Name: developing custom chinese hamster ovary-host cell protein assays using acoustic membrane microparticle technology
Uploaded: 2011-02-03T18:30:00
Duration: 7 min 13 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Developing Custom Chinese Hamster Ovary-host Cell Protein Assays using Acoustic Membrane Microparticle Technology at JoVE.com

1. Mikropartikelenzymimmunoassay Förberedelser <ol><li> Etikett antikroppar med hjälp av Biotin NHS kemi </li><li> Fastställande av graden av Biotinylation </li><li> Konjugat Streptavidin Pärlor med biotinylerad antikropp <ol><li> Resuspendera pärlor i den ursprungliga injektionsflaskan genom att vortexa i 1-2 minuter </li><li> Alikvotera önskad volym av pärlor i ett mikrocentrifugrör </li><li> Tvätta pärlor 3 gånger med PBST: <ol><li> Placera röret med pärlor på magneten i 2 minuter </li><li> Avlägsna supernatanten genom aspiration med röret på magneten. Var noga med att inte störa pärlor </li><li> Ta bort röret från magneten och tillsätt 1 ml PBST </li><li> Vortexa i 20 sekunder för att resuspendera kulorna </li><li> Centrifugera i 5 sekunder för att ta bort kulorna från den gemensamma jordbrukspolitiken </li><li> Upprepa 2.3.1-2.3.5 ytterligare två gånger </li></ol></li><li> Efter det tredje tvätta placera röret på magneten och aspirera PBST </li><li> Lägg biotinylerad antikroppar mot kulorna och återsuspendera </li><li> Om det behövs föra volym biotinylerad antikroppar upp till 300 mikroliter med PBS. Om antikroppen volymen är redan större än 300 mikroliter inte lägga någon PBS </li><li> Inkubera pärla / antikropp, suspension 30 minuter vid RT på vortex shaker eller tub rotator </li><li> Tvätta tre gånger med PBST som i steg 3. </li><li> Blockera pärlor med biotinylerad BSA <ol><li> Efter den tredje tvättningen lägga 10 mikrogram / mg biotinylerad BSA, justera volymen till 300 mikroliter med PBS om så behövs, och inkubera med agitation i 30 minuter </li></ol></li><li> Tvätta tre gånger med PBST som i steg 3 </li><li> Resuspendera pärlor i 100 ìl PBS/0.05% BSA. Natriumazid kan läggas till för långtidsförvaring </li></ol></li><li> Med vanliga NHS Fluorescein protokoll fluoresceinate detektorn antikroppen </li><li> Bestämma graden av Fluorescination </li></ol> 2. HCP - Utveckling <ol><li> Förbered arbetar lösningar: <ol><li> Fluorescein märkta antikroppar (FL-Ab): De flesta CHO-HCP analyser använder FL-AB till en slutlig koncentration av 400 ng / ml. FL-Ab läggs till som en fjärdedel av den slutliga analysen volym, därför koncentrationen av den arbetande lösningen är 1,6 mikrogram / ml. Bered denna lösning genom att späda flab materiel med BioScale Bead / flab spädningsvätska. </li><li> Pärlor: De flesta CHO-HCP analyser använder pärlor på en slutlig koncentration av 2x10 5 pärlor / ml. Den pärlan reagens utgör ¼ av den slutliga analysen volym, därför koncentrationen av den arbetande lösningen är 8x10 5 pärlor / ml. Bered denna lösning genom att späda pärla materiel med BioScale Bead / flab spädningsvätska. Vortexa pärla beståndet väl att se till att alla pärlorna är i suspension innan du tar bort en delmängd. </li><li> Löpande buffert: Sammansättningen av den löpande buffert kan behöva optimeras för antikroppar används för att utveckla analysen, men flera CHO-HCP-analyser har utvecklats med 10 mm HEPES buffert, 1% Tween, pH 7,5. BioScale har utvecklat en tillsats för att köra buffert (medföljer Development Kit) som läggs till bufferten till en koncentration på 1% före användning. </li></ol></li><li> Späd kalibratorer och prover med BioScale Sample Diluent. </li></ol> 3. ViBE system som inrättats <ol><li> Vrid ViBE Workstation på </li><li> Anslut systemet försörjning och avfall </li><li> Prime systemet </li><li> Sätt in en ViBE Cartridge </li><li> Dra rören </li><li> Förbered analys mall genom att fylla i bladet märkt &quot;Sample Setup&quot;. BioScale ger möjlighet att ha en analys mallen för varje ViBE Workstation analys. Detta gör att användaren kan redigera och spara specifika anteckningar i &quot;Anteckningar&quot; blad av mallen för olika analyser föra en komplett logg av försöket. </li><li> Initial analys mall uppställt: Börja med att fylla i tabellen (längst upp till vänster) av koncentrationen olika standarder i analysen i &quot;Sample Setup&quot; blad. </li><li> Nästa, ange ytterligare information i tabellen till höger om standarder (enkel kolonn Läs Setup Ett Lägg Reagens och två Reagens Lägg inställningar) att uppdra åt ViBE Workstation hur länge prover behöver inkubera, hur mycket volym av reagens som ska överföras , hur länge provet ackumulering måste, och huruvida sensor konditionering och sanering av sonder och patron är nödvändiga, etc </li><li> Fyll tallriken layouten. </li><li> Ladda prov / reagenserna till tallrikar. VIBE kommer att ge de volymer som krävs för reagenset plattan. Provvolym kan variera, men i hälften av en total analys volym av 120 mikroliter är en bra startpunkt. </li><li> Applicera plattan täcker. Ladda plattorna mot arbetsstation däck. </li><li> Kör analysen startar guiden, gå igenom guiden och starta analysen. </li></ol> 4. Representativa resultat <img src="/files/ftp_upload/2493/2493fig1.jpg" alt="Figur 1" /> Figur 1: AMMP Sandwich immunoassay </p&gt; På en ViBE arbetsstation, mäter en AMMP analys antigen koncentration. Signal mäts när pärla-antigen-hapten antikroppar binder till sensorn via hapten / anti-hapten interaktion. Regenerering ger sensorn tillbaka till början staten genom att ta bort immunkomplex. <img src="/files/ftp_upload/2493/2493fig2.jpg" alt="Figur 2" /> Figur 2: CHO-HCP AMMP analys kalibreringskurva Figur 2 ovan är ett exempel på en CHO HCP AMMP Assay kalibreringskurva. Analys kan utföras i prover från hela rening strömmen inklusive reaktor med hög precision och reproducerbarhet. <img src="/files/ftp_upload/2493/2493fig3.jpg" alt="Figur 3" /> Figur 3: Protein A AMMP analys kalibreringskurva Figur 3 är en kalibreringskurva för en återstående Protein A AMMP-analys, som utförs med en VIBE Residual Protein A-analys Kit. Samma monteringssats kan användas för en snabbare analys med en 30 minuters inkubation, eller för mer känsliga resultat och större dynamiskt omfång med en längre inkubationstid utan förlust av precision eller noggrannhet, som båda är vanligen bättre än motsvarande Elisas i användarnas händer <img src="/files/ftp_upload/2493/2493fig4.jpg" alt="Figur 4" /> Figur 4: Produkt titer AMMP analys VIBE Workstation kan även användas för produkter titer test, resultat visas i figur 4. Utförs annorlunda än andra AMMP analyser, kräver denna analys inte prov annan beredning än enkel utspädning, eller pärlor och kvantifiering har verifierats i &quot;ingen centrifugering&quot; prover som innehåller över 10 miljoner celler över ett brett spektrum av viabilitet. <img src="/files/ftp_upload/2493/2493fig5.jpg" alt="Figur 5" /> Figur 5: AMMP analys standardkurvan för GST-Gadd34 biomarkör-analys Visas i figur 5 är en standardkurva av signal som erhållits genom ViBE BioAnalyzer (Panel A) eller AlphaScreen teknik med hjälp av rekombinant GST-Gadd34. Resultat på VIBE plattformen var ungefär en logg känsligare med samma antikroppar. AMMP utnyttjar mätning av färre större partiklar men ändå drar nytta av lösningen fas fånga och upptäckt komplexbildning. <img src="/files/ftp_upload/2493/2493fig6.jpg" alt="Figur 6" /> Figur 6: AMMP analys standardkurvan för GST-Gadd34 i tumör prov I Figur 6 var induktion av Gadd34 från CWR22 implanterad testas i närvaro eller frånvaro av en boronate proteasomhämmaren som analyseras av antingen ViBE BioAnalyzer (panel A) eller AlphaScreen (panel B). VIBE plattformen kunde producera känsliga, reproducerbara resultat i in vivo tumörxenografter medan AlphaScreen signalen släcks var med ökad mikrogram av protein. Detta exempel visar kraften i AMMP teknik i mycket komplexa prover. På grund av känslig detektion chip och hög effektivitet i magneten nära marker, kan lågt antal av magnetiska mikropartiklar effektivt och reproducerbart bildningen av låga överflöd mål mitt i den komplicerade lyseras cellulära (inklusive lysering reagens) och blod skräp.

Författarna av denna artikel är anställda av Bioscale, Inc som producerar några av de instrument och reagenser som används i denna artikel.

Ovanstående exempel visar AMMP är mycket känsliga kvantitativa resultat i komplexa prover. Detta resultat, då levereras med den lätthet och kontroll av formatering reagenser i systemet gör det möjligt för en mängd olika applikationer. Dessa ansökningar kan vara specifika för ett mål, som i Gadd34 i tumör, eller generiska för ett spektrum av mål, som i värdcellen protein detektion och kvantifiering i prover som korsar rening strömmen. Den låga omkostnader ViBE plattform kombinerat med hög flexibilitet AMMP ger ett kraftfullt verktyg för att leverera kritiska analyser.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>NHS-Chromogenic-biotin or NHS-Chromogenic Biotin Labeling kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>If NHS-Chromogenic-biotin is purchased as a reagent the following additional materials will be required</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Water-miscible organic solvent such as dimethylsulfoxide (DMSO) or dimethylformamide (DMF)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Phosphate buffered saline (PBS) or other amine free buffer (pH 7 &#x2013; 9)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Desalting columns or dialysis units for buffer exchange</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Spectrophotometer able to measure 354 and 280 nm &#x2013; for measuring protein and biotin concentrations</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Biotinylated antibody (2-5 biotins/Ab)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Streptavidin magnetic beads</td>
<td>&nbsp;</td>
<td><a href="http://www.bioscale.com">BioScale</a></td>
<td>&nbsp;</td>
<td>(10 mg/mL) ~108 beads/mg</td>
</tr>
<tr>
<td>Magnet for microcentrifuge tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>New England BioLabs</td>
<td>cat # S1510S</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Biotinylated BSA for blocking</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PBS 0.1% Tween 20</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Vortex</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microcentrifuge holder for Vortex or tube rotator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Antibody or protein to be labeled</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>NHS-Fluorescein or NHS-Fluorescein Labeling kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>If NHS-Fluorescein is purchased as a reagent the following additional materials will be required</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Water-miscible organic solvent such as dimethylsulfoxide (DMSO) or dimethylformamide (DMF)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>50 mM borate, pH 8.5 or other amine free buffer (pH 7 &#x2013; 9)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Desalting columns or dialysis units for buffer exchange</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Measurement of protein and fluorescein concentrations requires a spectrophotometer able to measure 493 and 280 nm.</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Diluent</td>
<td>&nbsp;</td>
<td><a href="http://www.bioscale.com">BioScale</a></td>
<td>&nbsp;</td>
<td>to dilute beads and FlAb</td>
</tr>
<tr>
<td>Sample Diluent</td>
<td>&nbsp;</td>
<td><a href="http://www.bioscale.com">BioScale</a></td>
<td>&nbsp;</td>
<td>to dilute samples and calibrators</td>
</tr>
<tr>
<td>Running Buffer Additive</td>
<td>&nbsp;</td>
<td><a href="http://www.bioscale.com">BioScale</a></td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

developing custom chinese hamster ovary-host cell protein assays using acoustic membrane microparticle technology

Anpassad testmetoder för unika proteiner är ofta begränsade till tidskrävande manuella metoder för detektion och kvantifiering såsom ELISA eller Western blotting på grund av komplexiteten i utvecklingen på alternativa plattformar. BioScale egenutvecklade Acoustic Membrane mikropartikelenzymimmunoassay (AMMP) teknik gör smörgås immunoanalyser lätt kan utvecklas för användning på ViBE plattformen, som ger bättre känslighet och reproducerbarhet, och automatiserad drift. Som ett exempel, beskriver detta protokoll förfarandet för att utveckla en egen kinesisk hamster-värdcellen Protein (CHO-HCP) analys. De allmänna principer som redovisas här kan följas för att utveckla en mängd olika immunologiska. En AMMP analys mäter antigen koncentration genom att mäta förändringar i oscillationsfrekvens orsakas av bindningen av mikropartiklar till sensorn för att beräkna. Det består av fyra huvudkomponenter: (1) en patron som innehåller en functionalized åtta Sensorchipet (2) antikropp märkt magnetiska mikropartiklar, (3) hapten taggade antikropp som binder till ytan av functionalized chip (4) prover som innehåller antigen av intresse. BioScale har Biosensor är ett resonant enhet som innehåller åtta olika membran med separata fluidic vägar. Membranen förändringen oscillationsfrekvens svar på massa ansamlas på ytan och denna frekvens förändring används för att kvantifiera mängden tillsatt massa. För att underlätta användning i en mängd olika immunoanalyser sensorn är functionalized med en anti-hapten antikropp. Analysen specifika antikroppar ändras genom kovalenta konjugering av en hapten tagg till en antikropp och biotin till den andra. Den biotin etikett används för att binda antikroppar till streptavidin kombination magnetiska kulor som, i kombination med hapten-märkta antikroppar, används för att fånga analyten i en smörgås. Komplexet binder till chip genom anti-hapten/hapten interaktion. Vid slutet av varje analys köra sensorerna rengörs med en utspädd syra gör det möjligt sekventiell analys av kolumner från en 96-brunnar. Här presenterar vi en metod för att utveckla en anpassad CHO-HCP AMMP assay för Bioprocess utveckling. Utveckla AMMP analyser eller ändra befintliga analyser i AMMP analyser kan ge bättre prestanda (reproducerbarhet, känslighet) i komplexa prover och minskad nättid. Protokollet visar steg för utveckling och diskussionsavsnittet recensioner representativa resultat. För en mer ingående förklaring av analysen optimering och parametrar anpassning kontakt BioScale. Detta kit erbjuder allmänna bioprocess utveckling analyser som Återstående Protein A, Produkt titer, och Cho-HCP.

Watch this Scientific Journal Video about Developing Custom Chinese Hamster Ovary-host Cell Protein Assays using Acoustic Membrane Microparticle Technology at JoVE.com

Developing Custom Chinese Hamster Ovary-host Cell Protein Assays using Acoustic Membrane Microparticle Technology

Utveckling av anpassade analyser på ViBE plattform för mer känslig, reproducerbar, automatiserad resulterar i komplexa matriser beskrivs. Den universella kassett gör analyser lätt kan anpassas för användning med anpassade analyser. Denna mångsidighet möjliggör snabb utveckling och validering av nya analyser eller automatiserade versioner av befintliga manuella analyser, exemplifierad i denna video.

Utveckla anpassade kinesisk hamster-host cellprotein analyser med hjälp av akustisk teknik Membran mikropartikelenzymimmunoassay

Custom assays for unique proteins are often limited to time consuming manual detection and quantitation techniques such as ELISA or Western blots due to ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Increasing cDNA Yields from Single-cell Quantities of mRNA in Standard Laboratory Reverse Transcriptase Reactions using Acoustic Microstreaming

Ökad cDNA Avkastningen från encelliga Mängder av mRNA i Standard transkriptas Laboratory Omvänd Reaktioner med akustiska Microstreaming

Correlating gene expression with cell behavior is ideally done at the single-cell level.  However, this is not easily achieved because the small amount of ...

Creating Transient Cell Membrane Pores Using a Standard Inkjet Printer

Skapa Övergående Porer cellmembran med en vanlig bläckstråleskrivare

Bioprinting has a wide range of applications and significance, including tissue engineering, direct cell application therapies, and biosensor ...

Membrane-SPINE: A Biochemical Tool to Identify Protein-protein Interactions of Membrane Proteins In Vivo

Membrane-SPINE: A Biochemical Tool to Identify Protein-protein Interactions of Membrane Proteins In Vivo

Membran-SPINE: A Biochemical verktyg för att identifiera protein-proteininteraktioner av membranproteiner<em&gt; In Vivo</em

Membrane proteins are essential for cell viability and are therefore important therapeutic targets1-3. Since they function in complexes4, methods to ...

Isolation and Characterization Of Chimeric Human Fc-expressing Proteins Using Protein A Membrane Adsorbers And A Streamlined Workflow

Isolering och karakterisering av chimeriska mänskliga fc-uttrycka proteiner med protein A membran adsorbatorer och ett strömlinjeformat arbetsflöde

Laboratory scale to industrial scale purification of biomolecules from cell culture supernatants and lysed cell solutions can be accomplished using ...

Generic Protocol for Optimization of Heterologous Protein Production Using Automated Microbioreactor Technology

Generiskt protokoll för optimering av heterologa proteinproduktion med hjälp av automatiserad Microbioreactor teknik

A core business in industrial biotechnology using microbial production cell factories is the iterative process of strain engineering and optimization of ...

Fabrication of Custom Agarose Wells for Cell Seeding and Tissue Ring Self-assembly Using 3D-Printed Molds

Tillverkning av anpassade agaros brunnar för Cell sådd och vävnad Ring självmontering med 3D-tryckt formar

Engineered tissues are being used clinically for tissue repair and replacement, and are being developed as tools for drug screening and human disease ...

Purification and Analytics of a Monoclonal Antibody from Chinese Hamster Ovary Cells Using an Automated Microbioreactor System

Rening och analys av en monoklonal antikropp från äggstocksceller från kinesisk hamster med hjälp av ett automatiserat Mikrobioreaktor system

Monoclonal antibodies (mAbs) are one of the most popular and well-characterized biological products manufactured today. Most commonly produced using ...

In Vesiculo Synthesis of Peptide Membrane Precursors for Autonomous Vesicle Growth

I Vesiculo syntes av peptid membran prekursorer för autonoma vesikler tillväxt

Compartmentalization of biochemical reactions is a central aspect of synthetic cells. For this purpose, peptide-based reaction compartments serve as an ...

Process Optimization using High Throughput Automated Micro-Bioreactors in Chinese Hamster Ovary Cell Cultivation

Processoptimering med hög genomströmning Automatiserad Mikro-Bioreaktorer i kinesisk hamster äggstockscellodling

Optimization of bioprocesses to increase the yield of desired products is of importance in the biopharmaceutical industry. This can be achieved by strain ...

Preparing Protein Producing Synthetic Cells using Cell Free Bacterial Extracts, Liposomes and Emulsion Transfer

Förbereda proteinproducerande syntetiska celler med cellfria bakterieextrakt, liposomer och emulsion överföring

The bottom-up assembly approach for construction of synthetic cells is an effective tool for isolating and investigating cellular processes in a cell ...