Name: isolation of translating ribosomes containing peptidyl-trnas for functional and structural analyses
Uploaded: 2011-02-25T16:03:00
Duration: 11 min 19 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Translating Ribosomes Containing Peptidyl-tRNAs for Functional and Structural Analyses at JoVE.com

LRC-V. wil dit artikel te wijden aan de nagedachtenis van Dr Adriel D. Johnson, een prachtige Professor waarvan het nummer een prioriteit was altijd de opleiding van studenten. We missen je, Adriel. We zijn dankbaar Jacqueline Moreno voor haar hulp bij het uitvoeren van de experimenten beschreven in deze studie. Dit onderzoek werd ondersteund door een subsidie ​​verstrekt aan CY van de National Science Foundation, MCB-0615390, en door start-up fondsen verstrekt aan LRC-V. van de Universiteit van Alabama in Huntsville.

1. Cel Gratis Extract voorbereiding. <ol><li> Twee gram van een droge Escherichia coli bacteriën pellet verkregen uit mid-log-fase culturen worden gewassen, tweemaal, met een halve liter buffer A die 10 mM Tris-acetaat, pH 8,0, 14 mM magnesiumacetaat, 60 mM kaliumacetaat en 50 ug / mL phenylmethanesulphonylfluoride (PMSF) door centrifugeren bij 5000 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C. Na het wassen, is de bacteriële pellet geresuspendeerd in 40 ml buffer A. </li><li> De bacteriële cellen verstoord met behulp van een Franse pers, het toepassen van 6000 psi druk. Deze druk komt overeen met 600 eenheden met behulp van een een-inch zuiger. De verstoorde suspensie wordt verzameld in een schone glazen buis (50 ml). </li><li> De verstoorde suspensie wordt behandeld met 1 mM dithiotreitol (DTT) en gecentrifugeerd bij 30.000 xg gedurende 30 minuten. Het centrifugeren procedure wordt herhaald, met behulp van de resulterende supernatant. De laatste supernatant is afgegeven (1 ml) in microbuisjes. Ten slotte worden de monsters bevroren met behulp van een droog ijs-ethanol mengsel of vloeibare stikstof, en worden opgeslagen bij -60 ° C of -80 ° C. </li></ol> 2. Voorbereiding van de Cel Vrije Extracten van verarmd RF2. <ol><li> 4,5 ml proteïne A Sepharose 4B slurry kralen worden gemengd met 5 ml van een anti-RF2 anti-serum met behulp van een draaiend wiel op kamertemperatuur, gedurende een uur. Het mengsel wordt gecentrifugeerd bij 2500 xg om de kralen te scheiden van het antiserum. Bij het weggooien van de supernatant, zijn deze kralen die de anti-RF2 antilichamen (anti-RF2 kralen) later gewassen door resuspensie in 1 ml buffer B met 35 mM Tris-acetaat pH 7,8, 10 mM magnesiumacetaat, 30 mM ammoniumacetaat, 60 mM kalium glutamaat en 5 ug / ml leupeptin proteinase inhibitor. De anti-RF2 parels worden vervolgens gescheiden van buffer B door centrifugeren met dezelfde hierboven vermelde voorwaarden. Het wassen procedure wordt tweemaal herhaald. </li><li> Een ml van de cel-extract wordt gemengd met 150 pi van de anti-RF2 kralen met behulp van een draaiend wiel, bij 4 ° C, gedurende twee uur. Het mengsel wordt gecentrifugeerd bij 10.000 xg voor de celvrije extract te scheiden van de kralen. Het supernatant wordt verwijderd en behandeld opnieuw met een andere 150 ul van anti-RF2 kralen. Deze procedure wordt nog eens herhaald met de daaruit voortvloeiende celvrije extract oplossing. De uiteindelijke celvrije extract oplossing is afgegeven (100 pi) in microbuisjes. De monsters worden bevroren met behulp van een droog ijs-ethanol mengsel of vloeibare stikstof, en worden opgeslagen bij -60 ° C of -80 ° C. </li></ol> 3. De voorbereiding van een DNA-template. <ol><li> Bereid een 1 ml PCR-reactie door het mengen van 600 femtomoles van het plasmide sjabloon met de sequenties te vertalen (afb. 1), met 0,4 nanomoles van elk van de oligodeoxynucleotides aangegeven in figuur 1, 0,2 micromol per dNTP en 50 U van Taq- DNA-polymerase in de buffer geleverd door Stratagene Co Voer de amplificatiereactie onder de te volgen voorwaarden: 94 ° C gedurende 2 min, (94 ° C gedurende 30 s, 55 ° C gedurende 30 s, 72 ° C gedurende 1 minuut, voor 30 cycli) en 72 ° C gedurende 12 minuten. </li><li> Zuiveren de PCR-producten door neerslaan van het DNA door het toevoegen van 1 / 10 volume van 3 M natriumacetaat, pH 5,2, en 2 volumes ijskoude ethanol. Herhaal de neerslag procedure nog een keer. Resuspendeer de DNA in 100 ul van diethyl-pyrocarbonate (DEPC) behandelde-water. Typisch, deze procedure levert 100 ug van een 600 bp DNA product. </li><li> Controleer de integriteit van de PCR-producten door middel van elektroforese op agarose gels. </li></ol> 4. De voorbereiding van biotine Labeled mRNA. <ol><li> Bereid een 100 ul in vitro transcriptie reactie in DEPC behandelde water door het mengen van 5 ug van het PCR-gegenereerde DNA-fragment met 0,5 micromol ATP, CTP, GTP, 0,3 micromol UTP, 50 nanomoles van biotine-16-UTP, en 10 uL van T7 enzym mix in de buffer geleverd door Promega Co Incubeer het reactiemengsel bij 37 ° C gedurende 3 uur. Het kwantificeren van de hoeveelheid van de verkregen mRNA, moet de DNA-template worden geëlimineerd door het toevoegen van RNase-vrij DNase. Incubeer de reactie bij 37 ° C gedurende 10 minuten. </li><li> Zuiveren het mRNA producten door neerslaan van de RNA door het toevoegen van 1 / 10 volume van 3 M natriumacetaat, pH 5,2, en 2 volumes koude ethanol. Herhaal de neerslag procedure nog een keer. Resuspendeer de mRNA in 100 ul DEPC behandelde water. Meestal is deze procedure levert tussen 1-2 mg van een 600 nt biotine gelabelde mRNA product. </li><li> Controleer de integriteit van de biotine gelabelde mRNA producten door elektroforese op agarose gels. </li></ol> 5. Isolatie van vertalen Ribosomen bevattende een peptidyl-tRNA. <ol><li> Bereid 500 pi van een in vitro vertaling reactiemengsel in DEPC behandelde water door het mengen van 10 tot 15 ug van biotine-gelabelde mRNA met 75 nanomoles van elk van de negentien aminozuren, alle met uitzondering van het aminozuur dat zal worden vervangen door een radioactief aminozuur , 50 uCi een radioactieve aminozuur (37MBq) en 20-5<html> 0 ul van RF2-lege cel-extract, in een gebufferde reactiemengsel dat 40 mM Tris-acetaat, pH 8,0, 10 mM magnesiumacetaat, 175 mM kaliumacetaat, 10 mM ammoniumacetaat, 2 mM DTT, 2 mM ATP, 0,5 mM GTP, 30 mM fosfoenolpyruvaat (PEP), 0,3 U / ml pyruvaat kinase (PK), 3,5% polyethyleenglycol 8000, 1 mM spermidine, 20 ug / ml folinezuur, en 250 ug / ml tRNA van E. coli. Incubeer het reactiemengsel bij 37 ° C gedurende 10 minuten. De volgorde van toevoeging van de reactie componenten is erg belangrijk. De cel-extract moet eerst worden gemengd met de buffer oplossing die de aminozuren en de uiteindelijke mengsel geïncubeerd gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur om de activering van de ribosomen mogelijk te maken. Later worden de biotine-gelabelde mRNA&#39;s toegevoegd. Voor structurele analyses met behulp van chemische modificatie procedures, is de toevoeging van een radioactief aminozuur niet vereist. </li><li> Toe te voegen aan de vertaling reactiemengsel - 3 ml streptavidine paramagnetische kralen (SMB) gesuspendeerd in buffer C met 35 mM Tris-acetaat, pH 8,0, 10 mM magnesiumacetaat, 175 mM kaliumacetaat, 10 mM ammoniumacetaat en 1 mM DTT. Incubeer de nieuwe ophanging bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten. </li><li> Scheid de SMB uit het mengsel door het aanbrengen van een magnetisch veld (MF) met behulp van magnetische scheiding staat. </li><li> Resuspendeer de SMB in buffer C en weer scheiden de kralen met behulp van de MF. Twee keer Herhaal deze procedure wassen. Resuspendeer de kralen in 500 ul buffer C, bewaar de suspensie op ijs, en meteen voer de volgende procedure. </li></ol> 6. Analyse van de geïsoleerde Ribosomen Bevat de peptidyl-tRNA. Voor peptidyl-tRNA <ol><li> Mix 10 pi van de SMB (gesuspendeerd in buffer C) met 10 pi van een laad-buffer die 50 mM Tris-HCl, pH 6,8, 2,5% (v / v) glycerol, 4% natriumdodecylsulfaat, 2 mM DTT en 0,2 mg / mL broomfenolblauw. Het oplossen van de componenten aan de kralen door het uitvoeren van de monsters in 10% Tris-tricine polyacrylamide gels. </li><li> Droog de gels met behulp van een vacuüm gel-droger. </li><li> Controleer de integriteit en de zuivering van het peptidyl-tRNA door het blootstellen van de gedroogde gel om een ​​X-ray film. </li></ol> Voor ribosomaal RNA <ol start="4"><li> Voeg 190 ul van 2 mM ethyleendiaminetetraacetaat (EDTA) oplossing bereid met DEPC behandeld water en 200 pi van fenol evenwicht gebracht met water, tot 10 ul van een kraal schorsing. Meng de opschorting door krachtige vortexen en scheiden de anorganische fase van de organische fase door centrifugatie bij 10.000 xg gedurende 3 min bij kamertemperatuur. Verzamel de bovenste waterlaag in een nieuwe microbuisjes. </li><li> Neerslag het RNA uit de waterlaag door het toevoegen van 1 / 10 volume van 3 M natriumacetaat, pH 5,2, 1 pi van 20 mg / ml van glycogeen oplossing en twee volumes van ijskoude ethanol. Resuspendeer de RNA in 10 ul van DEPC-behandeld water. </li><li> Controleer de integriteit van de ribosomale RNA&#39;s door elektroforese op agarose gels. Meestal, 50 ul van kralen opschorting opbrengst 1μg van ribosomaal RNA. </li></ol> 7. Representatieve resultaten: Figuur 2 presenteert de resultaten van een reeks analyses evaluatie van de kwaliteit en functionaliteit van het vertalen van ribosomen geïsoleerd met behulp van de procedure geschetst. De waarneming van een unieke band opgelost in polyacrylamide gels duidt op de aanwezigheid van polypeptiden gebonden aan de biotine-gelabelde mRNA&#39;s verbonden aan het SMB (Figuur 2A). De zuivering van ribosomaal RNA&#39;s gebruik van deze procedure stelt de aanwezigheid van ribosomen gebonden aan deze biotine-gelabelde mRNA&#39;s, maar ook (Figuur 2B). Toevoeging van puromycine, een antibioticum dat de peptidyl-transferase activiteit van het ribosoom induceert, resulteert in een splitsing van de opkomende peptidyl-tRNA&#39;s 1. Dit wordt waargenomen als een verschuiving in het migratiepatroon van het geïsoleerde polypeptide in polyacrylamide gels (figuur 2C). Samen vormen deze gegevens blijkt dat biotine-gelabelde mRNA&#39;s verbonden aan het SMB functionele ribosomen bevatten met peptidyl-tRNA&#39;s. De isolatie van het vertalen van ribosomen met specifieke peptidyl-tRNA&#39;s maakt de studie van de effecten van peptidyl-tRNA&#39;s, antibiotica, en andere moleculen, op ribosoom functie (figuur 3A) en op ribosoom structuur (Figuur 3B). In de voorbeelden die hier het antibioticum sparsomycin en het aminozuur tryptofaan (Trp) remmen de hydrolytische splitsing van de ontluikende tnaC-tRNA peptidyl-tRNA veroorzaakt door RF2 in de geïsoleerde ribosomen (Figuur 3A). De interactie van sparsomycin of Trp met het ribosoom induceert ook structurele veranderingen in een aantal nucleotiden dat de 23S rRNA van het vertalen van ribosoom (afb. 3B) vormen. Kortom, de biologisch materiaal verkregen met behulp van de hier beschreven procedure zijn nuttig bij het verkrijgen van extra inzicht in de structurele contacten die betrokken zijn bij de remming van ribosoom-functie op de interactie met verschillende moleculaire factoren. ove_content &quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/2498/2498fig1.jpg" alt="Figuur 1" /> Figuur 1. Procedure die wordt gebruikt voor het produceren en zuiveren het vertalen van ribosomen met peptidyl-tRNA&#39;s. DNA-fragmenten ca. 650 bp in lengte, met de tnaC gen en de aangrenzende regio, in de figuur, worden gebruikt als sjablonen bij het ​​opstellen van mRNA&#39;s met biotine, [(bio) UMP] mRNA. Deze DNA-fragmenten worden geproduceerd door PCR-procedures met de oligodeoxynucleotides aangegeven op de bovenkant van de figuur. Onderstreepte letters markeren de locatie van de T7 promoter gecodeerd in het nucleotide primer. Vetgedrukte letters geven de Shine-Dalgarno sequentie die wordt gebruikt in de vertaling van de tnaC mRNA sequenties. De T7 promoter in het DNA-fragment wordt herkend door T7 RNA-polymerase dat gebruikt wordt om transcriberen (pijl) de tnaC volgorde en het niet-coderende sequentie stroomafwaarts. Transcriptie wordt beëindigd bij het ​​RNA-polymerase bereikt het 3&#39;-uiteinde van het DNA-fragment, na de rpoBC terminator-sequenties (rpoBC &quot;t&quot;). De stam-lus structuur van de rpoBC terminator beschermt de mRNA van de 3&#39;-5 &#39;exoribonuclease activiteit aanwezig in de cel-vrije extracten gebruikt in de in vitro translatie reacties. De geïsoleerde [(bio) UMP] mRNA&#39;s worden gebruikt om de vastgelopen, het vertalen van ribosomen genereren, met behulp van in vitro translatie assays. De tnaC volgorde in de [(bio) UMP] mRNA wordt vertaald door een ribosoom, die stopt wanneer de laatste aminozuur is opgenomen, te wijten aan de afwezigheid van de Release Factor (RF2) uit het reactiemengsel. Het ribosoom-[(bio) UMP] mRNA-complexen geïsoleerd zijn van de totale reactiemengsel met behulp van streptavidine-magnetische-korrels (SMB), die de biotine-gelabelde nucleotiden opgenomen in het mRNA te binden. De kleine en middelgrote bedrijven gebonden aan de ribosoom-[(bio) UMP] mRNA-complexen worden uit de totale reactiemengsel met behulp van een magnetisch veld (MF). <img src="/files/ftp_upload/2498/2498fig2.jpg" alt="Figuur 2" /> Figuur 2. Structurele en functionele analyse van de geïsoleerde complexen. A) In vitro vertaling reacties werden uitgevoerd met [(bio) UMP] mRNA&#39;s waarin het startcodon van het tnaC-gen werd vervangen door een stopcodon. De eindproducten werden geïsoleerd met behulp van streptavidine parels, zoals is aangegeven in figuur 1. Reactieproducten en geïsoleerde moleculen werden vervolgens geanalyseerd door elektroforese op polyacrylamide gels. De tnaC-tRNA en tnaC peptide banden zijn gemarkeerd. B) Totaal RNA werd geïsoleerd uit de vastgelopen complexen met behulp van fenolextractie procedures. Elke geïsoleerde RNA werd opgelost door elektroforese in agarose gels. Ribosomaal RNA (rRNA) worden aangegeven. C) Geïsoleerd complexen die tnaC-tRNA&#39;s werden geïncubeerd met (+) of zonder (-) 0,02 mM puromycine (Puro) bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten. De tnaC peptide werden gemerkt tijdens de vertaling met behulp van [35S]-methionine (A) of [3H]-proline (B). <img src="/files/ftp_upload/2498/2498fig3.jpg" alt="Figuur 3" /> Figuur 3. Structurele en functionele analyse van ribosomen met tnaC-tRNA die zijn gebonden aan de antibiotica sparsomycin, of het aminozuur tryptofaan. A) Geïsoleerde complexen die tnaC-tRNA&#39;s werden geïncubeerd met (+) of zonder (-) sparsomycin (Spar) of tryptofaan (Trp) bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten. Later werden de mengsels gemengd met RF2 en geïncubeerd bij 37 ° C gedurende 20 minuten. B) analyse van methylatie veranderingen in de 23S rRNA veroorzaakt door moleculen binden binnen het ribosoom. Geïsoleerde complexen werden vooraf geïncubeerd met (+) of zonder (-) 2 mM Trp of Spar gedurende 5 min bij 37 ° C. Vervolgens werd een alkylerings agent, dimethyl sulfaat, toegevoegd en het mengsel geïncubeerd bij kamertemperatuur gedurende een extra 20 minuten. Totaal RNA werd geëxtraheerd en primer extensie testen werden uitgevoerd met een [32P]-gelabeld oligodeoxynucleotide complementair zijn aan de nucleotiden van 23S rRNA, die zijn verdeeld stroomafwaarts 100 nucleotiden van de gewijzigde nucleotide. De eindproducten van de uitbreiding assays werden opgelost door elektroforese in polyacrylamide gels. De 23S rRNA nucleotiden beïnvloed door de aanwezigheid van de Trp-of Spar worden aangegeven.

<ol>
	<li>Cruz-Vera, L. R., Gong, M., Yanofsky, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+produced+by+bound+tryptophan+in+the+ribosome+peptidyl+transferase+center+in+response+to+tnaC,+a+nascent+leader+peptide.">Changes produced by bound tryptophan in the ribosome peptidyl transferase center in response to tnaC, a nascent leader peptide.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 103, 3598-3603 (2006).</li><li>Garza-Ramos, G., Xiong, L., Zhong, P., Mankin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+site+of+macrolide+antibiotics+on+the+ribosome:+new+resistance+mutation+identifies+a+specific+interaction+of+ketolides+with+rRNA.">Binding site of macrolide antibiotics on the ribosome: new resistance mutation identifies a specific interaction of ketolides with rRNA.</a> J. Bacteriol. 183, 6898-6907 (2001).</li><li>Gaynor, M., Mankin, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrolide+antibiotics:+binding+site,+mechanism+of+action,+resistance.">Macrolide antibiotics: binding site, mechanism of action, resistance.</a> Curr. Top. Med. Chem. 3, 949-961 (2003).</li><li>Polacek, N., Mankin, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ribosomal+peptidyl+transferase+center:+structure,+function,+evolution,+inhibition.">The ribosomal peptidyl transferase center: structure, function, evolution, inhibition.</a> Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 40, 285-311 (2005).</li><li>Steitz, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+insights+into+the+functions+of+the+large+ribosomal+subunit,+a+major+antibiotic+target.">Structural insights into the functions of the large ribosomal subunit, a major antibiotic target.</a> Keio J. Med. 57, 1-14 (2008).</li><li>Tenson, T., Mankin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibiotics+and+the+ribosome.">Antibiotics and the ribosome.</a> Mol. Microbiol. 59, 1664-1677 (2006).</li><li>Xiong, L., Korkhin, Y., Mankin, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+site+of+the+bridged+macrolides+in+the+Escherichia+coli+ribosome.">Binding site of the bridged macrolides in the Escherichia coli ribosome.</a> Antimicrob Agents Chemother. 49, 281-288 (2005).</li><li>Child, S. J., Miller, M. K., Geballe, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+control+by+an+upstream+open+reading+frame+in+the+HER-2/neu+transcript.">Translational control by an upstream open reading frame in the HER-2/neu transcript.</a> J. Biol. Chem. 274, 24335-24441 (1999).</li><li>Fang, P., Spevak, C. C., Wu, C., Sachs, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+nascent+polypeptide+domain+that+can+regulate+translation+elongation.">A nascent polypeptide domain that can regulate translation elongation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101, 4059-4064 (2004).</li><li>Janzen, D. M., Frolova, L., Geballe, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+translation+termination+mediated+by+an+interaction+of+eukaryotic+release+factor+1+with+a+nascent+peptidyl-tRNA.">Inhibition of translation termination mediated by an interaction of eukaryotic release factor 1 with a nascent peptidyl-tRNA.</a> Mol. Cell. Biol. 22, 8562-8570 (2002).</li><li>Nakatogawa, H., Ito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ribosomal+exit+tunnel+functions+as+a+discriminating+gate.">The ribosomal exit tunnel functions as a discriminating gate.</a> Cell. 108, 629-636 (2002).</li><li>Onouchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nascent+peptide-mediated+translation+elongation+arrest+coupled+with+mRNA+degradation+in+the+CGS1+gene+of+Arabidopsis.">Nascent peptide-mediated translation elongation arrest coupled with mRNA degradation in the CGS1 gene of Arabidopsis.</a> Genes Dev. 19, 1799-1810 (2005).</li><li>Raney, A., Law, G. L., Mize, G. J., Morris, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulated+translation+termination+at+the+upstream+open+reading+frame+in+s-adenosylmethionine+decarboxylase+mRNA.">Regulated translation termination at the upstream open reading frame in s-adenosylmethionine decarboxylase mRNA.</a> J. Biol. Chem. 277, 5988-5994 (2002).</li><li>Cruz-Vera, L. R., Rajagopal, S., Squires, C., Yanofsky, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Features+of+ribosome-peptidyl-tRNA+interactions+essential+for+tryptophan+induction+of+tna+operon+expression.">Features of ribosome-peptidyl-tRNA interactions essential for tryptophan induction of tna operon expression.</a> Mol. Cell. 19, 333-343 (2005).</li><li>Cruz-Vera, L. R., Yanofsky, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conserved+Residues+Asp16+and+Pro24+of+tnaC-tRNAPro+Participate+in+Tryptophan+Induction+of+tna+Operon+Expression.">Conserved Residues Asp16 and Pro24 of tnaC-tRNAPro Participate in Tryptophan Induction of tna Operon Expression.</a> J. Bacteriol. 190, 4791-4797 (2008).</li><li>Cruz-Vera, L. R., Yang, R., Yanofsky, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tryptophan+inhibits+Proteus+vulgaris+tnaC+leader+peptide+elongation,+activating+tna+operon+expression.">Tryptophan inhibits Proteus vulgaris tnaC leader peptide elongation, activating tna operon expression.</a> J Bacteriol. 191, 7001-7006 (2009).</li><li>Cruz-Vera, L. R., New, A., Squires, C., Yanofsky, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosomal+features+essential+for+tna+operon+induction:+tryptophan+binding+at+the+peptidyl+transferase+center.">Ribosomal features essential for tna operon induction: tryptophan binding at the peptidyl transferase center.</a> J. Bacteriol. 189, 3140-3146 (2007).</li><li>Shimizu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+translation+reconstituted+with+purified+components.">Cell-free translation reconstituted with purified components.</a> Nat. Biotechnol. 19, 751-755 (2001).</li><li>Kinoshita, Y., Nishigaki, K., Husimi, Y. F. l. u. o. r. e. s. c. e. n. c. e. -. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=isotope-+or+biotin-labeling+of+the+5+'-end+of+single-stranded+DNA/RNA+using+T4+RNA+ligase.">isotope- or biotin-labeling of the 5 '-end of single-stranded DNA/RNA using T4 RNA ligase.</a> Nucleic Acids Res. 25, 3747-3748 (1997).</li><li>Nishigaki, K., Taguchi, K., Kinoshita, Y., Aita, T., Husimi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Y-ligation:+an+efficient+method+for+ligating+single-stranded+DNAs+and+RNAs+with+T4+RNA+ligase.">Y-ligation: an efficient method for ligating single-stranded DNAs and RNAs with T4 RNA ligase.</a> Mol Divers. 4, 187-190 (1998).</li></ol>

Deze isolatie procedure beschreven in dit rapport is zeer reproduceerbaar. Helaas kan de aanwezigheid van korte peptidyl-tRNA&#39;s uit dezelfde vertaalde sequenties niet gemakkelijk worden vermeden, zoals peptidyl-tRNA&#39;s kunnen komen overeen met 15-20% van het totaal geïsoleerde materiaal (figuur 2C). Deze verontreinigingen kunnen toename van de concentratie bij hogere concentraties van biotine-gelabelde mRNA zijn gebruikt of wanneer de gebruikte cel-vrije extracten oud zijn of zijn geweest hergebruikt meerdere malen. Daarom is het zeer belangrijk om de controle van de kwaliteit en de concentratie van de componenten van de in vitro translatie reacties. Als alternatief, commerciële hoog rendement gereconstitueerd celvrije extracten beschikbaar zijn die gebruikt kunnen worden voor dezelfde doeleinden (PURE-systeem) 18. Met behulp van deze methode is biotine-16-UMP willekeurig opgenomen over de lengte van het doel-mRNA. Er is een mogelijkheid dat sommige ORF&#39;s bevatten uridine traktaten kan hebben opgenomen dit nucleotide gewijzigd in hun sequenties, die hun vertaling. Variabele relatieve concentraties van biotin-16-UTP/UTP moeten worden getest tijdens de synthese van het mRNA in om de meest efficiënte vertaling te verkrijgen. Alternatieve methoden van biotine de etikettering kunnen worden gebruikt, gericht op het 5&#39;-uiteinde, de meest stabiele einde van het mRNA&#39;s. (I) Biotine kan worden bevestigd aan het 5&#39;-uiteinde van het mRNA met behulp van 3&#39;-NH2ATP (3&#39;-amino, 3&#39;-deoxyadenosine trifosfaat) en T4 RNA-ligase 19. (Ii) 5&#39;-uiteinde biotine-gelabelde oligonucleotide kan worden bevestigd aan het 5&#39;-uiteinde van het mRNA met behulp van RNA-T4 ligase ook 20. (Iii) 3&#39;-uiteinde biotine-gelabeld oligodeoxynucleotides om de complementaire sequentie overeenkomen aan het 5&#39;-uiteinde van het mRNA kan ook worden gebruikt om het vertalen van complexen te isoleren. Deze biotine gelabelde oligodeoxynucleotides kunnen worden gehecht aan de SMB voorafgaand aan de isolatie. Later werd de SMB aan de biotine-gelabelde oligodeoxynucleotides kan worden gemengd met de vertaling reactiemengsel zodat interactie mogelijk is met hun complementaire mRNA-sequenties. Na isolatie van de hybride RNA-DNA regio - en het gebied hybridiseren tussen de biotine-gelabelde oligodeoxynucleotide en de mRNA-volgorde - kon worden afgebroken met behulp van RNAse H, het scheiden van de vastgelopen complexen uit de streptavidine kralen. Deze alternatieve methode kan toestaan ​​dat de complexen te worden ingezet in de toekomst structurele analyses met behulp van een hogere resolutie methoden.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Tris base</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>252859</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Magnesium acetate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fluka</td>
<td>63049</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Potassium glutamate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>G1501</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ammonium acetate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fluka</td>
<td>09688</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PMSF</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P7626</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Protein A sepharose 4B slurry beads</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P9424</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Leupeptin inhibitor</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>L9783</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Taq-DNA polymerase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Stratagene</td>
<td>201223</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>T7 Maxiprep kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Promega</td>
<td>P1300</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>SMB</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Promega</td>
<td>Z5482</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Biotin-16-UTP</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche</td>
<td>1388908</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>ATP</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>A7699</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>GTP</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>G8877</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PEP</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P7002</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PK</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P7768</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Polyethylenglycol 8000</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fluka</td>
<td>81268</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Folinic acid</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fluka</td>
<td>47612</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Spermidine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fluka</td>
<td>85558</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>tRNA from E. coli</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>R1753</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DEPC</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>D5758</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tricine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>T5816</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L-amino acids</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>LAA21</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DTT</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fluka</td>
<td>43815</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>magnetic separation stands</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Promega</td>
<td>Z5342</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

isolation of translating ribosomes containing peptidyl-trnas for functional and structural analyses

Onlangs hebben de structurele en biochemische studies gedetailleerde veel van de moleculaire gebeurtenissen die in het ribosoom tijdens de remming van de eiwitsynthese door antibiotica en tijdens de ontluikende polypeptide synthese. Een aantal van deze antibiotica, en de regelgeving ontluikende Polypeptiden meestal in de vorm van peptidyl-tRNA&#39;s, remmen of peptide binding vorming of vertaling beëindiging 1-7. Deze remmende gebeurtenissen kunnen de beweging van het ribosoom te stoppen, een fenomeen aangeduid als &quot;translationeel arresteren&quot;. Vertaling arrestatie veroorzaakt door ofwel een antibioticum of een ontluikende polypeptide is aangetoond dat de expressie van genen die betrokken zijn bij diverse cellulaire functies, zoals celgroei, resistentie tegen antibiotica, eiwit translocatie en celmetabolisme 8-13 reguleren. Kennis van hoe antibiotica en regelgeving ontluikende Polypeptiden alter ribosoom-functie is van essentieel belang als we de volledige rol van het ribosoom in vertaling, in elk organisme te begrijpen. We beschrijven hier een eenvoudige methodologie die gebruikt kan worden om uitsluitend te zuiveren,, voor analyse, die ribosomen vertalen van een specifiek mRNA en met een specifieke peptidyl-tRNA 14. Deze procedure is gebaseerd op de selectieve isolatie van het vertalen van ribosomen gebonden aan een biotine-gelabelde mRNA. Deze translationeel complexen worden gescheiden van de andere ribosomen in hetzelfde mengsel, met behulp van streptavidine paramagnetische kralen (SMB) en een magnetisch veld (MF). Biotine-gelabelde mRNA&#39;s worden gesynthetiseerd door run-off transcriptie testen met behulp van sjablonen als PCR-gegenereerde DNA-fragmenten die T7 transcriptionele promoters bevatten. T7 RNA-polymerase bevat biotine-16-UMP van biotine-UTP; onder onze voorwaarden ongeveer tien biotine-16-UMP moleculen worden opgenomen in een 600 nt mRNA met een 25% UMP inhoud. Deze biotine-gelabelde mRNA&#39;s worden dan geïsoleerd, en worden gebruikt in de in vitro translatie testen uitgevoerd met versie factor 2 (RF2)-lege cel-vrij verkregen extracten van Escherichia coli stammen die wild-type of mutant ribosomen. Ribosomen vertalen van de biotine-gelabelde mRNA sequenties zijn vastgelopen op het stopcodon regio, te wijten aan de afwezigheid van de RF2 eiwit, dat normaal gesproken vervult vertaling beëindiging. Vastgelopen ribosomen met de nieuw gesynthetiseerde peptidyl-tRNA zijn geïsoleerd en verwijderd uit de vertaling reacties met behulp van SMB en een MF. Deze kralen binden biotine-bevattende berichten. De geïsoleerde, translationele complexen, kan gebruikt worden om de structurele en functionele kenmerken van wild type of mutant ribosomaal onderdelen, of peptidyl-tRNA sequenties, alsmede voor het bepalen ribosoom interactie met antibiotica of andere moleculaire factoren 1,14-16 te analyseren. Om te onderzoeken van de functie van deze geïsoleerde ribosoom complexen, kan peptidyl-transferase onderzoeken worden uitgevoerd in de aanwezigheid van het antibioticum puromycine 1. Om te studeren structurele veranderingen in de translationele complexen, kan goed vastgelegde procedures worden gebruikt, zoals i) het verknopen van specifieke aminozuren 14 en / of ii) de bescherming van alkylering assays 1,14,17.

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Translating Ribosomes Containing Peptidyl-tRNAs for Functional and Structural Analyses at JoVE.com

Isolation of Translating Ribosomes Containing Peptidyl-tRNAs for Functional and Structural Analyses

Een belangrijke belemmering voor de biochemische analyses van de ribosomen met ontluikende peptidyl-tRNA&#39;s is de aanwezigheid van andere ribosomen zijn in dezelfde monsters, ribosomen niet betrokken bij de vertaling van de specifieke mRNA-sequentie worden geanalyseerd. We ontwikkelden een eenvoudige methode om uitsluitend te zuiveren,, de ribosomen met de ontluikende peptidyl-tRNA van belang.

Isolatie van vertalen Ribosomen bevattende peptidyl-tRNA&#39;s voor functionele en structurele analyses

Recently, structural and biochemical studies have detailed many of the molecular events that occur in the ribosome during inhibition of protein synthesis ...

Research

JoVE Journal

Biology

Crystallizing Membrane Proteins for Structure Determination using Lipidic Mesophases

Kristalliseren membraaneiwitten voor structuurbepaling met behulp van lipide mesofasen

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the ...

Evisceration of Mouse Vitreous and Retina for Proteomic Analyses

Verwijderen van de ingewanden van de muis glasvocht en het netvlies voor Proteoom Analyses

While the mouse retina has emerged as an important genetic model for inherited retinal disease, the mouse vitreous remains to be explored. The vitreous is ...

Isolation and Characterization of RNA-Containing Exosomes

Isolatie en karakterisatie van RNA-bevattende Exosomes

The field of exosome research is rapidly expanding, with a dramatic increase in publications in recent years. These small vesicles (30-100 nm) of ...

Chromatographic Purification of Highly Active Yeast Ribosomes

Chromatografische zuivering van sterk actieve gist Ribosomen

Eukaryotic ribosomes are much more labile as compared to their eubacterial and archael counterparts, thus posing a significant challenge to researchers.  ...

Use of a Robot for High-throughput Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Gebruik van een robot voor High-throughput Kristallisatie van membraaneiwitten in lipide mesofasen

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through ...

Harvesting and Cryo-cooling Crystals of Membrane Proteins Grown in Lipidic Mesophases for Structure Determination by Macromolecular Crystallography

Oogst en Cryo-koeling kristallen van membraaneiwitten Grown in lipide mesofasen voor structuurbepaling door Macromoleculaire Kristallografie

An important route to understanding how proteins function at a mechanistic level is to have the structure of the target protein available, ideally at ...

Isolation, Culture, and Functional Characterization of Adult Mouse Cardiomyoctyes

Isolatie, Cultuur en functionele karakterisering van volwassen muis Cardiomyoctyes

The use of primary cardiomyocytes (CMs) in culture has provided a powerful complement to murine models of heart disease in advancing our understanding of ...

Reconstitution of a Kv Channel into Lipid Membranes for Structural and Functional Studies

Reconstructie van een Kv kanaal in Lipid Membranen voor structurele en functionele studies

To study the lipid-protein interaction in a reductionistic fashion, it is necessary to incorporate the membrane proteins into membranes of well-defined ...

Isolation and Functional Analysis of Mitochondria from Cultured Cells and Mouse Tissue

Isolatie en functionele analyse van Mitochondriën uit gekweekte cellen en muis Tissue

Comparison between two or more distinct groups, such as healthy vs. disease, is necessary to determine cellular status. Mitochondria are at the nexus of ...

Methods for the Isolation, Culture, and Functional Characterization of Sinoatrial Node Myocytes from Adult Mice

Methoden voor de isolatie, Cultuur en functionele karakterisering van de sinusknoop Myocytes van volwassen muizen

Sinoatrial node myocytes (SAMs) act as the natural pacemakers of the heart, initiating each heart beat by generating spontaneous action potentials (APs). ...