Name: isolation of translating ribosomes containing peptidyl-trnas for functional and structural analyses
Uploaded: 2011-02-25T16:03:00
Duration: 11 min 19 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Translating Ribosomes Containing Peptidyl-tRNAs for Functional and Structural Analyses at JoVE.com

LRC-V. רוצה להקדיש את הנייר הזה לזכרו של ד&quot;ר לעדריאל ד ג&#39;ונסון, פרופ &#39;נפלא שאת בעדיפות ראשונה תמיד החינוך של התלמידים. אנחנו מתגעגעים אליך, לעדריאל. אנו אסירי תודה ז&#39;קלין מורנו על עזרתה בביצוע הניסויים המתוארים במחקר זה. מחקר זה נתמך על ידי מענק הניתן CY מן הקרן הלאומית למדע, MCB-0615390, ועל ידי הזנק וקרנות הניתנים LRC-V. מאוניברסיטת אלבמה בהאנטסוויל.

1. תא הכנה חלץ חינם. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שני גרם של Escherichia coli יבש חיידקי גלולה המתקבל יומן אמצע תרבויות שלב נשטפים, פעמיים, עם ליטר וחצי של חיץ מ&quot;מ המכיל 10 טריס-אצטט, pH 8.0, מגנזיום אצטט 14 מ&quot;מ, אצטט אשלגן 60 מ&quot;מ, 50 מיקרוגרם / phenylmethanesulphonylfluoride מ&quot;ל (PMSF) על ידי צנטריפוגה ב 5000 X גרם ל 5 דקות ב 4 ° C. לאחר כביסה, גלולה החיידק הוא resuspended ב 40 מ&quot;ל של חיץ א </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים חיידקיים הם שיבשו באמצעות העיתונות הצרפתית, החלת 6000 בלחץ psi. לחץ זה מתאים 600 יחידות באמצעות בוכנה אינץ&#39; אחד. המתלים שיבשו נאסף בתוך שפופרת זכוכית נקי (50 מ&quot;ל). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ההשעיה היא שיבשה שטופלו 1 mM dithiotreitol (DTT), והוא centrifuged ב XG 30,000 למשך 30 דקות. ההליך צנטריפוגה חוזרת, באמצעות supernatant שהתקבל. Supernatant הסופי הוא חילק (1 מ&quot;ל) לתוך microtubes. לבסוף, aliquots הם קפואים באמצעות קרח יבש תערובת אתנול או חנקן נוזלי, ומאוחסנים ב -60 ° C או -80 ° C. </li></ol> 2. הכנת תמציות חינם Cell מדולדלים של RF2. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 4.5 מ&quot;ל של חלבון 4B חרוזים sepharose slurry מעורבבים עם 5 מ&quot;ל של אנטי RF2 אנטי סרום באמצעות גלגל מסתובב בטמפרטורת החדר, במשך שעה אחת. התערובת היא centrifuged ב 2500 XG להפריד את החרוזים מן antiserum. לאחר השלכת supernatant, חרוזים אלה המכילים את אנטי RF2 נוגדנים (אנטי RF2 חרוזים) נשטפים בהמשך מ&quot;ל 1 של חיץ B המכיל 35 מ&quot;מ על ידי resuspension טריס-אצטט pH 7.8, מגנזיום אצטט 10 מ&quot;מ, 30 אמוניום אצטט מ&quot;מ, 60 גלוטמט אשלגן מ&quot;מ ו 5 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​של מעכבי proteinase leupeptin. אנטי RF2 חרוזים מופרדות מכן על ידי צנטריפוגה באמצעות אותם התנאים שצוינו לעיל מתוך המאגר B. ההליך כביסה חוזרים פעמיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחת מ&quot;ל של תמצית תאים חינם הוא מעורבב עם μL 150 של אנטי RF2 חרוזים באמצעות גלגל מסתובב, ב 4 ° C, למשך שעתיים. התערובת היא centrifuged ב XG 10,000 להפריד את תמצית תאים ללא החרוזים. Supernatant מוסר והתייחס שוב עם μL 150 נוסף של אנטי RF2 חרוזים. הליך זה חזר פעם נוספת עם פתרון התא ללא כתוצאה לחלץ. הפתרון הסופי תא ללא לחלץ הוא חילק (100 μL) לתוך microtubes. Aliquots קפואים באמצעות קרח יבש תערובת אתנול או חנקן נוזלי, ומאוחסנים ב -60 ° C או -80 ° C. </li></ol> 3. הכנת תבנית ה-DNA. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 1 מ&quot;ל PCR-600 תגובה על ידי femtomoles ערבוב של תבנית פלסמיד המכיל את רצפי להיות מתורגם (איור 1), עם 0.4 nanomoles של כל אחד oligodeoxynucleotides המצוין איור 1, 0.2 micromoles של dNTP כל 50-U של תקי פולימראז ה-DNA למאגר מסופק על ידי Stratagene ושות בצע את התגובה הגברה בתנאים בצע: 94 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות, (94 ° C למשך 30 שניות, 55 ° C למשך 30 שניות, 72 ° C עבור 1 דקה; עבור 30 מחזורי) ו 72 מעלות צלזיוס למשך 12 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטהר את מוצרי ה-PCR על ידי מזרז את ה-DNA על ידי הוספת נפח 1 / 10 של נתרן אצטט M 3, pH 5.2, ו - 2 כרכים של אתנול קרים כקרח. חזור על הליך משקעים פעם נוספת. Resuspend ה-DNA של 100 μL diethyl-pyrocarbonate (DEPC) טיפול במים. בדרך כלל, הליך זה מניב 100 מיקרוגרם של מוצר bp 600 דנ&quot;א. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את שלמות המוצרים PCR על ידי אלקטרופורזה על ג&#39;ל agarose. </li></ol> 4. הכנת ה-mRNA ביוטין תווית. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן μL 100 בתגובה שעתוק במבחנה במים שטופלו DEPC ידי ערבוב 5 מיקרוגרם של ה-PCR שנוצר שבר את ה-DNA עם 0.5 micromoles של ה-ATP, CTP, GTP, 0.3 micromoles של UTP, 50 nanomoles של ביוטין-16-UTP, ו - 10 μL תערובת של אנזים T7 במאגר מסופק על ידי Promega ושות דגירה את תערובת התגובה על 37 מעלות צלזיוס במשך 3 שעות. כדי לכמת את כמות ה-mRNA המתקבל, תבנית ה-DNA צריך לחסל על ידי הוספת RNase ללא DNase. דגירה התגובה על 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטהר את מוצרי ה-mRNA על ידי מזרז את הרנ&quot;א על ​​ידי הוספת נפח 1 / 10 של נתרן אצטט M 3, pH 5.2, ו - 2 כרכים של אתנול קר. חזור על הליך משקעים פעם נוספת. Resuspend ה-mRNA של 100 μL מים שטופלו DEPC. בדרך כלל, זה הליך התשואות בין 1-2 מ&quot;ג של ביוטין 600 nt שכותרתו מוצר ה-mRNA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את שלמות המוצרים שכותרתו ביוטין mRNA על ידי אלקטרופורזה על ג&#39;ל agarose. </li></ol> 5. בידוד של הריבוזומים תרגום המכיל Peptidyl-tRNA. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 500 μL של בתערובת תרגום במבחנה התגובה במים שטופלו DEPC ידי ערבוב 10-15 מיקרוגרם של ה-mRNA, ביוטין שכותרתו עם 75 nanomoles של כל אחד חומצות אמינו nineteen, למעט חומצה אמינית אשר יוחלפו על ידי חומצה אמינית רדיואקטיבי , 50 μCi של חומצה אמינית רדיואקטיבי (37MBq), ו 20-5<html> 0 μL של תמצית התא ללא RF2-מדולדל, בתערובת התגובה שנאגרו המכיל 40 מ&quot;מ טריס-אצטט, pH 8.0, מגנזיום אצטט 10 מ&quot;מ, 175 אצטט mM אשלגן, 10 אמוניום אצטט מ&quot;מ, 2 מ&quot;מ DTT, 2 mM ATP, 0.5 mM GTP, phosphoenolpyruvate 30 מ&quot;מ (PEP), 0.3 U / mL קינאז pyruvate (קי), פוליאתילן גליקול 8000 3.5%, 1 spermidine מ&quot;מ, 20 מיקרוגרם / חומצה folinic מ&quot;ל, ו -250 מיקרוגרם / מ&quot;ל tRNA מ E. coli. דגירה את תערובת התגובה על 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. סדר תוספת של מרכיבי התגובה היא מאוד חשובה. תמצית התא ללא חייב להיות מעורב הראשון עם הפתרון למאגר המכיל את חומצות האמינו ואת התערובת הסופית מודגרות במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר כדי לאפשר הפעלה של הריבוזומים. מאוחר יותר, ביוטין, כינה את mRNAs מתווספים. עבור ניתוחים מבניים באמצעות הליכי שינוי כימי, תוספת של חומצה אמינית רדיואקטיבי אינה נדרשת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים לתערובת את התרגום התגובה - 3 מ&quot;ל של חרוזים streptavidin פאראמגנטיים (SMB) תלויה חיץ C המכיל 35 מ&quot;מ טריס-אצטט, pH 8.0, מגנזיום אצטט 10 מ&quot;מ, 175 אצטט mM אשלגן, 10 mM אמוניום אצטט DTT 1 מ&quot;מ. לדגור על השעיית חדש בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפרד את SMB מתערובת על ידי הפעלת שדה מגנטי (MF) באמצעות עומד הפרדה מגנטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend ה-SMB במאגר C ו-להפריד בין החרוזים שוב באמצעות MF. חזור על נוהל זה שטיפה פעמיים. Resuspend את החרוזים μL 500 של חיץ C, לאחסן את ההשעיה על קרח, לבצע את ההליך הבא מיד. </li></ol> 6. ניתוח של הריבוזומים מבודד מכיל את Peptidyl-tRNA. עבור peptidyl-tRNA <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים 10 μL של ה-SMB (תלוי חיץ C) עם 10 μL של חיץ טעינת המכיל 50 מ&quot;מ טריס-HCl, pH 6.8, 2.5% (V / V) גליצרול, נתרן גופרתי 4% dodecyl, 2 מ&quot;מ DTT ו - 0.2 מ&quot;ג / mL bromophenol כחול. פתור את הרכיבים המחוברים חרוזים ידי הפעלת דגימות 10% טריס-tricine ג&#39;לים polyacrylamide. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יבש את הג&#39;לים באמצעות ואקום ג&#39;ל מייבש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את שלמות וטיהור של peptidyl-tRNA ידי חשיפת ג&#39;ל יבשים לצלם רנטגן. </li></ol> עבור RNA ריבוזומלי <ol start="4" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 190 μL של 2 פתרון ethylenediaminetetraacetate (EDTA) מ&quot;מ מוכן עם מים DEPC שטופלו, ו 200 μL של פנול equilibrated עם מים, כדי μL 10 ההשעיה חרוז. מערבבים את ההשעיה על ידי vortexing נמרץ להפריד את שלב אורגניים משלב אורגני על ידי צנטריפוגה ב XG 10,000 עבור 3 דקות בטמפרטורת החדר. אסוף את שכבת המים העליונה microtube חדש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשקע RNA משכבת ​​המים על ידי הוספת נפח 1 / 10 של נתרן אצטט M 3, pH 5.2, 1 μL של 20 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​של תמיסת גליקוגן, 2 כרכים של אתנול קר כקרח. Resuspend רנ&quot;א μL 10 מים DEPC שטופלו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את שלמות RNAs ריבוזומלי ידי אלקטרופורזה על ג&#39;ל agarose. בדרך כלל, 50 μL ההשעיה חרוזים התשואות 1μg של רנ&quot;א ריבוזומלי. </li></ol> 7. נציג תוצאות: תרשים 2 מציג את התוצאות של סדרת הניתוחים הערכת איכות התפקוד של הריבוזומים תרגום מבודד באמצעות ההליך המתואר. תצפית של להקה ייחודית נפתרה ג&#39;לים polyacrylamide מעיד על קיומו של פוליפפטידים מאוגדים ביוטין שכותרתו mRNAs מצורף ה-SMB (איור 2 א). טיהור RNAs ריבוזומלי באמצעות הליך זה קובע את נוכחותו של הריבוזומים קשורים אלה ביוטין שכותרתו mRNAs, כמו גם (2B איור). הוספת puromycin, אנטיביוטיקה שגורם לפעילות peptidyl-transferase של הריבוזום, התוצאות המחשוף של המתהווה peptidyl-tRNAs 1. זהו כפי שנצפה שינוי בדפוסי ההגירה של פוליפפטיד בודד ג&#39;לים polyacrylamide (איור 2C). יחד, נתונים אלה מצביעים על כך ביוטין שכותרתו mRNAs מצורף ה-SMB מכילים ריבוזומים פונקציונלי עם peptidyl-tRNAs. הבידוד של הריבוזומים תרגום המכיל ספציפי peptidyl-tRNAs היתרי חקר את ההשפעות של peptidyl-tRNAs, אנטיביוטיקה, ומולקולות אחרות, על תפקיד הריבוזום (איור 3A), וכן על מבנה הריבוזום (איור 3B). בכל הדוגמאות שהוצגו כאן sparsomycin אנטיביוטי לבין חומצת אמינו טריפטופן (TRP) לעכב את המחשוף hydrolytic של המתהווה tnaC-tRNA peptidyl-tRNA המושרה על ידי RF2 את הריבוזומים מבודד (איור 3A). האינטראקציה של sparsomycin או TRP עם הריבוזום גורם גם שינויים מבניים כמה נוקלאוטידים, המהווים את rRNA 23S של הריבוזום מתרגם (איור 3B). לסיכום, חומר ביולוגי שהושגו באמצעות ההליך המתואר כאן מועילים בהשגת הבנה נוספת של הקשרים המבניים המעורבים עיכוב של פונקציה הריבוזום על האינטראקציה שלו עם גורמים מולקולריים שונים. ove_content &quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/2498/2498fig1.jpg" alt="איור 1" /> באיור 1. נוהל המשמש לייצור ולטהר הריבוזומים תרגום המכיל peptidyl-tRNAs. שברי DNA CA. 650 נ&quot;ב אורך, המכיל את הגן tnaC ואת האזור הסמוך שלו, שמוצג באיור, משמשים כתבניות בהכנת mRNAs המכיל ביוטין, [(ביו) UMP] mRNA. שברים אלה DNA המיוצרים על ידי נהלים PCR באמצעות oligodeoxynucleotides המצוין בחלק העליון של הדמות. אותיות המסומנות בקו תחתון לסמן את המיקום של האמרגן T7 מקודד פריימר נוקלאוטיד. באותיות לציין את רצף Shine-Dalgarno המשמש התרגום של רצפי ה-mRNA tnaC. האמרגן T7 בקטע ה-DNA הוא מוכר על ידי RNA פולימראז T7 המשמש לתמלל (חץ) את רצף tnaC ואת ללא קידוד במורד רצף. תמלול הוא הופסק כאשר RNA פולימראז מגיע לסוף 3&#39;של קטע ה-DNA, לאחר רצף שליחות קטלנית rpoBC (rpoBC &quot;t&quot;). המבנה גזע לולאה של שליחות קטלנית rpoBC מגן על ה-mRNA מההווה פעילות 3&#39;-5 &quot;exoribonuclease את התא ללא תמציות בשימוש בתגובות במבחנה תרגום. מבודדים [(ביו) UMP] mRNAs משמשים ליצירת נתקע, ריבוזומים תרגום, תוך שימוש ב מבחני חוץ גופית תרגום. רצף tnaC ב [(ביו) UMP] mRNA מתורגם ע&quot;י הריבוזום אשר דוכני כאשר החומצה האמינית האחרונה משולב, בשל העדר גורם שחרור (RF2) מתערובת התגובה. הריבוזום-[(ביו) UMP] מתחמי mRNA מבודדים מתערובת התגובה הכולל שימוש streptavidin מגנטי, חרוזים (SMB) המחייבות את ביוטין שכותרתו נוקלאוטידים שולבו-mRNA. עסקים קטנים ובינוניים חייב את הריבוזום-[(ביו) UMP] מתחמי mRNA המחולצים מתערובת התגובה הכולל באמצעות שדה מגנטי (MF). <img src="/files/ftp_upload/2498/2498fig2.jpg" alt="איור 2" /> איור 2. מנתחת מבניים ותפקודיים של מתחמי מבודדים. א) תגובות במבחנה תרגום בוצעו עם [(ביו) UMP] mRNAs שבו קודון ההתחלה של הגן tnaC הוחלף קודון עצירה. המוצרים הסופיים היו מבודדים באמצעות חרוזים streptavidin, כפי שעולה באיור 1. תוצרי התגובה ומולקולות מבודד נותחו לאחר מכן על ידי אלקטרופורזה על ג&#39;ל polyacrylamide. TnaC-tRNA ו tnaC להקות פפטיד מסומנים. ב) סך RNA היה מבודד מן מתחמי נתקע באמצעות מיצוי הליכים פנול. כל RNA בודד נפתרה על ידי אלקטרופורזה ב agarose ג&#39;לים. RNAs ריבוזומלי (rRNAs) מצוינים. ג) מתחמי מבודד המכיל tnaC-tRNAs הודגרו עם (+) או בלי (-) 0.02 mM puromycin (פורו) בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. הפפטיד tnaC תויגו במהלך התרגום באמצעות [35S]-מתיונין (א) או [3H]-פרולין (B). <img src="/files/ftp_upload/2498/2498fig3.jpg" alt="איור 3" /> איור 3. מנתחת מבניים ותפקודיים של הריבוזומים המכיל tnaC-tRNA המאוגדים sparsomycin אנטיביוטי, או חומצת אמינו טריפטופן. א) מתחמי מבודד המכיל tnaC-tRNAs הודגרו עם (+) או בלי (-) sparsomycin (Spar) או טריפטופן (TRP) בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות. מאוחר יותר, תערובות היו מעורבבים עם RF2 וטופחו על 37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. ב) ניתוח השינויים מתילציה ב 23S rRNA הנגרם על ידי מולקולות מחייב בתוך הריבוזום. מתחמי מבודד היו מראש מודגרות עם (+) או בלי (-) 2 מ&quot;מ או TRP Spar במשך 5 דקות ב 37 ° C. ואז, סוכן אלקילציה, דימתיל סולפט, נוספה ותערובות מודגרות בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות נוספות. סך RNA הופק והסיומת מבחני פריימר בוצעו עם [32P] שכותרתו oligodeoxynucleotide משלים את הנוקליאוטידים של rRNA 23S אשר מחולקת 100 נוקלאוטידים downstream של נוקלאוטיד שונה. המוצרים הסופיים של מבחני הרחבה נפתרו על ידי אלקטרופורזה על ג&#39;ל polyacrylamide. נוקלאוטידים 23S rRNA מושפעים על ידי נוכחות של TRP או Spar מצוינים.

<ol>
	<li>Cruz-Vera, L. R., Gong, M., Yanofsky, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+produced+by+bound+tryptophan+in+the+ribosome+peptidyl+transferase+center+in+response+to+tnaC,+a+nascent+leader+peptide.">Changes produced by bound tryptophan in the ribosome peptidyl transferase center in response to tnaC, a nascent leader peptide.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 103, 3598-3603 (2006).</li><li>Garza-Ramos, G., Xiong, L., Zhong, P., Mankin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+site+of+macrolide+antibiotics+on+the+ribosome:+new+resistance+mutation+identifies+a+specific+interaction+of+ketolides+with+rRNA.">Binding site of macrolide antibiotics on the ribosome: new resistance mutation identifies a specific interaction of ketolides with rRNA.</a> J. Bacteriol. 183, 6898-6907 (2001).</li><li>Gaynor, M., Mankin, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrolide+antibiotics:+binding+site,+mechanism+of+action,+resistance.">Macrolide antibiotics: binding site, mechanism of action, resistance.</a> Curr. Top. Med. Chem. 3, 949-961 (2003).</li><li>Polacek, N., Mankin, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ribosomal+peptidyl+transferase+center:+structure,+function,+evolution,+inhibition.">The ribosomal peptidyl transferase center: structure, function, evolution, inhibition.</a> Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 40, 285-311 (2005).</li><li>Steitz, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+insights+into+the+functions+of+the+large+ribosomal+subunit,+a+major+antibiotic+target.">Structural insights into the functions of the large ribosomal subunit, a major antibiotic target.</a> Keio J. Med. 57, 1-14 (2008).</li><li>Tenson, T., Mankin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibiotics+and+the+ribosome.">Antibiotics and the ribosome.</a> Mol. Microbiol. 59, 1664-1677 (2006).</li><li>Xiong, L., Korkhin, Y., Mankin, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+site+of+the+bridged+macrolides+in+the+Escherichia+coli+ribosome.">Binding site of the bridged macrolides in the Escherichia coli ribosome.</a> Antimicrob Agents Chemother. 49, 281-288 (2005).</li><li>Child, S. J., Miller, M. K., Geballe, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+control+by+an+upstream+open+reading+frame+in+the+HER-2/neu+transcript.">Translational control by an upstream open reading frame in the HER-2/neu transcript.</a> J. Biol. Chem. 274, 24335-24441 (1999).</li><li>Fang, P., Spevak, C. C., Wu, C., Sachs, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+nascent+polypeptide+domain+that+can+regulate+translation+elongation.">A nascent polypeptide domain that can regulate translation elongation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101, 4059-4064 (2004).</li><li>Janzen, D. M., Frolova, L., Geballe, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+translation+termination+mediated+by+an+interaction+of+eukaryotic+release+factor+1+with+a+nascent+peptidyl-tRNA.">Inhibition of translation termination mediated by an interaction of eukaryotic release factor 1 with a nascent peptidyl-tRNA.</a> Mol. Cell. Biol. 22, 8562-8570 (2002).</li><li>Nakatogawa, H., Ito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ribosomal+exit+tunnel+functions+as+a+discriminating+gate.">The ribosomal exit tunnel functions as a discriminating gate.</a> Cell. 108, 629-636 (2002).</li><li>Onouchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nascent+peptide-mediated+translation+elongation+arrest+coupled+with+mRNA+degradation+in+the+CGS1+gene+of+Arabidopsis.">Nascent peptide-mediated translation elongation arrest coupled with mRNA degradation in the CGS1 gene of Arabidopsis.</a> Genes Dev. 19, 1799-1810 (2005).</li><li>Raney, A., Law, G. L., Mize, G. J., Morris, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulated+translation+termination+at+the+upstream+open+reading+frame+in+s-adenosylmethionine+decarboxylase+mRNA.">Regulated translation termination at the upstream open reading frame in s-adenosylmethionine decarboxylase mRNA.</a> J. Biol. Chem. 277, 5988-5994 (2002).</li><li>Cruz-Vera, L. R., Rajagopal, S., Squires, C., Yanofsky, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Features+of+ribosome-peptidyl-tRNA+interactions+essential+for+tryptophan+induction+of+tna+operon+expression.">Features of ribosome-peptidyl-tRNA interactions essential for tryptophan induction of tna operon expression.</a> Mol. Cell. 19, 333-343 (2005).</li><li>Cruz-Vera, L. R., Yanofsky, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conserved+Residues+Asp16+and+Pro24+of+tnaC-tRNAPro+Participate+in+Tryptophan+Induction+of+tna+Operon+Expression.">Conserved Residues Asp16 and Pro24 of tnaC-tRNAPro Participate in Tryptophan Induction of tna Operon Expression.</a> J. Bacteriol. 190, 4791-4797 (2008).</li><li>Cruz-Vera, L. R., Yang, R., Yanofsky, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tryptophan+inhibits+Proteus+vulgaris+tnaC+leader+peptide+elongation,+activating+tna+operon+expression.">Tryptophan inhibits Proteus vulgaris tnaC leader peptide elongation, activating tna operon expression.</a> J Bacteriol. 191, 7001-7006 (2009).</li><li>Cruz-Vera, L. R., New, A., Squires, C., Yanofsky, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosomal+features+essential+for+tna+operon+induction:+tryptophan+binding+at+the+peptidyl+transferase+center.">Ribosomal features essential for tna operon induction: tryptophan binding at the peptidyl transferase center.</a> J. Bacteriol. 189, 3140-3146 (2007).</li><li>Shimizu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+translation+reconstituted+with+purified+components.">Cell-free translation reconstituted with purified components.</a> Nat. Biotechnol. 19, 751-755 (2001).</li><li>Kinoshita, Y., Nishigaki, K., Husimi, Y. F. l. u. o. r. e. s. c. e. n. c. e. -. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=isotope-+or+biotin-labeling+of+the+5+'-end+of+single-stranded+DNA/RNA+using+T4+RNA+ligase.">isotope- or biotin-labeling of the 5 '-end of single-stranded DNA/RNA using T4 RNA ligase.</a> Nucleic Acids Res. 25, 3747-3748 (1997).</li><li>Nishigaki, K., Taguchi, K., Kinoshita, Y., Aita, T., Husimi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Y-ligation:+an+efficient+method+for+ligating+single-stranded+DNAs+and+RNAs+with+T4+RNA+ligase.">Y-ligation: an efficient method for ligating single-stranded DNAs and RNAs with T4 RNA ligase.</a> Mol Divers. 4, 187-190 (1998).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

הליך זה בידוד שתוארו בדו&quot;ח זה הוא מאוד לשחזור. למרבה הצער, בנוכחות קצר peptidyl-tRNAs המופק רצפי לתרגם אותו לא ניתן להימנע בנוחות, כגון peptidyl-tRNAs מתאימות 15-20% של החומר מבודד הכולל (איור 2C). מזהמים אלה עשויות להגביר את ריכוז כאשר ריכוזים גבוהים יותר של mRNA ביוטין שכותרתו כבר בשימוש או כאשר התא ללא תמציות בהם נעשה שימוש הם ישנים או כבר שימוש חוזר מספר פעמים. לכן, חשוב מאוד לשלוט על איכות הריכוז של מרכיבי בתגובות במבחנה תרגום. לחלופין, יעילות גבוהה מסחרי מחדש תאים ללא תמציות זמינים שיכולים לשמש לאותן מטרות (מערכת PURE) 18. באמצעות שיטה זו, ביוטין-16-UMP משולב באקראי לאורכו של mRNA המטרה. קיימת אפשרות כי חלק ORFs המכיל קטעי uridine יכול להיות משולבים זה שונה נוקליאוטידים ברצפי שלהם, המשפיעים על התרגום שלהם. ריכוזים ביחס משתנה של biotin-16-UTP/UTP צריך להיבדק במהלך סינתזה של mRNA על מנת להשיג את התרגום היעילה ביותר. שיטות חלופיות של תיוג ביוטין יכול לשמש, מיקוד 5&#39;-end, סוף היציב ביותר של mRNAs. (I) ביוטין יכול להיות מצורף בסוף 5&#39;-של ה-mRNA באמצעות 3&#39;-NH2ATP (3&#39;אמינו, 3&#39;-deoxyadenosine טריפוספט) ו-RNA האנזים T4 19. (Ii) 5&#39;-end ביוטין שכותרתו oligonucleotide יכול להיות מצורף בסוף 5&#39;-של ה-mRNA באמצעות האנזים T4-RNA, כמו גם 20. (Iii) 3&#39;סוף ביוטין שכותרתו oligodeoxynucleotides אשר מתאימות רצף משלים בסוף 5&#39;-the-mRNA יכול לשמש גם כדי לבודד את מתחמי תרגום. Oligodeoxynucleotides אלה שכותרתו ביוטין יכול לצרף ה-SMB לפני הבידוד. מאוחר יותר SMB המצורפת ביוטין שכותרתו oligodeoxynucleotides יכול להיות מעורבב עם תערובת התרגום התגובה כדי לאפשר אינטראקציה עם רצפים משלימים שלהם mRNA. לאחר הבידוד, האזור היברידית RNA-DNA - והאזור והכלאה בין oligodeoxynucleotide ביוטין, שכותרתו את רצף ה-mRNA - יכול להיות מושפל באמצעות RNAse H, המפריד בין מתחמי עוכבה מן החרוזים streptavidin. זו שיטה חלופית עשויה לאפשר את מתחמי להיות מועסקים מנתח מבניים בעתיד בשיטות רזולוציה גבוהה יותר.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Tris base</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>252859</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Magnesium acetate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fluka</td>
<td>63049</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Potassium glutamate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>G1501</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ammonium acetate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fluka</td>
<td>09688</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PMSF</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P7626</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Protein A sepharose 4B slurry beads</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P9424</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Leupeptin inhibitor</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>L9783</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Taq-DNA polymerase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Stratagene</td>
<td>201223</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>T7 Maxiprep kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Promega</td>
<td>P1300</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>SMB</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Promega</td>
<td>Z5482</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Biotin-16-UTP</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche</td>
<td>1388908</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>ATP</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>A7699</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>GTP</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>G8877</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PEP</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P7002</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PK</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P7768</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Polyethylenglycol 8000</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fluka</td>
<td>81268</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Folinic acid</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fluka</td>
<td>47612</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Spermidine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fluka</td>
<td>85558</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>tRNA from E. coli</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>R1753</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DEPC</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>D5758</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tricine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>T5816</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L-amino acids</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>LAA21</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DTT</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fluka</td>
<td>43815</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>magnetic separation stands</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Promega</td>
<td>Z5342</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

isolation of translating ribosomes containing peptidyl-trnas for functional and structural analyses

לאחרונה, מחקרים מבניים ביוכימיים רבים יש מפורט של האירועים המולקולריים המתרחשים הריבוזום במהלך עיכוב של סינתזת החלבון על ידי אנטיביוטיקה במהלך הסינתזה פוליפפטיד המתהווה. חלק מאותם אנטיביוטיקה, פוליפפטידים המתהווה הרגולציה בעיקר בצורת peptidyl-tRNAs, לעכב או היווצרות הקשר פפטיד או סיום התרגום 1-7. אירועים אלה מעכבות יכול לעצור את התנועה של הריבוזום, תופעה שמכונה &quot;מעצר translational&quot;. מעצר תרגום המושרה על ידי אנטיביוטיקה או פוליפפטיד המתהווה הוכח לווסת את הביטוי של גנים המעורבים תפקודים תאיים מגוונים כגון צמיחת תאים, עמידות לאנטיביוטיקה, טרנסלוקציה חלבון מטבוליזם התא 8-13. הידע של איך אנטיביוטיקה פוליפפטידים המתהווה הרגולציה לשנות את תפקוד הריבוזום הוא חיוני אם אנחנו רוצים להבין את התפקיד המלא של הריבוזום בתרגום, כל אורגניזם. כאן אנו מתארים מתודולוגיה פשוטה, שניתן להשתמש בהם כדי לטהר, בלעדי, לצורך ניתוח, ריבוזומים אלה בתרגום mRNA ספציפי המכיל מסוים peptidyl-tRNA 14. הליך זה מבוסס על בידוד סלקטיבי של הריבוזומים בתרגום מאוגד mRNA ביוטין שכותרתו. קומפלקסים אלה translational מופרדים הריבוזומים אחרים בתערובת זאת, באמצעות חרוזים פאראמגנטיים streptavidin (SMB) ואת שדה מגנטי (MF). MRNAs ביוטין שכותרתו מסונתזים על ידי נגר מבחני שעתוק באמצעות כתבניות PCR שנוצר שברי דנ&quot;א המכילים מקדמי T7 תעתיק. T7-RNA פולימראז משלבת ביוטין-16-UMP ביוטין מ-UTP, בתנאים שלנו כעשרה ביוטין-16-UMP מולקולות משולבות mRNA nt 600 עם תוכן UMP 25%. אלה ביוטין שכותרתו mRNAs מבודדים אז, השתמשו ב מבחני חוץ גופית התרגום הופיע עם גורם לשחרור 2 (RF2)-מדולדל תא ללא תמציות המתקבל זני Escherichia coli המכיל סוג בר או ריבוזומים מוטציה. הריבוזומים לתרגם את ביוטין שכותרתו רצפי ה-mRNA תקועות על האזור קודון לעצור, בשל העדר של חלבון RF2, אשר בדרך כלל משיג סיום התרגום. הריבוזומים תקוע המכיל את מסונתז החדש peptidyl-tRNA מבודדות להסיר את התגובות תרגום באמצעות SMB ו MF. חרוזים אלה רק לקשור ביוטין המכילים מסרים. מבודד, מתחמי translational, ניתן להשתמש כדי לנתח את התכונות מבניים ותפקודיים של סוג בר או רכיבים ריבוזומלי מוטציה, או peptidyl-tRNA רצפים, כמו גם בקביעת הריבוזום אינטראקציה עם אנטיביוטיקה או גורמים מולקולריים אחרים 1,14-16. כדי לבחון את הפונקציה של אלה מתחמי הריבוזום מבודדים, peptidyl-transferase מבחני יכול להתבצע בנוכחות של אנטיביוטיקה puromycin 1. כדי לחקור שינויים מבניים מתחמי translational, נהלים מבוססת היטב יכול לשמש, כגון i) crosslinking ל 14 חומצות אמינו ספציפיות ו / או ii) הגנה אלקילציה מבחני 1,14,17.

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Translating Ribosomes Containing Peptidyl-tRNAs for Functional and Structural Analyses at JoVE.com

Isolation of Translating Ribosomes Containing Peptidyl-tRNAs for Functional and Structural Analyses

מכשול משמעותי מנתח ביוכימיים של הריבוזומים המכיל המתהווה peptidyl-tRNAs כבר נוכחות של הריבוזומים אחרים דגימות אותו, ריבוזומים לא מעורב בתרגום של רצף ה-mRNA ספציפי להיות מנותח. פיתחנו מתודולוגיה פשוטה כדי לטהר, בלעדי, את הריבוזומים המכיל את המתהווה peptidyl-tRNA של עניין.

בידוד של הריבוזומים תרגום המכילים Peptidyl-tRNAs עבור ניתוח פונקציונלי מבנית

Recently, structural and biochemical studies have detailed many of the molecular events that occur in the ribosome during inhibition of protein synthesis ...

Research

JoVE Journal

Biology

Crystallizing Membrane Proteins for Structure Determination using Lipidic Mesophases

גיבוש חלבונים בממברנה עבור קביעת מבנה באמצעות Mesophases Lipidic

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the ...

Evisceration of Mouse Vitreous and Retina for Proteomic Analyses

הוצאת הקרביים של הזגוגיות עכבר רשתית עבור ניתוח proteomic

While the mouse retina has emerged as an important genetic model for inherited retinal disease, the mouse vitreous remains to be explored. The vitreous is ...

Isolation and Characterization of RNA-Containing Exosomes

בידוד ואפיון של RNA המכיל Exosomes

The field of exosome research is rapidly expanding, with a dramatic increase in publications in recent years. These small vesicles (30-100 nm) of ...

Chromatographic Purification of Highly Active Yeast Ribosomes

טיהור chromatographic של הריבוזומים שמרים מאוד פעיל

Eukaryotic ribosomes are much more labile as compared to their eubacterial and archael counterparts, thus posing a significant challenge to researchers.  ...

Use of a Robot for High-throughput Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

שימוש ברובוט להתגבשות תפוקה גבוהה של חלבונים בממברנה בMesophases Lipidic

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through ...

Harvesting and Cryo-cooling Crystals of Membrane Proteins Grown in Lipidic Mesophases for Structure Determination by Macromolecular Crystallography

קצירה וCryo-קירור גבישים של חלבונים בממברנה גדלו בMesophases Lipidic לקביעת מבנה על ידי קריסטלוגרפיה Macromolecular

An important route to understanding how proteins function at a mechanistic level is to have the structure of the target protein available, ideally at ...

Isolation, Culture, and Functional Characterization of Adult Mouse Cardiomyoctyes

בידוד, תרבות ואפיון פונקציונלי של Cardiomyoctyes מאוס למבוגרים

The use of primary cardiomyocytes (CMs) in culture has provided a powerful complement to murine models of heart disease in advancing our understanding of ...

Reconstitution of a Kv Channel into Lipid Membranes for Structural and Functional Studies

כינונה מחדש של ערוץ Kv לממברנות שומנים בדם למבני ותפקודיים ללימודים

To study the lipid-protein interaction in a reductionistic fashion, it is necessary to incorporate the membrane proteins into membranes of well-defined ...

Isolation and Functional Analysis of Mitochondria from Cultured Cells and Mouse Tissue

בידוד וניתוח פונקציונלי של המיטוכונדריה מתאים בתרבית ורקמות עכבר

Comparison between two or more distinct groups, such as healthy vs. disease, is necessary to determine cellular status. Mitochondria are at the nexus of ...

Methods for the Isolation, Culture, and Functional Characterization of Sinoatrial Node Myocytes from Adult Mice

שיטות הבידוד, תרבות האפיון פונקציונלי של myocytes צומת Sinoatrial של עכברים בוגרים

Sinoatrial node myocytes (SAMs) act as the natural pacemakers of the heart, initiating each heart beat by generating spontaneous action potentials (APs). ...