Name: isolation of mouse salivary gland stem cells
Uploaded: 2011-02-08T18:00:00
Duration: 9 min 52 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Mouse Salivary Gland Stem Cells at JoVE.com

1. Reggente di preparazione <ol><li> Buffer: 1% (w / v) di BSA in soluzione salina bilanciata di Hank </li><li> Ricostituire enzimi. Enzima ialuronidasi: 40 mg / mL, sciolta in tampone. Collagenasi II: 23mg / ml, sciolta in tampone. Usa appena soluzioni enzima preparato fresco per ogni isolamento. Quando sciolto, conservare a 4 ° C fino all&#39;utilizzo per la digestione. </li><li> 50 mM di cloruro di calcio in acqua distillata. Filtrare attraverso un filtro sterilizzare 0,2 uM dimensione dei pori. </li><li> Topo ghiandola salivare (MSG) terreno di coltura: DMEM: F12 con penicillina (100 UI / ml), streptomicina (100 mg / ml), glutamax (2 mm), fattore di crescita epidermico-2 (20 ng / mL), il fattore di crescita dei fibroblasti -2 (20 ng / mL), N2 supplemento (1%), l&#39;insulina (10 mg / mL) e desametasone (1 mM). </li></ol> 2. Tissue Digestione meccanica e enzimatica <ol><li> Pesare le ghiandole salivari sezionato. </li><li> Tritare ghiandole in una polpa omogenea utilizzando forbici sterili dissezione curve in un piccolo piatto di Petri. </li><li> Raccogliere tessuto tritata in 14 mL, utilizzando 1 ml di buffer per 80 mg di tessuto sottomandibolare. Lavare i piatti di Petri pulita di tessuto utilizzando alcuni buffer. </li><li> Aggiungere un altro 1 mL di tampone per 80 mg di tessuto, seguito da 25 microlitri soluzione enzima collagenasi II, 25 microlitri soluzione enzimatica ialuronidasi e 250 microlitri di soluzione di cloruro di calcio per 80 mg di tessuto. Se si utilizzano grandi quantità di tessuto, a pochi passi 2,4-2,9 possono essere eseguite in tessuto fiasche T25 cultura per convenienza. </li><li> Incubare a bagnomaria agitazione a 37 ° C per 20 minuti. Rimuovere i tubi e triturare con pipetta di mescolare accuratamente enzima attraverso il tessuto nuovo. </li><li> Sostituire a bagnomaria per 20 minuti. </li><li> Raccogliere i tessuti per centrifugazione a 400 xg, per 8 minuti. Gettare il surnatante. </li><li> Risospendere in 2 mL di tampone per ogni 80 mg di tessuto, e ripetere enzima e il cloruro di calcio aggiunta come sopra. Incubare 20 minuti in agitazione bagnomaria. Rimuovere i tubi e triturare con pipetta di mescolare accuratamente gli enzimi. </li><li> Incubare per 20 minuti finali in agitazione bagnomaria. Raccogliere le cellule per centrifugazione come sopra, scartare il surnatante. </li></ol> 3. Fasi di lavaggio <ol><li> Risospendere ogni 80 mg di tessuto in 2 mL di tampone e pipetta per lavare il tessuto privo di enzimi. </li><li> Centrifuga come in precedenza per la raccolta. Gettare il surnatante. </li><li> Ripetere il lavaggio con buffer di 1 ml per 80 mg di tessuto. Centrifuga per raccogliere, scartare il surnatante. </li></ol> 4. Filtraggio <ol><li> Risospendere soluzione tessuto in 1 mL di tampone per 80 mg di tessuto. </li><li> Aggiungi soluzione a 100 micron di dimensioni dei pori del filtro posto sopra tubo da 50 ml Falcon. Non applicare più di 3 ml di soluzione di tessuto macinato per colonna, i filtri possono essere bloccati. Permettono di filtrare attraverso. Rimuovere il materiale filtrato appeso inferiore del filtro con la pipetta, ed aggiungere al filtrato. </li><li> Usare siringa con 26 gauge a prendere filtrato dalla 50mL tubi e applicare i filtri a 50 micron dimensione dei pori, il 5 mL. Permettono di filtrare, assistendo allentando coperchi, se necessario. </li><li> Provette da centrifuga come in precedenza per la raccolta. Gettare il surnatante. </li></ol> 5. Placcatura e medie imprese <ol><li> Combina tutti i pellets in un unico volume. Conte con contatore automatico di cellule o emocitometro. </li><li> Cellule germi a densità di 0,4 x 10 6 cellule per pozzetto di 12 pozzetti, o 2,67 x 10 6 cellule per T25 fiasco di coltura tissutale. Aggiungere 1 ml MSG medio in ciascun pozzetto o 6 ml per ogni pallone T25. </li><li> Incubare a 37 ° C. Sfere devono essere chiaramente visibili di giorno 2. </li></ol> 6. Rappresentante dei risultati: Dopo due o tre giorni di cultura, piccoli aggregati di cellule (salispheres) sarà evidente nelle culture. Salispheres continuerà a crescere in dimensioni per un periodo di dieci giorni nella cultura. Rappresentante immagini microscopio a contrasto di fase di salispheres sono mostrati in Figura 1. Le cellule in proliferazione delle cellule staminali che esprimono proteine ​​associate marcatore può essere isolato da questi ambiti, in modo ottimale tra i giorni 3-5 isolamento post, e sono in grado di differenziazione in funzionali, le cellule acinari saliva produce. <img src="/files/ftp_upload/2484/2484fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Salisphere formazione in vitro. A seguito di digestione meccanica ed enzimatica utilizzando il protocollo attuale, sfere di dimensioni crescenti si possono trovare nelle culture galleggiante. I pannelli sono rappresentative immagini microscopio a contrasto di fase di sfere dai giorni 0 (A), 4 (B), 7 (C) e 10 (D). Barra di scala = 50 micron.

<ol>
	<li>Vissink, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral+Sequelae+of+Head+and+Neck+Radiotherapy.">Oral Sequelae of Head and Neck Radiotherapy.</a> Crit Rev Oral Biol Med. 14, 199-212 (2003).</li><li>Nape&amp;ntilde, a. s., J, J., Brennan, M. T., Fox, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnosis+and+treatment+of+xerostomia+(dry+mouth).">Diagnosis and treatment of xerostomia (dry mouth).</a> Odontology. 97, 76-83 (2009).</li><li>Denny, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parenchymal+cell+proliferation+and+mechanisms+for+maintenance+of+granular+duct+and+acinar+cell+populations+in+adult+male+mouse+submandibular+gland.">Parenchymal cell proliferation and mechanisms for maintenance of granular duct and acinar cell populations in adult male mouse submandibular gland.</a> 235, 475-485 (2005).</li><li>Man, Y. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistence+of+a+perinatal+cellular+phenotype+in+submandibular+glands+of+adult+rat.">Persistence of a perinatal cellular phenotype in submandibular glands of adult rat.</a> J. Histochem. Cytochem. 43, 1203-1215 (1995).</li><li>Cotroneo, E., Proctor, G. B., Carpenter, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+acinar+cells+following+ligation+of+rat+submandibular+gland+retraces+the+embryonic-perinatal+pathway+of+cytodifferentiation.">Regeneration of acinar cells following ligation of rat submandibular gland retraces the embryonic-perinatal pathway of cytodifferentiation.</a> Differentiation. 79, 120-130 (2010).</li><li>Eirew, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+quantifying+normal+human+mammary+epithelial+stem+cells+with+in+vivo+regenerative+ability.">A method for quantifying normal human mammary epithelial stem cells with in vivo regenerative ability.</a> Nat Med. 14, 1384-1389 (2008).</li><li>Gorjup, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glandular+tissue+from+human+pancreas+and+salivary+gland+yields+similar+stem+cell+populations.">Glandular tissue from human pancreas and salivary gland yields similar stem cell populations.</a> European Journal of Cell Biology. 88, 409-421 (2009).</li><li>Alonso, L., Fuchs, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells+of+the+skin+epithelium.">Stem cells of the skin epithelium.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 11830-11835 (2003).</li><li>Lombaert, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rescue+of+salivary+gland+function+after+stem+cell+transplantation+in+irradiated+glands.">Rescue of salivary gland function after stem cell transplantation in irradiated glands.</a> Plos One. 3, e2063-e2063 (2008).</li><li>Coppes, R. P., Goot, A. v. a. n. d. e. r., Lombaert, I. M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+Cell+Therapy+to+Reduce+Radiation-Induced+Normal+Tissue+Damage.">Stem Cell Therapy to Reduce Radiation-Induced Normal Tissue Damage.</a> Seminars in Radiation Oncology. 19, 112-121 (2009).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Il metodo di coltura tissutale qui descritto rappresenta un protocollo riproducibile per l&#39;isolamento di cellule staminali contenenti salispheres dalle ghiandole salivari di topi. Gli studi che utilizzano cellule isolate in questo modo hanno evidenziato la capacità rigenerativa delle cellule staminali della ghiandola salivare 9. Il trapianto di un centinaio di c-Kit + cellule derivate dal salispheres indotto il recupero funzionale delle ghiandole salivari di topo irradiati. Questi dati sono entusiasmanti e di fornire un punto di partenza per lo studio della terapia con cellule staminali a base di xerostomia. Molte strade rimangono da esplorare però, compresa la piena profilo di espressione delle proteine ​​marker delle cellule staminali, la capacità delle ghiandole sottomandibolari per salvare la funzione delle ghiandole salivari, parotidi irradiati e viceversa, e la caratterizzazione dei putativi di nicchia delle cellule staminali in vivo di le cellule. In ultima analisi, la traduzione di questo protocollo di campioni di tessuto umano e il potenziale successive per la terapia di xerostomia nei pazienti umani con le cellule isolate è l&#39;applicazione più interessante del metodo descritto.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Hyaluronidase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>H3506</td>
<td>Store at &#x2013; 20 &deg;C</td>
</tr>
<tr>
<td>Collagenase II</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>17101-015</td>
<td>Store at 4 &deg;C</td>
</tr>
<tr>
<td>Epidermal Growth Factor-2</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>E9644</td>
<td>Make a stock of 10 &mu;g / mL in phosphate buffered saline (PBS). Store at &#x2013; 20 &deg;C in single use aliquots.</td>
</tr>
<tr>
<td>Fibroblast Growth Factor-2</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>F0291</td>
<td>Make stock of 25 &mu;g / mL in PBS. Store at &#x2013; 20 &deg;C in single use aliquots.</td>
</tr>
<tr>
<td>N2 supplement</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>17502-048</td>
<td>As manufacturer instructions.</td>
</tr>
<tr>
<td>Insulin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>I6634</td>
<td>Make stock of 2 mg / mL in tap water. Adjust water to pH 2-3 using glacial acetic acid prior to dissolving.</td>
</tr>
<tr>
<td>Dexamethasone</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>D4902</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>100 &mu;M pore-size sterile cell strainers</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Falcon</td>
<td>352360</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Polystyrene round-bottomed tubes with cell strainer caps (50 &mu;M pore size)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Falcon</td>
<td>352235</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

isolation of mouse salivary gland stem cells

Maturo ghiandole salivari di origine umana e topo comprendono un minimo di cinque tipi di cellule, ognuna delle quali facilita la produzione e l&#39;escrezione di saliva nella cavità orale. Cellule acinari sierose e mucose sono le proteine ​​e mucose fabbriche della ghiandola, rispettivamente, e rappresentano l&#39;origine della produzione di saliva. Una volta sintetizzate, le varie componenti enzimatiche e le altre proteica della saliva sono secreti attraverso una serie di cellule epiteliali duttali cuscinetto tipo morfologia, fino alla eventuale espulsione della saliva attraverso un condotto grande nella cavità della bocca. La composizione della saliva è anche modificata dalle cellule duttali durante questo processo. Nella manifestazione di malattie come la sindrome di Sjögren, e in alcune situazioni cliniche come il trattamento di radioterapia per i tumori testa e collo, produzione di saliva da parte delle ghiandole è drasticamente ridotto 1,2. La xerostomia risultante, una sensazione soggettiva di secchezza delle fauci, colpisce non solo la capacità del paziente di deglutire e parlare, ma incoraggia anche lo sviluppo della carie dentale e può essere socialmente debilitanti per il paziente. Il restauro della produzione di saliva in condizioni cliniche di cui sopra rappresenta dunque un bisogno insoddisfatto clinico, e come tali diversi studi hanno dimostrato la capacità di rigenerazione delle ghiandole salivari 3-5. Ulteriormente l&#39;isolamento di cellule staminali simili a popolazioni di cellule provenienti da tessuti diversi all&#39;interno del mouse e corpi umani 6-8, abbiamo dimostrato con il metodo descritto che le cellule staminali isolate dalle ghiandole salivari del mouse può essere utilizzato per salvare la produzione di saliva in salivari irradiati ghiandole 9,10. Questa scoperta apre la strada per lo sviluppo di cellule staminali a base di terapie per il trattamento di condizioni xerostomic negli esseri umani, e anche per l&#39;esplorazione della ghiandola salivare come un microambiente che contengono cellule multipotenti con capacità auto-rigenerante.

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Mouse Salivary Gland Stem Cells at JoVE.com

Isolation of Mouse Salivary Gland Stem Cells

Un protocollo ottimizzato per l&#39;isolamento di cellule staminali dalla ghiandola salivare del mouse è descritto. Il metodo impiega digestione enzimatica e meccanica, e permette l&#39;isolamento di salispheres contenenti cellule con caratteristiche di cellule staminali.

Isolamento di cellule staminali del mouse ghiandole salivari

Mature salivary glands of both human and mouse origin comprise a minimum of five cell types, each of which facilitates the production and excretion of ...

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells (HSCs)

Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells HSCs

Isolamento e trapianto di cellule staminali emopoietiche (CSE)

Ricerca

Biologia

Isolation and Derivation of Mouse Embryonic Germinal Cells

L&#39;isolamento e la derivazione di cellule embrionali del mouse Germinal

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental ...

Isolation of Stem Cells from Human Pancreatic Cancer Xenografts

Isolamento di cellule staminali da xenotrapianti di cancro pancreatico umano

Cancer stem cells (CSCs) have been identified in a growing number of malignancies and are functionally defined by their ability to undergo self-renewal ...

Isolation of Retinal Stem Cells from the Mouse Eye

Isolamento di cellule staminali della retina dalla Eye mouse

The adult mouse retinal stem cell (RSC) is a rare quiescent cell found within the ciliary epithelium (CE) of the mammalian eye1,2,3. The CE is made up of ...

Isolation &#38; Characterization of Hoechstlow CD45negative Mouse Lung Mesenchymal Stem Cells

Isolation & Characterization of Hoechstlow CD45negative Mouse Lung Mesenchymal Stem Cells

Isolamento e caratterizzazione di Hoechst Basso CD45 Negativo Mouse cellule staminali mesenchimali del polmone

Tissue resident mesenchymal stem cells (MSC) are important regulators of tissue repair or regeneration, fibrosis, inflammation, angiogenesis and tumor ...

Isolation of Basal Cells and Submucosal Gland Duct Cells from Mouse Trachea

Isolamento delle cellule basali e sottomucosa cellule del dotto di Gland mouse Trachea

The large airways are directly in contact with the environment and therefore susceptible to injury from toxins and infectious agents that we breath in 1. ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

Generazione di topi derivati ​​da cellule staminali pluripotenti indotte

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

Genetic Modification and Recombination of Salivary Gland Organ Cultures

Modificazione genetica e ricombinazione delle Culture organo ghiandola salivare

Branching  morphogenesis occurs during the development of many organs, and the embryonic  mouse submandibular gland (SMG) is a classical model for the ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Induzione e Analisi dei epiteliale a Mesenchymal Transizione

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Isolation, Culture, and Transplantation of Muscle Satellite Cells

Isolamento, Cultura e trapianto di cellule muscolari satellite

Muscle satellite cells are a stem cell population required for postnatal skeletal muscle development and regeneration, accounting for 2-5% of sublaminal ...