Name: isolation of mouse salivary gland stem cells
Uploaded: 2011-02-08T18:00:00
Duration: 9 min 52 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Mouse Salivary Gland Stem Cells at JoVE.com

1. ריג&#39;נט הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הצפת: 1% (w / v) בסרום שור אלבומין תמיסת מלח מאוזנת של האנק </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אנזימים מחדש. אנזים Hyaluronidase: 40 מג / מ&quot;ל, מומס חיץ. Collagenase II: 23mg / mL, מומס חיץ. השתמש טרי פתרונות אנזים מוכן טרי בידוד כל אחד. כאשר מומס, לאחסן ב 4 ° C עד השימוש לעיכול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 50 mM סידן כלוריד במים מזוקקים. סנן לעקר דרך פילטר בגודל 0.2 UM הנקבוביות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עכבר בלוטת הרוק (MSG) בינוני תרבות: DMEM: F12 עם פניצילין (100 IU / mL), סטרפטומיצין (100 מיקרוגרם / מ&quot;ל), glutamax (2 מ&quot;מ), גידול אפידרמיס גורם-2 (20 ng / mL), גורם הגדילה פיברובלסטים אינסולין -2 (20 ng / mL), N2 תוספת (1%), (10 מיקרוגרם / מ&quot;ל) ו dexamethasone (1 מיקרומטר). </li></ol> 2. רקמות מכונות עיכול אנזימתי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשקול את בלוטות הרוק גזור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קוצצים בלוטות לתערובת הומוגנית באמצעות מספריים סטרילי לנתיחה מעוקל בצלחת פטרי קטנות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף רקמות טחון ב 14 צינורות מ&quot;ל, באמצעות 1mL של חיץ לכל רקמה submandibular 80mg. שוטפים את בצלחות פטרי נקי של רקמה בעזרת כמה למאגר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מ&quot;ל של חיץ לכל רקמה 80 מ&quot;ג, ואחריו פתרון אנזים 25 μL II collagenase, 25 פתרון μL אנזים hyaluronidase ו 250 סידן כלוריד μL פתרון לכל רקמה 80 מ&quot;ג. אם עובדים עם כמויות גדולות של רקמה, צעדים 2.4-2.9 ניתן לבצע T25 תרבות צלוחיות רקמות לנוחות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדגירים את waterbath רועד להגדיר 37 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות. הסר צינורות triturate ידי פיפטה לתערובת אנזים ביסודיות דרך רקמות שוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף ב waterbath לעוד 20 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף רקמה על ידי צנטריפוגה ב XG 400, למשך 8 דקות. בטל supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend במאגר 2 מ&quot;ל של כל רקמות 80 מ&quot;ג, ולחזור האנזים סידן כלוריד בנוסף לעיל. דגירה 20 דקות באמבט מים רועד. הסר צינורות triturate ידי פיפטה לערבב אנזימים ביסודיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה של 20 דקות האחרון רועד אמבט מים. איסוף תאים על ידי צנטריפוגה לעיל, להשליך supernatant. </li></ol> 3. כביסה שלבים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend כל 80 מ&quot;ג של רקמות החיץ 2 מ&quot;ל ו פיפטה לשטוף רקמה חופשית של אנזימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה כמו בעבר לאסוף. בטל supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על לשטוף באמצעות חיץ 1 מ&quot;ל לכל רקמה 80 מ&quot;ג. צנטריפוגה לאסוף, להשליך supernatant. </li></ol> 4. סינון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend פתרון רקמות החיץ 1 מ&quot;ל לכל רקמה 80 מ&quot;ג. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת הפתרון לסינון 100 מיקרומטר נקבוביות בגודל ממוקמים מעל הצינור פלקון 50 מ&quot;ל. אין ליישם יותר מ -3 MLS של פתרון רקמות טחון לכל עמודה, כמו מסנני עלול להיחסם. אפשר לחלחל. הסרת חומר מסונן תלוי התחתון של סינון לפי פיפטה, ומוסיפים תסנין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במזרק עם מחט 26 מד לקחת תסנין מ 50 מ&quot;ל צינורות חלים 50 מיקרומטר מסננים גודל הנקבוביות על 5 צינורות מ&quot;ל. אפשר לסנן דרך, סיוע על ידי שחרור מכסים במידת הצורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צינורות צנטריפוגה כמו בעבר לאסוף. בטל supernatant. </li></ol> 5. ציפוי ובינוניים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים את כל הגרגרים לתוך בכרך אחד. ספירה באמצעות מונה תא haemocytometer אוטומטיות או. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים פלייט בצפיפות של 0.4 x 10 6 תאים לכל גם צלחת 12 היטב, או 2.67 x 10 6 תאים לכל בקבוק T25 בתרבית רקמה. הוסף 1 מ&quot;ל MSG בינוני עד טוב כל או 6 מ&quot;ל ל T25 כל בקבוק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדגור על 37 ° C. Spheres צריך להיות לעין ביום 2. </li></ol> 6. נציג תוצאות: אחרי יומיים שלושה בתרבות, אגרגטים של תאים קטנים (salispheres) יהיה ניכר התרבויות. Salispheres ימשיך לגדול בגודל על פני תקופה של עשרה ימים בתרבות. נציג בניגוד לשלב תמונות של מיקרוסקופיה salispheres מוצגים באיור 1. התאים מתרבים להביע תא גזע חלבונים הקשורים הסמן יכול להיות מבודד בתחומים אלה, בצורה אופטימלית בין בידוד 3-5 שלאחר ימים, ומסוגלים הבחנה לתוך תפקודית, רוק לייצר תאים acinar. <img src="/files/ftp_upload/2484/2484fig1.jpg" alt="איור 1" /> באיור 1. היווצרות Salisphere במבחנה. בעקבות עיכול מכני אנזימטיות באמצעות פרוטוקול הנוכחי, תחומי הגדלת גודל ניתן למצוא בתרבויות צף. לוחות מייצגים בניגוד שלב מיקרוסקופיה תמונות של תחומים מהימים 0 (א), 4 (ב), 7 (ג) ו 10 (ד). בר סולם = 50 מיקרומטר.

<ol>
	<li>Vissink, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral+Sequelae+of+Head+and+Neck+Radiotherapy.">Oral Sequelae of Head and Neck Radiotherapy.</a> Crit Rev Oral Biol Med. 14, 199-212 (2003).</li><li>Nape&amp;ntilde, a. s., J, J., Brennan, M. T., Fox, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnosis+and+treatment+of+xerostomia+(dry+mouth).">Diagnosis and treatment of xerostomia (dry mouth).</a> Odontology. 97, 76-83 (2009).</li><li>Denny, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parenchymal+cell+proliferation+and+mechanisms+for+maintenance+of+granular+duct+and+acinar+cell+populations+in+adult+male+mouse+submandibular+gland.">Parenchymal cell proliferation and mechanisms for maintenance of granular duct and acinar cell populations in adult male mouse submandibular gland.</a> 235, 475-485 (2005).</li><li>Man, Y. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistence+of+a+perinatal+cellular+phenotype+in+submandibular+glands+of+adult+rat.">Persistence of a perinatal cellular phenotype in submandibular glands of adult rat.</a> J. Histochem. Cytochem. 43, 1203-1215 (1995).</li><li>Cotroneo, E., Proctor, G. B., Carpenter, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+acinar+cells+following+ligation+of+rat+submandibular+gland+retraces+the+embryonic-perinatal+pathway+of+cytodifferentiation.">Regeneration of acinar cells following ligation of rat submandibular gland retraces the embryonic-perinatal pathway of cytodifferentiation.</a> Differentiation. 79, 120-130 (2010).</li><li>Eirew, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+quantifying+normal+human+mammary+epithelial+stem+cells+with+in+vivo+regenerative+ability.">A method for quantifying normal human mammary epithelial stem cells with in vivo regenerative ability.</a> Nat Med. 14, 1384-1389 (2008).</li><li>Gorjup, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glandular+tissue+from+human+pancreas+and+salivary+gland+yields+similar+stem+cell+populations.">Glandular tissue from human pancreas and salivary gland yields similar stem cell populations.</a> European Journal of Cell Biology. 88, 409-421 (2009).</li><li>Alonso, L., Fuchs, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells+of+the+skin+epithelium.">Stem cells of the skin epithelium.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 11830-11835 (2003).</li><li>Lombaert, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rescue+of+salivary+gland+function+after+stem+cell+transplantation+in+irradiated+glands.">Rescue of salivary gland function after stem cell transplantation in irradiated glands.</a> Plos One. 3, e2063-e2063 (2008).</li><li>Coppes, R. P., Goot, A. v. a. n. d. e. r., Lombaert, I. M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+Cell+Therapy+to+Reduce+Radiation-Induced+Normal+Tissue+Damage.">Stem Cell Therapy to Reduce Radiation-Induced Normal Tissue Damage.</a> Seminars in Radiation Oncology. 19, 112-121 (2009).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

השיטה המתוארת כאן בתרבית רקמה מייצג פרוטוקול לשחזור עבור בידוד של התא המכיל גזע salispheres מ בלוטות הרוק של עכברים. מחקרים באמצעות תאים מבודדים בצורה זו הדגישו את יכולת ההתחדשות של בלוטת הרוק בתאי גזע 9. השתלה של 100 של c-Kit + בתאים שמקורם salispheres המושרה התאוששות תפקודית של בלוטות הרוק עכבר מוקרן. נתונים אלה מרגש לספק נקודת התחלה עבור החקירה של טיפול בתאי גזע מבוסס על xerostomia. אפיקים רבים להישאר כדי להיחקר עם זאת, כולל את פרופיל ביטוי מלא חלבון סמן של בתאי גזע, היכולת של בלוטות submandibular להציל את תפקוד בלוטות הרוק הפרוטיד מוקרן ולהיפך, ואת האפיון של המשוערת בנישה של תא גזע vivo התאים. בסופו של דבר, את התרגום של פרוטוקול זה דגימות רקמה אנושית ואת הפוטנציאל הבאים לטיפול של xerostomia בחולים אנושיים באמצעות תאים מבודדים הוא היישום המלהיב ביותר של השיטה המתוארת.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Hyaluronidase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>H3506</td>
<td>Store at &#x2013; 20 &deg;C</td>
</tr>
<tr>
<td>Collagenase II</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>17101-015</td>
<td>Store at 4 &deg;C</td>
</tr>
<tr>
<td>Epidermal Growth Factor-2</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>E9644</td>
<td>Make a stock of 10 &mu;g / mL in phosphate buffered saline (PBS). Store at &#x2013; 20 &deg;C in single use aliquots.</td>
</tr>
<tr>
<td>Fibroblast Growth Factor-2</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>F0291</td>
<td>Make stock of 25 &mu;g / mL in PBS. Store at &#x2013; 20 &deg;C in single use aliquots.</td>
</tr>
<tr>
<td>N2 supplement</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>17502-048</td>
<td>As manufacturer instructions.</td>
</tr>
<tr>
<td>Insulin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>I6634</td>
<td>Make stock of 2 mg / mL in tap water. Adjust water to pH 2-3 using glacial acetic acid prior to dissolving.</td>
</tr>
<tr>
<td>Dexamethasone</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>D4902</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>100 &mu;M pore-size sterile cell strainers</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Falcon</td>
<td>352360</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Polystyrene round-bottomed tubes with cell strainer caps (50 &mu;M pore size)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Falcon</td>
<td>352235</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

isolation of mouse salivary gland stem cells

בלוטות הרוק הן מבוגרות ממוצא אנושי עכבר מהווים מינימום של חמישה סוגי תאים, שכל אחד מהם מאפשר ייצור והפרשה של הרוק לחלל הפה. תאים acinar הצפק ו רירי הם חלבונים מפעלים לייצור הרירי של בלוטת בהתאמה, המייצגים את מקורו של ייצור הרוק. מסונתז פעם, המרכיבים השונים proteinaceous האנזימטית אחרים של רוק מופרשים דרך סדרה של תאים אפיתל ductal נושאות מסוג מורפולוגיה, עד הגירוש הסופי של הרוק דרך צינור אחד גדול לתוך חלל הפה. הרכב הרוק הוא שונה גם על ידי תאים ductal במהלך תהליך זה. בשנת ביטוי של מחלות כגון תסמונת סיוגרן, ובכמה מצבים קליניים כגון טיפול הקרנות לסרטן הראש והצוואר, ייצור רוק על ידי בלוטות מצטמצם באופן דרמטי 1,2. Xerostomia וכתוצאה מכך, תחושה סובייקטיבית של יובש בפה, משפיע לא רק על היכולת של החולה לבלוע ולדבר, אלא גם מעודדת את התפתחות עששת שיניים יכול להיות מתיש חברתית הסובל. שיקום ייצור הרוק הנ&quot;ל תנאים קליניים ולכן מהווה צורך קליני מסופקים, וכן מספר מחקרים כאלה הוכיחו את יכולת ההתחדשות של בלוטות הרוק 3-5. בהמשך בידודה של דמוי תא גזע אוכלוסיות של תאים מרקמות שונות בתוך העכבר גופות אדם 6-8, הראינו באמצעות השיטה המתוארת כי תאי גזע שבודדו בלוטות הרוק העכבר יכול לשמש כדי להציל את ייצור הרוק הרוק מוקרן בלוטות 9,10. תגלית זו סוללת את הדרך לפיתוח טיפולים מבוססי תאים גזע לטיפול התנאים xerostomic בבני אדם, וגם חקר של בלוטת הרוק כמו microenvironment המכילה תאים בעלי יכולת חידוש עצמי multipotent.

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Mouse Salivary Gland Stem Cells at JoVE.com

Isolation of Mouse Salivary Gland Stem Cells

פרוטוקול אופטימיזציה עבור בידוד של בתאי גזע מבלוטת הרוק עכבר מתואר. שיטה מעסיקה עיכול אנזימטי מכני, והיתרי הבידוד של salispheres המכילה תאים בעלי מאפיינים של בתאי גזע.

בידוד של בלוטת הרוק עכבר תאים גזע

Mature salivary glands of both human and mouse origin comprise a minimum of five cell types, each of which facilitates the production and excretion of ...

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells (HSCs)

Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells HSCs

בידוד והשתלות של בתאי גזע hematopoietic (HSCs)

Isolation and Derivation of Mouse Embryonic Germinal Cells

בידוד גזירת תאים עובריים בעכבר ז&#39;רמינל

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental ...

Isolation of Stem Cells from Human Pancreatic Cancer Xenografts

בידוד של בתאי גזע xenografts סרטן הלבלב האנושי

Cancer stem cells (CSCs) have been identified in a growing number of malignancies and are functionally defined by their ability to undergo self-renewal ...

Isolation of Retinal Stem Cells from the Mouse Eye

בידוד של גזע תאים רשתית העין של העכבר

The adult mouse retinal stem cell (RSC) is a rare quiescent cell found within the ciliary epithelium (CE) of the mammalian eye1,2,3. The CE is made up of ...

Isolation &#38; Characterization of Hoechstlow CD45negative Mouse Lung Mesenchymal Stem Cells

Isolation & Characterization of Hoechstlow CD45negative Mouse Lung Mesenchymal Stem Cells

בידוד &amp; אפיון Hoechst נמוך CD45 שלילי עכבר mesenchymal ריאות בתאי גזע

Tissue resident mesenchymal stem cells (MSC) are important regulators of tissue repair or regeneration, fibrosis, inflammation, angiogenesis and tumor ...

Isolation of Basal Cells and Submucosal Gland Duct Cells from Mouse Trachea

בידוד של תאי בסיס ותאי בלוטת Duct Submucosal מעכבר קנה נשימה

The large airways are directly in contact with the environment and therefore susceptible to injury from toxins and infectious agents that we breath in 1. ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

דור של עכברים שמקורם בתאי גזע pluripotent מושרים

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

Genetic Modification and Recombination of Salivary Gland Organ Cultures

שינוי ורקומבינציה גנטי של תרבויות איברי בלוטות רוק

Branching  morphogenesis occurs during the development of many organs, and the embryonic  mouse submandibular gland (SMG) is a classical model for the ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

אינדוקציה וניתוח של אפיתל לmesenchymal מעבר

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Isolation, Culture, and Transplantation of Muscle Satellite Cells

בידוד, תרבות והשתלה של תאי לווין שריר

Muscle satellite cells are a stem cell population required for postnatal skeletal muscle development and regeneration, accounting for 2-5% of sublaminal ...