Name: heterokaryon technique for analysis of cell type-specific localization
Uploaded: 2011-03-11T11:00:00
Duration: 9 min 31 s
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Vorremmo ringraziare il Worcester Polytechnic Institute Dipartimento di Chimica e Biochimica per il finanziamento.

1. Trasfezione di linee cellulari Transfection Metodo 1 (Nucleofection Lonza per una maggiore efficienza di trasfezione delle cellule primarie) <ol><li> Le cellule devono essere di passaggio recente e in crescita log fase prima di trasfezione. Lavare le cellule in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) e le cellule raccolta da tripsinizzazione. </li><li> Raccogliere le cellule per centrifugazione a 1500 xg per 5 minuti. </li><li> Aggiungi scivola copertura sterile per un 6-pozzetti. Scivola la copertura può essere rivestita per l&#39;adesione cellulare migliorata. Luogo 1,5 mL di terreni di coltura (in questo caso medio Dulbecco modificato Eagle (DMEM), 10% di siero fetale bovino (FBS)) in ciascun pozzetto ed equilibrare i media nell&#39;incubatrice. </li><li> Raccogliere le cellule tripsinizzazione e risospendere in un volume minimo di tampone fosfato (PBS). </li><li> Contare le celle e centrifugare la giusta quantità di risospensione di fornire ~ 5x10 5 cellule per campione. </li><li> Risospendere le cellule con cura in 100 ul soluzione Nucleofector temperatura ambiente per campione. </li><li> Combina 100 l di sospensione cellulare con 5 mg di DNA plasmidico e trasferimento del campione ad un Cuvette Nucleofector facendo attenzione a non includere bolle d&#39;aria. </li><li> Selezionare il programma appropriato Nucleofector (questo potrebbe richiedere test precedenti di stabilire l&#39;efficienza ottimale di trasfezione con mortalità minima). </li><li> Inserire la cuvetta contenente la cella / DNA sospensione nella portacuvette Nucleofector e avviare il programma selezionato. </li><li> Al termine, rimuovere la cuvetta e aggiungere circa 500 ml di pre-equilibrato terreni di coltura ad esso (tratto dal 6 pozzetti). </li><li> Trasferire immediatamente il campione in 6 pozzetti con volume finale di 1,5 mL per pozzetto. Le cellule devono essere placcato in entrambe le popolazioni miste o separatamente, per i controlli. </li></ol> Trasfezione Metodo 2 (Qiagen trasfezione Effectene per linee cellulari) <ol><li> Preparare complessi trasfezione utilizzando il reagente Qiagen Effectene in primo luogo l&#39;aggiunta di 0,8 mg di ciascun campione di DNA plasmidico a 200 microlitri di buffer CE. </li><li> Aggiungere 6,4 microlitri di reagente enhancer a ciascun campione, miscelare brevemente muovendo il tubo, e incubare per 2 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Aggiungere 20 microlitri di reagente Effectene ad ogni mix campione, muovendo il tubo, e incubare per 15 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Durante questa incubazione, preparare le due linee cellulari di interesse per la trasfezione. Lavare le cellule recentemente diversi passaggi (&lt;80% confluenza), una volta in tampone fosfato (PBS). Aggiungi nuovo mezzo fresco 1,5 ml di crescita equilibrata e riscaldato (in questo caso medio Dulbecco modificato Eagle (DMEM), 10% di siero fetale bovino (FBS)). </li><li> Una volta che i complessi trasfezione hanno incubato per 15 minuti, trasferire 1,2 ml di media per ogni campione. Mescolare pipettando, e trasferire immediatamente ~ 700 ml di complessi a ciascuno dei due pozzi nel 6 pozzetti. Aggiungere goccia a goccia, e mescolare delicatamente facendo roteare il piatto. Consentono alle cellule di trasfezione per almeno 3 ore (può variare con il tipo di cellula). </li><li> Aggiungi scivola copertura sterilizzati ad un nuovo cambio a 6 pozzetti. Scivola la copertura può essere rivestita per l&#39;adesione cellulare migliorata. </li><li> Dopo che le cellule sono transfettate, lavare le cellule due volte con PBS e raccogliere le cellule trysinization minimo con l&#39;aggiunta di circa 100 microlitri soluzione tripsina in ogni pozzetto, agitare brevemente la piastra a cappotto completamente ogni bene, e subito aspirando la tripsina. Una volta che le cellule hanno sollevato, aggiungere 1,5 mL di mezzi freschi. </li><li> A questo punto, le cellule devono essere placcato in popolazioni mista o separata (per i controlli) sul coprioggetto sterili. </li><li> Consentono alle cellule di recuperare per 12 ore. </li></ol> 2. Fusione cellulare <ol><li> Togliere terreni di coltura dalle cellule e lavare due volte con PBS. </li><li> A questo punto, si consiglia di trattare le cellule con cicloesimide (100 mg / ml) per inibire la sintesi proteica. Consentire alle cellule di incubare per 2 ore e poi lavare le cellule due volte con PBS. </li><li> Cellule fusibile esponendoli ad una soluzione del 50% polietilenglicole 1000 (PEG 1000) in DMEM senza siero per 125 secondi a temperatura ambiente. </li><li> Lavare le cellule con PBS per rimuovere la soluzione di PEG 1000, e aggiungere 2 mL appena scaldato e media equilibrata. </li><li> Consentono alle cellule ad incubare per 18 - 24 ore. </li></ol> Microscopia a fluorescenza <ol><li> Rimuovere i terreni di coltura, e lavare le cellule due volte in PBS. </li><li> Fissare le cellule con l&#39;aggiunta di 1 ml di una soluzione di paraformaldeide al 4% (in PBS) in ogni pozzetto. Agitare delicatamente per 15 minuti. </li><li> Lavare le cellule fissate due volte in PBS. </li><li> Rimuovere con cautela il coperchio scivola dalla piastra, stoppino in eccesso PBS. Inverti sul microscopio diapositive caricato con una goccia di mezzo di montaggio (90% glicerolo, 100mM Tris pH 7.5, 2% DABCO (1,4-diazabicoyclo-ottano) contenente DAPI (4 &#39;,6-diamidino-2-fenilindolo). </li><li> Rimuovere l&#39;eccesso di mezzo di montaggio di diapositive, e sigillare cover scivola con smalto. </li><li> Visualizzare le cellule mediante microscopia confocale o epifluorescenza. </li></ol> 3. Rappresentante Risultati La Figura 2 mostra un esperimento heterokaryon esempio utilizzando fibroblasti primari e H1299 non a piccole cellule cellule di carcinoma del polmone. La proteina di interesse in questo esperimento (Anemia di pollo Virus-VP3) mostra la localizzazione citoplasmatica principalmente in tipi di cellule primarie e di localizzazione nucleare in tipi di cellule trasformate come visualizzato mediante microscopia in epifluorescenza. La proteina è espressa come fusione di due GFP (pEGFP-N1 vettore, Clontech) nei fibroblasti prepuzio primaria (PFF) o DsRed (DsRed-N1 vettore, Clontech) nelle cellule H1299. Campioni di controllo che coinvolge auto-fusioni (prime due righe) Display cellule multinucleate con nessun cambiamento nella steady-state modelli di localizzazione. Tali cambiamenti potrebbero altrimenti verificarsi a causa di sensibilità alle condizioni fusione o la formazione di sincizi. Fusioni Heterokaryon (riga in basso) dimostrano ingresso nucleare della GFP-fuso primario derivati ​​dalle cellule e proteine ​​colocalizzazione con la DsRed-proteina fusa in risposta alla introduzione di materiale cellula trasformata. L&#39;esempio mostrato è una fusione heterokaryon relativamente rara risultante da due sole cellule, uno di ogni tipo, come dimostra la presenza di entrambi i segnali fluoroprotein. Oltre a rilevare questi tipi di transizioni di localizzazione, nucleocytoplasmic attività spola possono essere facilmente individuati dalla presenza di un fluoroforo in questi due nuclei. Questo tipo di dosaggio è chiaro in sede di esame 01:01 la fusione di cellule e dipenderà dalla inibizione della traduzione. <img src="/files/ftp_upload/2488/2488fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Diagramma di flusso del metodo heterokaryon utilizzando fibroblasti primari e H1299 non a piccole cellule di carcinoma. Il gene di interesse viene clonato per produrre un telaio in fusione di uno dei due geni delle proteine ​​fluorescenti. Linee cellulari sono poi transitoriamente trasfettate sia con il permesso di costruire e recuperare. Formazione Heterokaryon è indotta dal trattamento breve con polietilene glicole (PEG), seguita da incubazione ulteriormente. Infine, la localizzazione sub-cellulare della proteina di interesse viene osservata utilizzando varie forme di microscopia a fluorescenza. <img src="/files/ftp_upload/2488/2488fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Traffico Nucleocytoplasmic e spola attività della proteina di pollo Anemia Virus VP3 visualizzati da fusione heterokaryon. Riga superiore: immagini rappresentative di auto-H1299 fuso cellule che esprimono DsRed-VP3 fila Oriente:.. Rappresentante immagini epifluorescenza di cellule primarie di fibroblasti prepuzio (PFF) che esprime GFP-VP3 dopo la fusione PEG fila in basso: la fusione Heterokaryon di TFP e H1299 cellule. Giallo indica colocalizzazione di GFP e segnali DsRed. Le cellule sono state ripreso usando una Leica AF6000E microscopio a fluorescenza Leica e software di imaging.

<ol>
	<li>Belaya, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FLIPing+heterokaryons+to+analyze+nucleo-cytoplasmic+shuttling+of+yeast+proteins.">FLIPing heterokaryons to analyze nucleo-cytoplasmic shuttling of yeast proteins.</a> RNA. 12, 921-930 (2006).</li><li>Bhaumik, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+target+of+a+transcriptional+activator+revealed+by+fluorescence+resonance+energy+transfer.">In vivo target of a transcriptional activator revealed by fluorescence resonance energy transfer.</a> Genes Dev. 18, 333-343 (2004).</li><li>Cohen, H. R., Panning, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=XIST+RNA+exhibits+nuclear+retention+and+exhibits+reduced+association+with+the+export+factor+TAP/NXF1.">XIST RNA exhibits nuclear retention and exhibits reduced association with the export factor TAP/NXF1.</a> Chromosoma. 116, 373-383 (2007).</li><li>Gao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dapper1+is+a+nucleoplasmic+shuttling+protein+that+negatively+modulates+Wnt+signaling+in+the+nucleus.">Dapper1 is a nucleoplasmic shuttling protein that negatively modulates Wnt signaling in the nucleus.</a> J. Biol. Chem. 51, 35679-3588 (2008).</li><li>Grespin, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thyroid+Hormone+Receptor+&#945;1+Follows+a+Cooperative+CRM1/Calreticulin-mediated+Nuclear+Export+Pathway.">Thyroid Hormone Receptor &#945;1 Follows a Cooperative CRM1/Calreticulin-mediated Nuclear Export Pathway.</a> J. Biol. Chem. 283, 25576-25588 (2008).</li><li>Heilman, D. W., Teodoro, J. G., Green, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptin+Nucleocytoplasmic+Shuttling+Is+Required+for+Cell+Type-Specific+Localization,+Apoptosis,+and+Recruitment+of+the+Anaphase-Promoting+Complex/Cyclosome+to+PML+Bodies.">Apoptin Nucleocytoplasmic Shuttling Is Required for Cell Type-Specific Localization, Apoptosis, and Recruitment of the Anaphase-Promoting Complex/Cyclosome to PML Bodies.</a> J. Virology. 80, 7535-7545 (2006).</li><li>Jeffries, S., Capobianco, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neoplastic+transformation+by+Notch+requires+nuclear+localization.">Neoplastic transformation by Notch requires nuclear localization.</a> Mol Cell Biol. 20, 3928-3941 (2000).</li><li>Keaton, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleocytoplasmic+trafficking+of+G2/M+regulators+in+yeast.">Nucleocytoplasmic trafficking of G2/M regulators in yeast.</a> Mol. Biol. Cell. 19, 4006-4018 (2008).</li><li>Ling, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear-Cytoplasmic+Shuttling+Is+Not+Required+for+the+Epstein-Barr+Virus+EBNA-LP+Transcriptional+Coactivation+Function.">Nuclear-Cytoplasmic Shuttling Is Not Required for the Epstein-Barr Virus EBNA-LP Transcriptional Coactivation Function.</a> J. Virology. 83, 7109-7116 (2009).</li><li>Lin, X. -. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RXR&#945;+acts+as+a+carrier+for+TR3+nuclear+export+in+a+9-cis+retinoic+acid-dependent+manner+in+gastric+cancer+cells.">RXR&#945; acts as a carrier for TR3 nuclear export in a 9-cis retinoic acid-dependent manner in gastric cancer cells.</a> J. Cell Science. 117, 5609-5621 (2004).</li><li>Vissinga, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+Export+of+NBN+Is+Required+for+Normal+Cellular+Responses+to+Radiation.">Nuclear Export of NBN Is Required for Normal Cellular Responses to Radiation.</a> Mol Cell Biol. 29, 1000-1006 (2009).</li><li>Zimmerman, R. S., Rosenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+p19Arf+localization+accompany+apoptotic+crisis+during+pre-B-cell+transformation+by+Abelson+murine+leukemia+virus.">Changes in p19Arf localization accompany apoptotic crisis during pre-B-cell transformation by Abelson murine leukemia virus.</a> J. Virol. 82, 8383-8391 (2008).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Il protocollo heterokaryon qui presentato fornisce un metodo efficiente e di facile interpretazione per la caratterizzazione di cellule tipo-specifici comportamenti di localizzazione e nucleocytoplasmic attività spola. Questo metodo sfrutta la sensibilità di analisi di fluorescenza e la capacità di cellule immagine dal vivo e di eseguire studi di dinamica delle proteine. La tecnica si adatta facilmente a molti tipi di cellule diverse, ed è suscettibile di produrre immagini di cellule in vivo e fissati. Per esempio, invertito microscopia a fluorescenza può essere utilizzato per l&#39;imaging dal vivo e lapse video in tempo. Al contrario, le cellule montate possono essere utilizzate sia in epifluorescenza per la determinazione dello stato stazionario localizzazioni o più dettagliate di imaging confocale di localizzazioni discreti. Inoltre, le tecniche come il recupero di fluorescenza dopo photobleaching (FRAP), o la perdita di fluorescenza in photobleaching (FLIP) può essere utilizzato nella determinazione della cinetica di localizzazione 1. L&#39;incorporazione di fluorofori si alternano nel protocollo permetterebbe di esperimenti di interazione di proteine ​​come il trasferimento di energia di risonanza di fluorescenza (FRET) da svolgere in concerto 2. Vari inibitori del traffico di cellulari come B leptomycin o dominante negativo costruisce GTPasi Ran può essere utilizzato per stabilire la dipendenza da particolari importazioni o esportazioni percorsi 5,6,9. <ul><li> In certi esperimenti che coinvolgono la spola attività, bisogna fare attenzione per evitare gli effetti di localizzazione grazie alla sintesi di nuove proteine. In questi casi, gli inibitori della traduzione o punti di tempo limitato deve essere utilizzato. Tuttavia, artefatti a causa dell&#39;inibizione traslazionale rimanere una possibilità. La fusione di cellule contenenti una di ogni tipo cellulare sono più ambite per una chiara interpretazione della spola e del comportamento di localizzazione. Ottimizzazione del numero di cellule e le condizioni di fusione (tempi e concentrazione) può essere necessario per promuovere tale favorevole eventi di fusione 1:1. </li><li> E &#39;importante notare che l&#39;ottimizzazione di alcune fasi del protocollo sarà necessario a seconda delle particolari tipi di cellule usate. Aspetti della procedura sperimentale come l&#39;efficienza di fusione, l&#39;efficienza di trasfezione e vitalità dopo la fusione può variare notevolmente tra i tipi di cellule. In particolare, i tipi di cellule primarie può essere difficile da gestire a causa delle condizioni cultura complessa e bassa efficienza di trasfezione. Utilizzo di tecnologie come il dispositivo Lonza Nucleofector può permettere per l&#39;elaborazione rapida delle cellule così come l&#39;efficienza di transfezione aumentato drammaticamente. Inoltre, i metodi di elettroporazione consente un facile trasferimento di cellule in sospensione ai passi fusione che seguono. </li></ul>

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		<div>
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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Effectene reagent</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Qiagen</td>
<td>301425</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>P5493</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Trypsin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>SH3023602</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dulbecco&#x2019;s modified Eagle&#x2019;s medium (DMEM)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>SH30243FS</td>
<td>High glucose</td>
</tr>
<tr>
<td>paraformaldehyde</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>FisherChemical</td>
<td>O4042-500</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>4&#x2019;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>D9542-10MG</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hyclone Serum (fetal bovine)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Scientific</td>
<td>SH3008803HI</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Falcon 6-well plates</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>08-772-1B</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Polyethylene glycol 1000</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>528875-25GM</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cover slips</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>12-545-85</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DABCO</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>D2522-25G</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Nucleofector HDF kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Lonza</td>
<td>VPD-1001</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

heterokaryon technique for analysis of cell type-specific localization

Un numero significativo di proteine ​​sono regolate dal traffico subcellulare o nucleocytolasmic spola. Queste proteine ​​visualizzare una gamma diversificata di funzioni cellulari incluse l&#39;importazione nucleare / esportazione di RNA e proteine, regolazione trascrizionale, e l&#39;apoptosi. È interessante notare che importanti riorganizzazioni cellulari tra cui la divisione cellulare, differenziamento e trasformazione, spesso comportano tali attività 3,4,8,10. Lo studio dettagliato di queste proteine ​​e rispettivi meccanismi normativi può essere impegnativo come la stimolazione di questi cambiamenti di localizzazione possono essere sfuggente, ei movimenti si può essere molto dinamici e difficili da monitorare. Studi che hanno coinvolto oncogenesi cellulare, ad esempio, continueranno a beneficiare di percorsi di comprensione e di attività delle proteine ​​che differiscono tra normali cellule primarie e cellule trasformate 6,7,11,12. Come molte proteine ​​mostrano la localizzazione alterato durante la trasformazione o come risultato della trasformazione, dei metodi per caratterizzare in modo efficiente queste proteine ​​e le vie a cui partecipano stand per migliorare la comprensione di oncogenesi e aprire nuovi settori di drug targeting. Qui vi presentiamo un metodo per l&#39;analisi del traffico di proteine ​​e attività spola tra le cellule di mammifero primarie e trasformate. Questo metodo combina la generazione di fusioni heterokaryon con microscopia a fluorescenza per fornire un protocollo flessibile che può essere utilizzato per rilevare localizzazioni proteine ​​allo stato stazionario o dinamico. Come mostrato nella Figura 1, due tipi di cellule separate sono transitoriamente transfettate con costrutti plasmide recante il gene fluoroprotein collegato al gene di interesse. Dopo l&#39;espressione, le cellule si fondono con glicole polietilenico, e localizzazioni delle proteine ​​possono poi essere ripreso con una varietà di metodi. Il protocollo presentato qui è un approccio fondamentale in cui le tecniche speciali, può essere aggiunto.

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Heterokaryon Technique for Analysis of Cell Type-specific Localization

Un metodo flessibile ed efficiente per la caratterizzazione di cellule tipo-specifici di localizzazione di proteine ​​e nucleocytoplasmic spola è descritto. Questo approccio heterokaryon utilizza proteine ​​di fusione fluorescenza-etichettati in modo da localizzazioni proteina immagine dopo la fusione cellulare. Il protocollo è suscettibile di steady-state localizzazioni o più determinazioni dinamici basati sull&#39;imaging cellule vive.

Tecnica Heterokaryon per l&#39;analisi di cellule tipo-specifica localizzazione

A significant number of proteins are regulated by subcellular trafficking or nucleocytolasmic shuttling.  These proteins display a diverse array of ...

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