskanker, speeksel productie door de klieren wordt drastisch verminderd 1,2. De resulterende xerostomie, een subjectief gevoel van een droge mond, beïnvloedt niet alleen het vermogen van de patiënt om te slikken en spreken, maar ook stimuleert de ontwikkeling van tandcariës en kan worden sociaal invaliderend voor de patiënt. De restauratie van speeksel productie in de bovengenoemde klinische aandoeningen is dan ook een onbeantwoorde een klinische noodzaak, en als zodanig een aantal studies hebben aangetoond dat de regeneratieve capaciteit van de speekselklieren 3-5. Naar aanleiding van het isolement van stamcel-achtige populaties van cellen van verschillende weefsels in de muis en het menselijk lichaam 6-8, hebben we laten zien met behulp van de beschreven methode die stamcellen geïsoleerd uit muizen speekselklieren kan worden gebruikt om de speekselproductie in bestraalde speekselklieren te redden klieren 9,10. Deze ontdekking maakt de weg vrij voor de ontwikkeling van stamcel-gebaseerde therapieën voor de behandeling van xerostomic aandoeningen bij mensen, en ook voor de verkenning van de speekselklier als een micro-omgeving bevat cellen met multipotente zelfvernieuwende mogelijkheden.

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Mouse Salivary Gland Stem Cells at JoVE.com

Isolation of Mouse Salivary Gland Stem Cells

Een geoptimaliseerde protocol voor de isolatie van stamcellen van de muis speekselklier wordt beschreven. De methode maakt gebruik van enzymatische en mechanische spijsvertering, en laat de isolatie van salispheres met cellen met kenmerken van stamcellen.

Isolatie van Mouse speekselklier Stem Cells

Mature salivary glands of both human and mouse origin comprise a minimum of five cell types, each of which facilitates the production and excretion of ...

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells (HSCs)

Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells HSCs

Isolatie en transplantatie van hematopoietische stamcellen (HSC)

Isolation and Derivation of Mouse Embryonic Germinal Cells

Isolatie en Afleiding van muis embryonale cellen Germinal

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental ...

Isolation of Stem Cells from Human Pancreatic Cancer Xenografts

Isolatie van stamcellen uit menselijke pancreaskanker xenotransplantaten

Cancer stem cells (CSCs) have been identified in a growing number of malignancies and are functionally defined by their ability to undergo self-renewal ...

Isolation of Retinal Stem Cells from the Mouse Eye

Isolatie van het netvlies stamcellen van de muis Eye

The adult mouse retinal stem cell (RSC) is a rare quiescent cell found within the ciliary epithelium (CE) of the mammalian eye1,2,3. The CE is made up of ...

Isolation &#38; Characterization of Hoechstlow CD45negative Mouse Lung Mesenchymal Stem Cells

Isolation & Characterization of Hoechstlow CD45negative Mouse Lung Mesenchymal Stem Cells

Isolatie &amp; Karakterisering van Hoechst Lage CD45 Negatief Muis Lung Mesenchymale stamcellen

Tissue resident mesenchymal stem cells (MSC) are important regulators of tissue repair or regeneration, fibrosis, inflammation, angiogenesis and tumor ...

Isolation of Basal Cells and Submucosal Gland Duct Cells from Mouse Trachea

Isolatie van basale cellen en Submucosale Gland Duct Cellen van Mouse Luchtpijp

The large airways are directly in contact with the environment and therefore susceptible to injury from toxins and infectious agents that we breath in 1. ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

Generatie van Muizen Afgeleid van geïnduceerde pluripotente stamcellen

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

Genetic Modification and Recombination of Salivary Gland Organ Cultures

Genetische Modificatie en recombinatie van speekselklier Orgel culturen

Branching  morphogenesis occurs during the development of many organs, and the embryonic  mouse submandibular gland (SMG) is a classical model for the ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Inductie en analyse van epitheliale naar mesenchymale transitie

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Isolation, Culture, and Transplantation of Muscle Satellite Cells

Isolatie, Cultuur en Transplantatie van Muscle satelliet-cellen

Muscle satellite cells are a stem cell population required for postnatal skeletal muscle development and regeneration, accounting for 2-5% of sublaminal ...