Name: developing custom chinese hamster ovary-host cell protein assays using acoustic membrane microparticle technology
Uploaded: 2011-02-03T18:30:00
Duration: 7 min 13 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Developing Custom Chinese Hamster Ovary-host Cell Protein Assays using Acoustic Membrane Microparticle Technology at JoVE.com

1. Microdeeltje Voorbereiding <ol><li> Label antilichamen met behulp van Biotine NHS Chemie </li><li> Bepaling van de Graad van biotinylatie </li><li> Conjugaat Streptavidine Kralen met gebiotinyleerd antilichaam <ol><li> Resuspendeer de kralen in de originele flacon door vortexen gedurende 1-2 minuten </li><li> Aliquot het gewenste volume van kralen in een microcentrifugebuis </li><li> Was de kralen 3 keer met PBST: <ol><li> Plaats de buis met de kralen op de magneet gedurende 2 minuten </li><li> Verwijder de bovenstaande vloeistof door aspiratie met de buis op de magneet. Wees voorzichtig dat u de kralen te verstoren </li><li> Haal de buis van de magneet en voeg 1 ml PBST </li><li> Vortex gedurende 20 seconden om de kralen resuspenderen </li><li> Centrifugeer gedurende 5 seconden ingedrukt om de parels uit de dop </li><li> Herhaal dit twee keer 2.3.1-2.3.5 meer </li></ol></li><li> Na de derde plaats was de buis op de magneet en zuig de PBST </li><li> Voeg gebiotinyleerd antilichaam aan de kralen en resuspenderen </li><li> Indien nodig brengt het volume van de gebiotinyleerde antilichaam tot 300 pi met PBS. Als het antilichaam volume is al meer dan 300 pi voeg geen PBS </li><li> Incubeer de kraal / antilichaam suspensie gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur op de vortex shaker of buis rotator </li><li> Was drie keer met PBST zoals in stap 3. </li><li> Blok kralen met gebiotinyleerd BSA <ol><li> Na de derde wasbeurt toe te voegen 10 ug / mg gebiotinyleerd BSA, past u het volume op 300 ul met PBS, indien nodig, en incubeer onder schudden gedurende 30 minuten </li></ol></li><li> Was drie keer met PBST zoals in stap 3 </li><li> Resuspendeer de kralen in 100 ul van PBS/0.05% BSA. Natriumazide kan worden toegevoegd voor de lange termijn opslag </li></ol></li><li> Met behulp van standaard NHS Fluoresceïne protocollen, fluoresceinate de detector antilichaam </li><li> Bepalen de mate van Fluorescination </li></ol> 2. HCP - Ontwikkeling <ol><li> Bereid te werken oplossingen: <ol><li> Fluoresceïne gelabeld antilichaam (Fl-Ab): De meeste CHO-HCP assays gebruiken Fl-Ab bij een uiteindelijke concentratie van 400 ng / mL. De FL-Ab wordt toegevoegd als ¼ van de laatste test volume, dus de concentratie van de werkende oplossing is 1,6 microgram / ml. Bereid deze oplossing door verdunnen flab voorraad met BioScale Bead / flab Diluent. </li><li> Kralen: De meeste CHO-HCP assays gebruiken kralen bij een uiteindelijke concentratie van 2x10 5 kralen / ml. De kraal reagens vormt ¼ van de uiteindelijke test volume, dus de concentratie van de werkende oplossing is 8x10 5 kralen / ml. Bereid deze oplossing door verdunnen kraal voorraad met BioScale Bead / flab Diluent. Vortex de kraal voorraad goed om ervoor te zorgen dat alle parels worden in suspensie voorafgaand aan het verwijderen van een aliquot deel. </li><li> Running Buffer: De samenstelling van het lopende buffer kan worden geoptimaliseerd voor de antilichamen gebruikt worden om de test te ontwikkelen, maar een aantal CHO-HCP testen zijn ontwikkeld met behulp van 10 mM HEPES buffer, 1% Tween, pH 7,5. BioScale heeft ontwikkeld, een additief voor de lopende buffer (meegeleverd met de development kit), die wordt toegevoegd aan de buffer tot een concentratie van 1% voor gebruik. </li></ol></li><li> Verdunnen kalibrators en monsters met BioScale Sample Diluent. </li></ol> 3. ViBE System Set Up <ol><li> Schakel de ViBE Workstation op </li><li> Sluit het systeem leveren en afval </li><li> Prime van het systeem </li><li> Plaats een ViBE cartridge </li><li> Route van de buizen </li><li> Bereid test template door het invullen van het blad met het label &quot;Sample Setup&quot;. BioScale biedt de mogelijkheid om een ​​test template voor iedere ViBE Workstation test. Hierdoor kan de gebruiker te bewerken en specifieke notities op te slaan in de &quot;Notes&quot; vel van de sjabloon voor de verschillende assays het bijhouden van een volledig verslag van het experiment. </li><li> De eerste test template set up: Begin met het invullen van de tabel (linker bovenhoek) van de concentratie bereik van de normen in de test in de &quot;Sample Setup&quot; sheet. </li><li> Volgende, aanvullende informatie in de tabel in te voeren om het recht van de normen (Simple Column Lees Configuratie, Een reagens toevoegen en Two Reagent Add setups) naar de Vibe Workstation hoe lang monsters moet broeden instrueren, hoeveel volume reagens is over te dragen , hoe lang het monster accumulatie dient te zijn, en of de sensor conditionering en ontsmetting van de sondes en de cartridge nodig zijn, enz. </li><li> Vul de plaat lay-out. </li><li> Belasting monster / reagentia in platen. De ViBE zal de vereiste volumes voor het reagens plaat. Monstervolume kan variëren, maar in de helft van een totaal volume van de test 120 uL is een goed startpunt. </li><li> Van toepassing zijn plaat dekt. Laad de borden op werkstation dek. </li><li> Voer de test start up wizard, ga door wizard en start test. </li></ol> 4. Representatieve resultaten <img src="/files/ftp_upload/2493/2493fig1.jpg" alt="Figuur 1" /> Figuur 1: AMMP Sandwich Immunoassay </p&gt; Op een ViBE Workstation, een AMMP test meet antigeen concentratie. Het signaal wordt gemeten wanneer de kraal-antigeen-hapteen antilichaam bindt aan de sensor door de hapteen / anti-hapteen interactie. Regeneratie brengt de sensor terug naar het begin staat door het verwijderen van de immune complexen. <img src="/files/ftp_upload/2493/2493fig2.jpg" alt="Figuur 2" /> Figuur 2: CHO-HCP AMMP Assay kalibratiecurve Figuur 2 hierboven is een voorbeeld van een CHO HCP AMMP Assay kalibratiecurve. Analyse kan worden uitgevoerd in monsters uit de hele zuivering beek met inbegrip van de reactor met hoge precisie en reproduceerbaarheid. <img src="/files/ftp_upload/2493/2493fig3.jpg" alt="Figuur 3" /> Figuur 3: Proteïne A AMMP Assay kalibratiecurve Figuur 3 is een calibratie curve voor een resterende Proteïne A AMMP Test, uitgevoerd met een VIBE Resterende Proteïne A Assay Kit. Dezelfde kit kan gebruikt worden voor een snellere test met een 30 minuten incubatietijd, of voor meer gevoelige resultaten en een breder dynamisch bereik met een langere incubatieperiode zonder verlies van precisie of de nauwkeurigheid, die beide zijn meestal beter is dan vergelijkbare ELISA&#39;s in van gebruikers handen <img src="/files/ftp_upload/2493/2493fig4.jpg" alt="Figuur 4" /> Figuur 4: Product Titer AMMP Assay De ViBE Workstation kan ook worden gebruikt voor een product Titer test, de resultaten weergegeven in figuur 4. Anders uitgevoerd dan andere AMMP Testen, is deze test niet nodig steekproef andere behandeling dan eenvoudige verdunning, of kralen, en kwantificering is geverifieerd in &quot;geen spin&quot; monsters met meer dan 10 miljoen cellen over een breed scala van de levensvatbaarheid. <img src="/files/ftp_upload/2493/2493fig5.jpg" alt="Figuur 5" /> Figuur 5: AMMP Assay standaardcurve voor GST-Gadd34 biomarker analyse Weergegeven in figuur 5 is een standaard curve van het signaal verkregen door de ViBE BioAnalyzer (Panel A) of met behulp van recombinant-technologie AlphaScreen GST-Gadd34. Resultaten op de ViBE platform waren ongeveer een log gevoeliger met dezelfde antilichamen. AMMP maakt gebruik van de meting van de minder grotere deeltjes geniet nog steeds uit de oplossing fase vast te leggen en detectie complex vorming. <img src="/files/ftp_upload/2493/2493fig6.jpg" alt="Figuur 6" /> Figuur 6: AMMP Assay standaardcurve voor GST-Gadd34 in tumormonster In figuur 6, was de inductie van Gadd34 van CWR22 xenotransplantaties getest in de aanwezigheid of afwezigheid van een boronate proteasoom inhibitor zoals geanalyseerd door ofwel de ViBE BioAnalyzer (Panel A) of AlphaScreen (Panel B). De ViBE platform was in staat om gevoelige, reproduceerbare resultaten te produceren in de in vivo tumor xenotransplantaten terwijl het AlphaScreen signaal werd geblust met een verhoogde ug van eiwitten. Dit voorbeeld toont de kracht van AMMP technologie in de zeer complexe monsters. Vanwege de gevoelige detectie-chip en een hoog rendement van de magneet in de buurt van de chips, kan lage aantallen van magnetische microdeeltjes efficiënt en reproduceerbaar scharrelen voor de lage abundantie doel te midden van de complexiteit van de gelyseerde cellulaire (inclusief lysis reagentia) en bloed puin.

De auteurs van dit artikel zijn in dienst van Bioscale, Inc, dat sommige van de instrumenten en reagentia die in dit artikel oplevert.

De voorgaande voorbeelden laten zien zeer gevoelig kwantitatieve AMMP de resultaten in complexe monsters. Deze prestatie, bij aflevering met het gemak en de controle van het formatteren van reagentia in het systeem is mogelijk voor een verscheidenheid aan toepassingen. Deze aanvragen kan specifiek voor een doel, zoals in Gadd34 in tumor, of generiek voor een spectrum van de doelen, zoals in gastheercel eiwit detectie en kwantificatie in monsters dat de zuivering beek over te steken. De lage overhead ViBE platform in combinatie met zeer flexibele AMMP biedt een krachtig instrument voor het leveren van kritische analyses.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>NHS-Chromogenic-biotin or NHS-Chromogenic Biotin Labeling kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>If NHS-Chromogenic-biotin is purchased as a reagent the following additional materials will be required</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Water-miscible organic solvent such as dimethylsulfoxide (DMSO) or dimethylformamide (DMF)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Phosphate buffered saline (PBS) or other amine free buffer (pH 7 &#x2013; 9)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Desalting columns or dialysis units for buffer exchange</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Spectrophotometer able to measure 354 and 280 nm &#x2013; for measuring protein and biotin concentrations</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Biotinylated antibody (2-5 biotins/Ab)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Streptavidin magnetic beads</td>
<td>&nbsp;</td>
<td><a href="http://www.bioscale.com">BioScale</a></td>
<td>&nbsp;</td>
<td>(10 mg/mL) ~108 beads/mg</td>
</tr>
<tr>
<td>Magnet for microcentrifuge tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>New England BioLabs</td>
<td>cat # S1510S</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Biotinylated BSA for blocking</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PBS 0.1% Tween 20</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Vortex</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microcentrifuge holder for Vortex or tube rotator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Antibody or protein to be labeled</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>NHS-Fluorescein or NHS-Fluorescein Labeling kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>If NHS-Fluorescein is purchased as a reagent the following additional materials will be required</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Water-miscible organic solvent such as dimethylsulfoxide (DMSO) or dimethylformamide (DMF)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>50 mM borate, pH 8.5 or other amine free buffer (pH 7 &#x2013; 9)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Desalting columns or dialysis units for buffer exchange</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Measurement of protein and fluorescein concentrations requires a spectrophotometer able to measure 493 and 280 nm.</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Diluent</td>
<td>&nbsp;</td>
<td><a href="http://www.bioscale.com">BioScale</a></td>
<td>&nbsp;</td>
<td>to dilute beads and FlAb</td>
</tr>
<tr>
<td>Sample Diluent</td>
<td>&nbsp;</td>
<td><a href="http://www.bioscale.com">BioScale</a></td>
<td>&nbsp;</td>
<td>to dilute samples and calibrators</td>
</tr>
<tr>
<td>Running Buffer Additive</td>
<td>&nbsp;</td>
<td><a href="http://www.bioscale.com">BioScale</a></td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

developing custom chinese hamster ovary-host cell protein assays using acoustic membrane microparticle technology

Testen op maat voor de unieke eiwitten zijn vaak beperkt tot tijdrovende handmatige detectie en kwantificatie technieken zoals ELISA of Western blots te wijten aan de complexiteit van de ontwikkeling van alternatieve platforms. Gepatenteerde Acoustic BioScale&#39;s Membraan microdeeltje (AMMP) technologie maakt sandwich immunoassays te gemakkelijk worden ontwikkeld voor gebruik op de ViBE platform, een betere gevoeligheid, reproduceerbaarheid, en geautomatiseerde werking. Als voorbeeld, dit protocol beschrijft de procedure voor het ontwikkelen van een aangepaste Chinese hamster ovarium-Host Cell Protein (CHO-HCP) assay. De algemene beginselen hier geschetst kan worden gevolgd voor de ontwikkeling van een breed scala van immunoassays. Een AMMP test meet antigeen concentratie door het meten van veranderingen in de trillingsfrequentie wordt veroorzaakt door de binding van micropartikels om de sensor oppervlak te berekenen. Het bestaat uit vier belangrijke componenten: (1) een patroon dat een gefunctionaliseerd acht sensor chip bevat (2) antilichaam gelabeld magnetische microdeeltjes, (3) hapteen tagged antilichaam dat bindt aan het oppervlak van de gefunctionaliseerde chip (4) monsters die het antigeen van rente. BioScale De biosensor is een apparaat dat resonant acht afzonderlijke membranen met een aparte fluidisch paden bevat. De membranen verandering trillingsfrequentie in reactie op de massa zich ophoopt op het oppervlak en deze frequentie verandering is gebruikt om de hoeveelheid van de toegevoegde massa kwantificeren. Om het gebruik te vergemakkelijken in een breed scala van immunoassays de sensor is gefunctionaliseerd met een anti-hapteen antilichaam. Assay specifieke antilichamen worden gewijzigd door de covalente conjugatie van een hapteen tag een antilichaam en biotine naar de andere. Het biotine label wordt gebruikt om het antilichaam binden aan gekoppeld magnetische korrels die, in combinatie met de hapteen-gelabeld antilichaam, worden gebruikt om de analyt te vangen in een sandwich streptavidine. Het complex bindt aan de chip door de anti-hapten/hapten interactie. Aan het einde van elke test run de sensoren worden schoongemaakt met een verdund zuur waardoor de sequentiële analyse van de kolommen van een 96-well plaat. Hier presenteren we de methode voor het ontwikkelen van een aangepaste CHO-HCP AMMP test voor bioproces ontwikkeling. Het ontwikkelen van AMMP testen of het wijzigen van bestaande testen in AMMP testen kunnen zorgen voor betere prestaties (reproduceerbaarheid, gevoeligheid) in complexe monsters en minder operator tijd. Het protocol geeft de stappen voor de ontwikkeling en de discussie sectie reviews representatieve resultaten. Voor een meer gedetailleerde uitleg van test-optimalisatie en aanpassing parameters contact BioScale. Deze set bevat generieke bioprocess ontwikkeling assays zoals Resterende proteïne A, Product titer, en CHO-HCP.

Watch this Scientific Journal Video about Developing Custom Chinese Hamster Ovary-host Cell Protein Assays using Acoustic Membrane Microparticle Technology at JoVE.com

Developing Custom Chinese Hamster Ovary-host Cell Protein Assays using Acoustic Membrane Microparticle Technology

Ontwikkeling van op maat assays op de ViBE platform voor meer gevoelige, reproduceerbare, geautomatiseerd resulteert in complexe matrices beschreven. De universele patroon laat testen eenvoudig worden aangepast voor gebruik met aangepaste assays. Deze veelzijdigheid maakt snelle ontwikkeling en validatie van nieuwe testen of geautomatiseerde versies van bestaande manuele testen, geïllustreerd in deze video.

Het ontwikkelen van aangepaste Chinese hamster ovarium-host Cell Protein Testen met behulp van akoestisch vlies micropartikel Technology

Custom assays for unique proteins are often limited to time consuming manual detection and quantitation techniques such as ELISA or Western blots due to ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Increasing cDNA Yields from Single-cell Quantities of mRNA in Standard Laboratory Reverse Transcriptase Reactions using Acoustic Microstreaming

Het verhogen van cDNA Opbrengsten van Single-cell hoeveelheden mRNA in standaard laboratorium reverse transcriptaseremmers Reacties met behulp van Acoustic Microstreaming

Correlating gene expression with cell behavior is ideally done at the single-cell level.  However, this is not easily achieved because the small amount of ...

Creating Transient Cell Membrane Pores Using a Standard Inkjet Printer

Het creëren van voorbijgaande celmembraan poriën met een standaard inkjetprinter

Bioprinting has a wide range of applications and significance, including tissue engineering, direct cell application therapies, and biosensor ...

Membrane-SPINE: A Biochemical Tool to Identify Protein-protein Interactions of Membrane Proteins In Vivo

Membrane-SPINE: A Biochemical Tool to Identify Protein-protein Interactions of Membrane Proteins In Vivo

Membraan-STEKEL: een biochemische Tool om eiwit-eiwit interacties van membraaneiwitten Identificeer<em&gt; In Vivo</em

Membrane proteins are essential for cell viability and are therefore important therapeutic targets1-3. Since they function in complexes4, methods to ...

Isolation and Characterization Of Chimeric Human Fc-expressing Proteins Using Protein A Membrane Adsorbers And A Streamlined Workflow

Isolatie en karakterisering van chimerische menselijke fc-uitdrukkende eiwitten met behulp van eiwitten een membraanadsorbers en een gestroomlijnde workflow

Laboratory scale to industrial scale purification of biomolecules from cell culture supernatants and lysed cell solutions can be accomplished using ...

Generic Protocol for Optimization of Heterologous Protein Production Using Automated Microbioreactor Technology

Generic-Protocol voor optimalisatie van heterologe eiwitproductie met behulp van geautomatiseerde Microbioreactor technologie

A core business in industrial biotechnology using microbial production cell factories is the iterative process of strain engineering and optimization of ...

Fabrication of Custom Agarose Wells for Cell Seeding and Tissue Ring Self-assembly Using 3D-Printed Molds

Fabricage van aangepaste Agarose putten voor het zaaien van de cellen en weefsel Ring zelf-assemblage met behulp van 3D-gedrukte mallen

Engineered tissues are being used clinically for tissue repair and replacement, and are being developed as tools for drug screening and human disease ...

Purification and Analytics of a Monoclonal Antibody from Chinese Hamster Ovary Cells Using an Automated Microbioreactor System

Zuivering en analyse van een monoklonaal antilichaam van Chinese Hamster Ovariumcellen met behulp van een geautomatiseerd Microbioreactor systeem

Monoclonal antibodies (mAbs) are one of the most popular and well-characterized biological products manufactured today. Most commonly produced using ...

In Vesiculo Synthesis of Peptide Membrane Precursors for Autonomous Vesicle Growth

In Vesiculo synthese van peptide membraan precursoren voor autonome Vesicle groei

Compartmentalization of biochemical reactions is a central aspect of synthetic cells. For this purpose, peptide-based reaction compartments serve as an ...

Process Optimization using High Throughput Automated Micro-Bioreactors in Chinese Hamster Ovary Cell Cultivation

Proces optimalisatie met behulp van high throughput geautomatiseerde micro-bioreactoren in de Chinese Hamster Eierstok celteelt

Optimization of bioprocesses to increase the yield of desired products is of importance in the biopharmaceutical industry. This can be achieved by strain ...

Preparing Protein Producing Synthetic Cells using Cell Free Bacterial Extracts, Liposomes and Emulsion Transfer

Voorbereiding van eiwit producerende synthetische cellen met behulp van cell free bacteriële extracten, liposomen en emulsie transfer

The bottom-up assembly approach for construction of synthetic cells is an effective tool for isolating and investigating cellular processes in a cell ...