Name: isolation of translating ribosomes containing peptidyl-trnas for functional and structural analyses
Uploaded: 2011-02-25T16:03:00
Duration: 11 min 19 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Translating Ribosomes Containing Peptidyl-tRNAs for Functional and Structural Analyses at JoVE.com

LRC-V. vill ägna denna uppsats till minne av Dr Adriel D. Johnson, en underbar professor vars prioritet nummer ett var alltid utbildning av studenter. Vi saknar dig, Adriel. Vi är tacksamma för att Jacqueline Moreno för hennes hjälp för att utföra de experiment som beskrivs i denna studie. Denna studie stöddes av ett bidrag som ges till CY från National Science Foundation, MCB-0615390, och genom att starta fonder ges till LRC-V. från University of Alabama i Huntsville.

1. Cell extraktet förberedelse. <ol><li> Två gram torr Escherichia coli bakterier pellets från mitten log fas kulturer tvättas, två gånger, med en halv liter buffert A innehållande 10 mM Tris-acetat, pH 8,0, 14 mm magnesium acetat, 60 mm kaliumacetat och 50 mikrogram / mL phenylmethanesulphonylfluoride (PMSF) genom centrifugering vid 5000 x g 5 min vid 4 ° C. Efter tvätt är den bakteriella pellets återsuspenderade i 40 ml buffert A. </li><li> Bakteriecellerna störs med hjälp av en fransk press, tillämpa 6000 psi tryck. Detta tryck motsvarar 600 enheter med hjälp av en en-tums kolven. Det störde fjädring samlas i en ren glasrör (50 ml). </li><li> Det störde fjädring behandlas med 1 mm dithiotreitol (DTT) och centrifugeras vid 30.000 xgi 30 min. Det centrifugering procedur upprepas, med den resulterande supernatanten. Den slutliga supernatanten doseras (1 ml) i mikrorör. Slutligen är de alikvoter frysta med en torris-etanol blandning eller flytande kväve och förvaras vid -60 ° C eller -80 ° C. </li></ol> 2. Beredning av Cell Free Utdrag Utarmat av RF2. <ol><li> 4,5 mL av protein A sepharose 4B slam pärlor blandas med 5 ml av en anti-RF2 anti-serum med hjälp av ett roterande hjul i rumstemperatur, i en timme. Blandningen centrifugeras vid 2500 xg att skilja pärlor från antiserum. Vid kasta supernatanten är dessa kulor med anti-RF2 antikroppar (anti-RF2 pärlor) senare tvättas genom resuspension i 1 ml buffert B innehållande 35 mM Tris-acetat pH 7,8, 10 mm magnesium acetat, 30 mM ammoniumacetat, 60 mM kalium glutamat och 5 mikrogram / ml leupeptin proteinas hämmare. Den anti-RF2 pärlor separeras sedan från buffert B genom centrifugering med samma villkor som anges ovan. Tvätten upprepas två gånger. </li><li> En ml av den cell-extraktet blandas med 150 mikroliter av anti-RF2 pärlor med hjälp av ett roterande hjul, vid 4 ° C, i två timmar. Blandningen centrifugeras vid 10000 xg att separera cellfria utdrag ur pärlor. Supernatanten avlägsnas och behandlas igen med en annan 150 mikroliter av anti-RF2 pärlor. Denna procedur upprepas ännu en gång med den resulterande cellfria extrakt. Den slutliga cellfria extrakt fördelas (100 mikroliter) i mikrorör. Den alikvoter fryses med en torris-etanol blandning eller flytande kväve och förvaras vid -60 ° C eller -80 ° C. </li></ol> 3. Beredning av en DNA-mall. <ol><li> Bered en 1 mL PCR-reaktionen genom att blanda 600 femtomoles av plasmiden mall som innehåller sekvenser som ska översättas (Fig 1), med 0,4 nanomoles av varje oligodeoxynucleotides anges i figur 1, 0,2 mikromol varje dNTP och 50 U Taq- DNA-polymeras i bufferten levereras av Stratagene Co Utför amplifieringsreaktionen under följande förhållanden: 94 ° C under 2 min, (94 ° C i 30 S, 55 ° C i 30 S, 72 ° C i 1 min, för 30 cykler) och 72 ° C i 12 min. </li><li> Rena PCR-produkter från utlösande DNA genom att lägga till 1 / 10 volym 3 M natriumacetat, pH 5,2 och 2 volymer av iskall etanol. Upprepa nederbörden proceduren en gång till. Resuspendera DNA i 100 mikroliter av Diethyl-pyrocarbonate (DEPC) behandlade vatten. Normalt ger detta förfarande 100 mikrogram av ett 600 bp DNA-produkt. </li><li> Verifiera integriteten av PCR-produkter från elektrofores på agarosgeler. </li></ol> 4. Beredning av Biotin Märkta mRNA. <ol><li> Förbered en 100 mikroliter in vitro transkription reaktion i DEPC behandlade vattnet genom att blanda 5 mikrogram av PCR-genererade DNA-fragment med 0,5 mikromol ATP, CTP, GTP, 0,3 mikromol UTP, 50 nanomoles biotin-16-UTP, och 10 mikroliter av T7 enzym blanda i bufferten levereras av Promega Co Inkubera reaktionsblandningen vid 37 ° C i 3 timmar. För att kvantifiera mängden erhållna mRNA bör DNA-mallen elimineras genom att lägga RNase-fria DNas. Inkubera reaktionen vid 37 ° C i 10 min. </li><li> Rena mRNA produkter av utfällning av RNA genom att lägga till 1 / 10 volym 3 M natriumacetat, pH 5,2 och 2 volymer kall etanol. Upprepa nederbörden proceduren en gång till. Resuspendera mRNA i 100 mikroliter av DEPC behandlade vattnet. Vanligtvis märkt detta förfarande ger mellan 1-2 mg en 600 nt biotin mRNA produkt. </li><li> Verifiera integriteten hos de märkta biotin mRNA produkter från elektrofores på agarosgeler. </li></ol> 5. Isolering av Översättning Ribosomer Innehållande peptidyl-tRNA. <ol><li> Förbered 500 mikroliter av en in vitro översättning reaktionsblandningen i DEPC behandlade vattnet genom att blanda 10-15 mikrogram biotin märkt mRNA med 75 nanomoles av varje av de nitton aminosyror, alla utom den aminosyra som kommer att ersättas med en radioaktiv aminosyra , 50 μCi av en radioaktiv aminosyra (37MBq) och 20-5<html> 0 ìl RF2-utarmat cellfria extrakt, i en buffrad Reaktionsblandning innehållande 40 mM Tris-acetat, pH 8,0, 10 mm magnesium acetat, 175 mm kaliumacetat, 10 mm ammoniumacetat, 2 mM DTT, 2 mm ATP, 0,5 mM GTP, 30 mM fosfoenolpyruvat (PEP), 0,3 U / mL pyruvat kinas (PK), 3,5% polyetylenglykol 8000, 1 mm spermidine, 20 mikrogram / ​​ml folinsyra och 250 mikrogram / ​​ml tRNA från E. coli. Inkubera reaktionsblandningen vid 37 ° C i 10 minuter. Ordningen tillägg av reaktionen komponenterna är mycket viktig. Cellen extraktivämnen måste blandas först med det buffertlösning som innehåller aminosyror och den slutliga blandningen inkuberas i 5 minuter i rumstemperatur för att möjliggöra aktivering av ribosomer. Senare är det biotin-märkt mRNA till. För strukturella analyser med hjälp av kemisk modifiering förfaranden, är tillägget av en radioaktiv aminosyra inte. </li><li> Lägg till översättningen reaktionsblandningen - 3 mL streptavidin paramagnetiska pärlor (SMB) suspenderade i buffert C innehållande 35 mM Tris-acetat, pH 8,0, 10 mm magnesium acetat, 175 mm kaliumacetat, 10 mm ammoniumacetat och 1 mm DTT. Inkubera ny fjädring i rumstemperatur i 10 min. </li><li> Separera SMB från blandningen med hjälp av ett magnetfält (MF) med hjälp av magnetisk separering står. </li><li> Resuspendera SMB i buffert C och separera pärlor igen med MF. Upprepa tvättningen två gånger. Resuspendera pärlor i 500 mikroliter av buffert C, lagra fjädring på is, och utför nästa steg omedelbart. </li></ol> 6. Analys av de isolerade Ribosomer Innehåller peptidyl-tRNA. För peptidyl-tRNA <ol><li> Blanda 10 mikroliter av SMB (suspenderade i buffert C) med 10 mikroliter en buffert innehållande 50 mM Tris-HCl, pH 6,8, 2,5% (v / v) glycerol, 4% natriumdodecylsulfat, 2 mM DTT och 0,2 mg / mL Bromfenolblått. Lösa komponenter som fästs pärlorna genom att köra prover i 10% Tris-tricine polyakrylamidgeler. </li><li> Torka av geler med en dammsugare gel-tork. </li><li> Verifiera integritet och rening av peptidyl-tRNA genom att exponera den torkade gelen till en röntgenfilm. </li></ol> För ribosomalt RNA <ol start="4"><li> Tillsätt 190 mikroliter av 2 mm etylendiamintetraacetat (EDTA) lösning beredd med DEPC-behandlat vatten, och 200 mikroliter av fenol jämvikt med vatten till 10 mikroliter en pärla suspension. Blanda suspensionen av kraftig vortexa och separera oorganiska fasen från den organiska fasen genom centrifugering vid 10000 xg i 3 min i rumstemperatur. Samla upp vattnet lagret i ett nytt mikrorör. </li><li> Fällning RNA från vattnet lagret genom att tillsätta 1 / 10 volym 3 M natriumacetat, pH 5,2, 1 mikroliter av 20 mg / ml av glykogen lösning, och 2 volymer av iskall etanol. Resuspendera RNA i 10 mikroliter av DEPC-behandlat vatten. </li><li> Verifiera integritet ribosomala RNA med elektrofores på agarosgeler. Vanligtvis ger 50 mikroliter av pärlor avstängning 1μg av ribosomala RNA. </li></ol> 7. Representativa resultat: Figur 2 presenterar resultaten av en serie analyser utvärdera kvaliteten och funktionaliteten hos översätta ribosomer isoleras med hjälp av den procedur som beskrivs. Observation av ett unikt band beslutade i polyakrylamidgeler indikerar förekomst av polypeptider bundet till biotin-märkt mRNA ansluten till SMB (Figur 2A). Rening av ribosomala RNA med hjälp av detta förfarande etablerar närvaro av ribosomer bundna till dessa biotin-märkt mRNA, samt (Figur 2B). Tillägg av puromycin, ett antibiotikum som inducerar peptidyl-transferas aktiviteten hos ribosomen, resulterar i klyvning av begynnande peptidyl-tRNAs 1. Detta är observeras som en förskjutning i migration mönster isolerade polypeptid i polyakrylamidgeler (Fig. 2C). Tillsammans utgör dessa uppgifter tyder på att biotin-märkt mRNA knuten till SMB innehålla fungerande ribosomer med peptidyl-tRNAs. Isoleringen att översätta ribosomer som innehåller specifika peptidyl-tRNAs tillåter studier av effekterna av peptidyl-tRNAs, antibiotika och andra molekyler, på ribosomen funktion (Figur 3A), och på ribosomen struktur (Figur 3B). I de exempel som presenteras här antibiotika sparsomycin och aminosyran tryptofan (TRP) hämmar hydrolytisk klyvning av begynnande tnaC-tRNA peptidyl-tRNA inducerad av RF2 i isolerade ribosomer (figur 3A). Samspelet mellan sparsomycin eller Trp med ribosomen också inducerar strukturella förändringar i vissa nukleotider som utgör 23S rRNA av översätta ribosomen (Fig. 3B). Sammanfattningsvis beskrev biologiskt material som erhålls genom det förfarande här är användbara i att få ytterligare förståelse för de strukturella kontakter involverade i hämning av ribosomen funktion på dess interaktion med olika molekylära faktorer. ove_content &quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/2498/2498fig1.jpg" alt="Figur 1" /> Figur 1. Förfarande som används för att producera och rena översättning av ribosomer som innehåller peptidyl-tRNAs. DNA-fragment ca. 650 bp i längd, innehållande tnaC genen och dess angränsande område, som visas i bilden, används som mallar för att förbereda mRNA som innehåller biotin, [(bio) UMP] mRNA. Dessa DNA-fragment är producerade av PCR-förfaranden med oligodeoxynucleotides indikeras överst i figuren. Understrukna bokstäverna markera platsen för de T7 promotorn kodade i nukleotid primer. Fetstil visar Shine-Dalgarno sekvens som används i översättningen av tnaC mRNA-sekvenser. Den T7 promotorn i DNA-fragment är erkänd av T7 RNA-polymeras som används för att transkribera (pil) i tnaC sekvensen och den icke-kodande nedströms sekvens. Transkription är avslutad när RNA-polymeras når 3&#39;-änden av DNA-fragment efter rpoBC sekvenser av terminatorn (rpoBC &quot;t&quot;). Stammen-loop struktur rpoBC terminator skyddar mRNA från 3&#39;-5 &#39;exoribonuclease aktivitet som finns i cellfria extrakt som används i in vitro översättning reaktioner. De isolerade [(bio) UMP] mRNA används för att generera stannade, översättning ribosomer, med hjälp av in vitro översättning analyser. Den tnaC sekvensen i [(bio) UMP] mRNA översätts av en ribosomer som spiltor när den sista aminosyran ingår, på grund av avsaknad av befriande omständighet (RF2) från reaktionsblandningen. Ribosomen-[(bio) UMP] mRNA-komplex är isolerade från den totala reaktionsblandningen med streptavidin-magnetisk-pärlor (SMB) som binder biotin-märkta nukleotider som ingår i mRNA. De små och medelstora företag bundet till ribosomen-[(bio) UMP] mRNA-komplex har hämtats från den totala reaktionsblandningen med hjälp av ett magnetfält (MF). <img src="/files/ftp_upload/2498/2498fig2.jpg" alt="Figur 2" /> Figur 2. Strukturella och funktionella analyser av de isolerade komplex. A) In vitro översättning reaktioner utfördes med [(bio) UMP] mRNA där starten kodon av tnaC genen ersattes av ett stopp kodon. Den slutliga produkterna isoleras med hjälp av streptavidin pärlor, vilket framgår i figur 1. Reaktionsprodukter och isolerade molekyler har sedan analyserats med elektrofores på polyakrylamidgeler. Den tnaC-tRNA och tnaC peptid band är markerade. B) Total RNA var isolerad från de strandade komplex med fenol extraktion. Varje isolerade RNA löstes genom elektrofores i agarosgeler. Ribosomala RNA (rRNAs) anges. C) Isolerade komplex som innehåller tnaC-tRNAs inkuberades med (+) eller utan (-) 0,02 mm puromycin (Puro) vid rumstemperatur i 10 min. Den tnaC peptid har märkts under översättning med [35S]-metionin (A) eller [3H]-prolin (B). <img src="/files/ftp_upload/2498/2498fig3.jpg" alt="Figur 3" /> Figur 3. Strukturella och funktionella analyser av ribosomer som innehåller tnaC-tRNA som är bundna till antibiotika sparsomycin eller aminosyran tryptofan. A) Isolerade komplex som innehåller tnaC-tRNAs inkuberades med (+) eller utan (-) sparsomycin (SPAR) eller tryptofan (TRP) i rumstemperatur i 5 minuter. Senare var de blandningar blandas med RF2 och inkuberas vid 37 ° C i 20 minuter. B) Analys av metylering förändringar i 23S rRNA induceras av molekyler bindande i ribosomen. Isolerade komplex var före inkuberas med (+) eller utan (-) 2 mM Trp eller Spar i 5 min vid 37 ° C. Då var en alkylering agent, dimetyl sulfat, lagt till och blandningarna inkuberas i rumstemperatur i ytterligare 20 min. Total RNA extraherades och primer förlängning analyser har utförts med en [32P]-märkt oligodeoxynucleotide komplement till nukleotider av 23S rRNA som är placerade 100 nukleotider nedströms från den modifierade nukleotid. Den slutliga produkter i förlängningen analyser löstes med elektrofores i polyakrylamidgeler. 23S rRNA nukleotider påverkas av förekomsten av Trp eller Spar anges.

<ol>
	<li>Cruz-Vera, L. R., Gong, M., Yanofsky, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+produced+by+bound+tryptophan+in+the+ribosome+peptidyl+transferase+center+in+response+to+tnaC,+a+nascent+leader+peptide.">Changes produced by bound tryptophan in the ribosome peptidyl transferase center in response to tnaC, a nascent leader peptide.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 103, 3598-3603 (2006).</li><li>Garza-Ramos, G., Xiong, L., Zhong, P., Mankin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+site+of+macrolide+antibiotics+on+the+ribosome:+new+resistance+mutation+identifies+a+specific+interaction+of+ketolides+with+rRNA.">Binding site of macrolide antibiotics on the ribosome: new resistance mutation identifies a specific interaction of ketolides with rRNA.</a> J. Bacteriol. 183, 6898-6907 (2001).</li><li>Gaynor, M., Mankin, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrolide+antibiotics:+binding+site,+mechanism+of+action,+resistance.">Macrolide antibiotics: binding site, mechanism of action, resistance.</a> Curr. Top. Med. Chem. 3, 949-961 (2003).</li><li>Polacek, N., Mankin, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ribosomal+peptidyl+transferase+center:+structure,+function,+evolution,+inhibition.">The ribosomal peptidyl transferase center: structure, function, evolution, inhibition.</a> Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 40, 285-311 (2005).</li><li>Steitz, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+insights+into+the+functions+of+the+large+ribosomal+subunit,+a+major+antibiotic+target.">Structural insights into the functions of the large ribosomal subunit, a major antibiotic target.</a> Keio J. Med. 57, 1-14 (2008).</li><li>Tenson, T., Mankin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibiotics+and+the+ribosome.">Antibiotics and the ribosome.</a> Mol. Microbiol. 59, 1664-1677 (2006).</li><li>Xiong, L., Korkhin, Y., Mankin, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+site+of+the+bridged+macrolides+in+the+Escherichia+coli+ribosome.">Binding site of the bridged macrolides in the Escherichia coli ribosome.</a> Antimicrob Agents Chemother. 49, 281-288 (2005).</li><li>Child, S. J., Miller, M. K., Geballe, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+control+by+an+upstream+open+reading+frame+in+the+HER-2/neu+transcript.">Translational control by an upstream open reading frame in the HER-2/neu transcript.</a> J. Biol. Chem. 274, 24335-24441 (1999).</li><li>Fang, P., Spevak, C. C., Wu, C., Sachs, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+nascent+polypeptide+domain+that+can+regulate+translation+elongation.">A nascent polypeptide domain that can regulate translation elongation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101, 4059-4064 (2004).</li><li>Janzen, D. M., Frolova, L., Geballe, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+translation+termination+mediated+by+an+interaction+of+eukaryotic+release+factor+1+with+a+nascent+peptidyl-tRNA.">Inhibition of translation termination mediated by an interaction of eukaryotic release factor 1 with a nascent peptidyl-tRNA.</a> Mol. Cell. Biol. 22, 8562-8570 (2002).</li><li>Nakatogawa, H., Ito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ribosomal+exit+tunnel+functions+as+a+discriminating+gate.">The ribosomal exit tunnel functions as a discriminating gate.</a> Cell. 108, 629-636 (2002).</li><li>Onouchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nascent+peptide-mediated+translation+elongation+arrest+coupled+with+mRNA+degradation+in+the+CGS1+gene+of+Arabidopsis.">Nascent peptide-mediated translation elongation arrest coupled with mRNA degradation in the CGS1 gene of Arabidopsis.</a> Genes Dev. 19, 1799-1810 (2005).</li><li>Raney, A., Law, G. L., Mize, G. J., Morris, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulated+translation+termination+at+the+upstream+open+reading+frame+in+s-adenosylmethionine+decarboxylase+mRNA.">Regulated translation termination at the upstream open reading frame in s-adenosylmethionine decarboxylase mRNA.</a> J. Biol. Chem. 277, 5988-5994 (2002).</li><li>Cruz-Vera, L. R., Rajagopal, S., Squires, C., Yanofsky, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Features+of+ribosome-peptidyl-tRNA+interactions+essential+for+tryptophan+induction+of+tna+operon+expression.">Features of ribosome-peptidyl-tRNA interactions essential for tryptophan induction of tna operon expression.</a> Mol. Cell. 19, 333-343 (2005).</li><li>Cruz-Vera, L. R., Yanofsky, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conserved+Residues+Asp16+and+Pro24+of+tnaC-tRNAPro+Participate+in+Tryptophan+Induction+of+tna+Operon+Expression.">Conserved Residues Asp16 and Pro24 of tnaC-tRNAPro Participate in Tryptophan Induction of tna Operon Expression.</a> J. Bacteriol. 190, 4791-4797 (2008).</li><li>Cruz-Vera, L. R., Yang, R., Yanofsky, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tryptophan+inhibits+Proteus+vulgaris+tnaC+leader+peptide+elongation,+activating+tna+operon+expression.">Tryptophan inhibits Proteus vulgaris tnaC leader peptide elongation, activating tna operon expression.</a> J Bacteriol. 191, 7001-7006 (2009).</li><li>Cruz-Vera, L. R., New, A., Squires, C., Yanofsky, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosomal+features+essential+for+tna+operon+induction:+tryptophan+binding+at+the+peptidyl+transferase+center.">Ribosomal features essential for tna operon induction: tryptophan binding at the peptidyl transferase center.</a> J. Bacteriol. 189, 3140-3146 (2007).</li><li>Shimizu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+translation+reconstituted+with+purified+components.">Cell-free translation reconstituted with purified components.</a> Nat. Biotechnol. 19, 751-755 (2001).</li><li>Kinoshita, Y., Nishigaki, K., Husimi, Y. F. l. u. o. r. e. s. c. e. n. c. e. -. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=isotope-+or+biotin-labeling+of+the+5+'-end+of+single-stranded+DNA/RNA+using+T4+RNA+ligase.">isotope- or biotin-labeling of the 5 '-end of single-stranded DNA/RNA using T4 RNA ligase.</a> Nucleic Acids Res. 25, 3747-3748 (1997).</li><li>Nishigaki, K., Taguchi, K., Kinoshita, Y., Aita, T., Husimi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Y-ligation:+an+efficient+method+for+ligating+single-stranded+DNAs+and+RNAs+with+T4+RNA+ligase.">Y-ligation: an efficient method for ligating single-stranded DNAs and RNAs with T4 RNA ligase.</a> Mol Divers. 4, 187-190 (1998).</li></ol>

Denna isolering förfarande som beskrivs i denna rapport är mycket reproducerbar. Tyvärr kan närvaron av korta peptidyl-tRNAs produceras från det översatta samma sekvenser inte vara lätt undvikas, såsom peptidyl-tRNAs kan motsvara 15-20% av den totala isolerade material (figur 2C). Dessa föroreningar kan öka i koncentration när högre koncentrationer av biotin-märkt mRNA har använts eller när cellfria används extrakt är gamla eller har återanvändas flera gånger. Därför är det mycket viktigt att kontrollera kvaliteten och koncentration av komponenterna i in vitro översättning reaktioner. Alternativt, beredda kommersiella högeffektiva cellfria extrakt finns tillgängliga som kan användas för samma ändamål (PURE-systemet) 18. Med denna metod är biotin-16-UMP slumpmässigt införlivas längs målet mRNA. Det finns en möjlighet att vissa ORFS innehåller uridin kontrakt kan ha fört in denna modifierad nukleotid i sekvenser, vilket påverkar deras översättning. Variabel relativa koncentrationer av biotin-16-UTP/UTP måste testas under syntesen av mRNA för att få den mest effektiva översättning. Alternativa metoder för biotin märkning kan användas, med inriktning på 5&#39;-änden, den mest stabila slutet av mRNA. (I) Biotin kan fästas i 5&#39;-änden av mRNA med hjälp av 3&#39;-NH2ATP (3&#39;-amino, 3&#39;-deoxyadenosintrifosfat) och T4 RNA ligas 19. (Ii) 5&#39;-änden biotin-märkt oligonukleotid kan fästas i 5&#39;-änden av mRNA med hjälp av T4-RNA-ligas samt 20. (Iii) 3&#39;-änden biotin-märkt oligodeoxynucleotides som motsvarar de komplementära sekvensen vid 5&#39;-änden av mRNA skulle också kunna användas för att isolera översätta komplex. Dessa biotin märkt oligodeoxynucleotides kunde knytas till SMB före isolering. Senare SMB knutna till biotin-märkt oligodeoxynucleotides kunde blandas med översättningen reaktionsblandningen att möjliggöra samverkan med sina kompletterande mRNA-sekvenser. Efter isolering hybriden RNA-DNA-regionen - och regionen hybridisering mellan biotin-märkt oligodeoxynucleotide och mRNA sekvens - skulle brytas ned med hjälp av RNAse H, som skiljer den avstannade komplex från streptavidin pärlor. Denna alternativa metod kan tillåta komplex som ska användas i framtida strukturella analyser med högre upplösning metoder.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Tris base</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>252859</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Magnesium acetate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fluka</td>
<td>63049</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Potassium glutamate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>G1501</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ammonium acetate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fluka</td>
<td>09688</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PMSF</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P7626</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Protein A sepharose 4B slurry beads</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P9424</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Leupeptin inhibitor</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>L9783</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Taq-DNA polymerase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Stratagene</td>
<td>201223</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>T7 Maxiprep kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Promega</td>
<td>P1300</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>SMB</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Promega</td>
<td>Z5482</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Biotin-16-UTP</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche</td>
<td>1388908</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>ATP</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>A7699</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>GTP</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>G8877</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PEP</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P7002</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PK</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P7768</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Polyethylenglycol 8000</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fluka</td>
<td>81268</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Folinic acid</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fluka</td>
<td>47612</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Spermidine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fluka</td>
<td>85558</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>tRNA from E. coli</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>R1753</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DEPC</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>D5758</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tricine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>T5816</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L-amino acids</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>LAA21</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DTT</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fluka</td>
<td>43815</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>magnetic separation stands</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Promega</td>
<td>Z5342</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

isolation of translating ribosomes containing peptidyl-trnas for functional and structural analyses

Nyligen har strukturella och biokemiska studier detaljerade många av de molekylära händelser som inträffar i ribosomen under hämning av proteinsyntesen genom antibiotika och under begynnande polypeptid syntes. Några av dessa antibiotika, och reglerande vardande polypeptider oftast i form av peptidyl-tRNAs, hämmar antingen peptidbindningen bildning eller översättning uppsägning 1-7. Dessa hämmande händelser kan stoppa rörelsen av ribosomen, kallas ett fenomen &quot;translationell gripande&quot;. Översättning gripandet orsakas av antingen ett antibiotikum eller en begynnande polypeptid har visat att reglera uttrycket av gener involverade i olika cellulära funktioner som celltillväxt, antibiotikaresistens, protein translokation och cellernas ämnesomsättning 8-13. Kunskap om hur antibiotika och reglerande begynnande polypeptider ändra ribosomen funktionen är nödvändigt om vi ska förstå den fullständiga roll ribosomen i översättning, i varje organism. Här beskriver vi en enkel metod som kan användas för att rena, exklusivt för analys, som ribosomer översätta ett specifikt mRNA och som innehåller en specifik peptidyl-tRNA 14. Detta förfarande bygger på selektiv isolering av översätta ribosomer bundna till en biotin-märkt mRNA. Dessa translationell komplex separeras från andra ribosomer i samma blandning, med streptavidin paramagnetiska pärlor (SMB) och ett magnetiskt fält (MF). Biotin-märkt mRNA syntetiseras genom avrinning transkription analyser använder som mallar PCR-genererade DNA-fragment som innehåller T7 transkriptionell initiativtagare. T7 RNA-polymeras innehåller biotin-16-UMP från biotin-UTP, under våra förhållanden ungefär tio biotin-16-UMP molekyler ingår i ett 600 NT-mRNA med 25% UMP innehåll. Dessa biotin-märkt mRNA sedan isoleras och används i in vitro översättning analyser utförs med befriande omständighet 2 (RF2)-utfiskade cellfria extrakt från Escherichia coli-stammar som innehåller vild typ eller mutant ribosomer. Ribosomer översätta biotin-märkt mRNA sekvenser stannade vid hållplatsen kodon regionen, på grund av frånvaron av RF2 protein, som normalt utför översättning uppsägning. Stannade ribosomer som innehåller den nyligen syntetiserade peptidyl-tRNA är isolerade och bort från översättningen reaktioner med hjälp av SMB och en MF. Dessa pärlor binder bara biotin innehåller meddelanden. De isolerade, translationell komplex, kan användas för att analysera de strukturella och funktionella egenskaper hos vildtyp eller mutant ribosomala komponenter eller peptidyl-tRNA sekvenser, samt bestämma ribosomen interaktion med antibiotika eller andra molekylära faktorer 1,14-16. För att undersöka funktionen hos dessa isolerade ribosomen komplex kan peptidyl-transferas analyser göras i närvaro av antibiotika puromycin 1. Att studera strukturella förändringar inom den överbryggande komplex, kan väl inarbetade rutiner användas, till exempel i) crosslinking till specifika aminosyror 14 och / eller ii) alkylering analyser skydd 1,14,17.

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Translating Ribosomes Containing Peptidyl-tRNAs for Functional and Structural Analyses at JoVE.com

Isolation of Translating Ribosomes Containing Peptidyl-tRNAs for Functional and Structural Analyses

Ett stort hinder för biokemiska analyser av ribosomer som innehåller begynnande peptidyl-tRNAs har närvaron av andra ribosomer i samma prov, ribosomer inte inblandad i översättningen av specifika mRNA sekvens som analyseras. Vi utvecklade en enkel metod att rena, exklusivt, ribosomerna som innehåller den begynnande peptidyl-tRNA av intresse.

Isolering av Översätta Ribosomer Med peptidyl-tRNAs för funktionella och strukturella analyser

Recently, structural and biochemical studies have detailed many of the molecular events that occur in the ribosome during inhibition of protein synthesis ...

Research

JoVE Journal

Biology

Crystallizing Membrane Proteins for Structure Determination using Lipidic Mesophases

Kristalliserande Membrane proteiner för strukturbestämning med Lipidic Mesophases

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the ...

Evisceration of Mouse Vitreous and Retina for Proteomic Analyses

Urtagning av Mouse glaskroppen och näthinnan för proteomik analyser

While the mouse retina has emerged as an important genetic model for inherited retinal disease, the mouse vitreous remains to be explored. The vitreous is ...

Isolation and Characterization of RNA-Containing Exosomes

Isolering och karakterisering av RNA-Innehållande Exosomes

The field of exosome research is rapidly expanding, with a dramatic increase in publications in recent years. These small vesicles (30-100 nm) of ...

Chromatographic Purification of Highly Active Yeast Ribosomes

Kromatografiska Rening av högaktiv Jäst Ribosomer

Eukaryotic ribosomes are much more labile as compared to their eubacterial and archael counterparts, thus posing a significant challenge to researchers.  ...

Use of a Robot for High-throughput Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Användning av en robot för hög kapacitet Kristallisering av membranproteiner i lipidisk mesofaser

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through ...

Harvesting and Cryo-cooling Crystals of Membrane Proteins Grown in Lipidic Mesophases for Structure Determination by Macromolecular Crystallography

Avverkning och Cryo-kylning Kristaller av membranproteiner som odlas i lipida mesofaser för strukturbestämning genom Makromolekylär kristallografi

An important route to understanding how proteins function at a mechanistic level is to have the structure of the target protein available, ideally at ...

Isolation, Culture, and Functional Characterization of Adult Mouse Cardiomyoctyes

Isolering, kultur, och funktionell karakterisering av vuxen mus Cardiomyoctyes

The use of primary cardiomyocytes (CMs) in culture has provided a powerful complement to murine models of heart disease in advancing our understanding of ...

Reconstitution of a Kv Channel into Lipid Membranes for Structural and Functional Studies

Beredning av ett Kv Channel i lipidmembraner för strukturella och funktionella studier

To study the lipid-protein interaction in a reductionistic fashion, it is necessary to incorporate the membrane proteins into membranes of well-defined ...

Isolation and Functional Analysis of Mitochondria from Cultured Cells and Mouse Tissue

Isolering och Funktionell analys av mitokondrier från odlade celler och mus Tissue

Comparison between two or more distinct groups, such as healthy vs. disease, is necessary to determine cellular status. Mitochondria are at the nexus of ...

Methods for the Isolation, Culture, and Functional Characterization of Sinoatrial Node Myocytes from Adult Mice

Metoder för isolering, kultur, och funktionell karakterisering av sinusknutan Myocyter från vuxna möss

Sinoatrial node myocytes (SAMs) act as the natural pacemakers of the heart, initiating each heart beat by generating spontaneous action potentials (APs). ...