Name: crystallization of membrane proteins in lipidic mesophases
Uploaded: 2011-03-28T12:00:00
Duration: 11 min 53 s
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	<li>Caffrey, M., Cherezov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallizing+membrane+proteins+using+lipidic+mesophases.">Crystallizing membrane proteins using lipidic mesophases.</a> Nat. Protoc. 4, 706-731 (2009).</li><li>Cherezov, V., Abola, E., Stevens, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+progress+in+the+structure+determination+of+GPCRs,+a+membrane+protein+family+with+high+potential+as+pharmaceutical+targets.">Recent progress in the structure determination of GPCRs, a membrane protein family with high potential as pharmaceutical targets.</a> Methods Mol. Biol. 654, 141-170 (2010).</li><li>Cherezov, V., Liu, J., Hanson, M. A., Griffith, M. T., Stevens, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LCP-FRAP+assay+for+pre-screening+membrane+proteins+for+in+meso+crystallization.">LCP-FRAP assay for pre-screening membrane proteins for in meso crystallization.</a> J. Cryst. Growth Design. 8, 4307-4315 (2008).</li><li>Misquitta, Y., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detergents+destabilize+the+cubic+phase+of+monoolein:+implications+for+membrane+protein+crystallization.">Detergents destabilize the cubic phase of monoolein: implications for membrane protein crystallization.</a> Biophys. J. 79, 394-405 (2003).</li><li>Soumpasis, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Theoretical+analysis+of+fluorescence+photobleaching+recovery+experiments.">Theoretical analysis of fluorescence photobleaching recovery experiments.</a> Biophys. J. 41, 95-97 (1983).</li><li>Cherezov, V., Hanson, M. A., Griffith, M. T., Hilgart, M. C., Sanishvili, R., Nagarajan, V., Stepanov, S., Fischetti, R. F., Kuhn, P., Stevens, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rastering+strategy+for+screening+and+centering+of+microcrystal+samples+of+human+membrane+proteins+with+a+sub-10+micrometer+size+X-ray+synchrotron+beam.">Rastering strategy for screening and centering of microcrystal samples of human membrane proteins with a sub-10 micrometer size X-ray synchrotron beam.</a> J. R. Soc. Interface. 6, S587-S597 (2009).</li><li>Cherezov, V., Rosenbaum, D. M., Hanson, M. A., Rasmussen, S. G., Thian, F. S., Kobilka, T. S., Choi, H. J., Kuhn, P., Weis, W. I., Kobilka, B. K., Stevens, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+crystal+structure+of+an+engineered+human+beta2-adrenergic+G+protein-coupled+receptor.">High-resolution crystal structure of an engineered human beta2-adrenergic G protein-coupled receptor.</a> Science. 318, 1258-1265 (2007).</li><li>Cherezov, V., Peddi, A., Muthusubramaniam, L., Zheng, Y. F., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robotic+system+for+crystallizing+membrane+and+soluble+proteins+in+lipidic+mesophases.">A robotic system for crystallizing membrane and soluble proteins in lipidic mesophases.</a> Acta Crystallogr. D. 60, 1795-1807 (2004).</li><li>Kissick, D. J., Gualtieri, E. J., Simpson, G. J., Cherezov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonlinear+optical+imaging+of+integral+membrane+protein+crystals+in+lipidic+mesophases.">Nonlinear optical imaging of integral membrane protein crystals in lipidic mesophases.</a> Anal. Chem. 82, 491-497 (2010).</li><li>Cheng, A., Hummel, B., Qiu, H., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+mechanical+mixer+for+small+viscous+lipid-containing+samples.">A simple mechanical mixer for small viscous lipid-containing samples.</a> Chem. Phys. Lipids. 95, 11-21 (1998).</li><li>Cherezov, V., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+and+inexpensive+nanoliter-volume+dispenser+for+highly+viscous+materials+used+in+membrane+protein+crystallization.">A simple and inexpensive nanoliter-volume dispenser for highly viscous materials used in membrane protein crystallization.</a> J. Appl. Cryst. 38, 398-400 (2005).</li><li>Cherezov, V., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nano-volume+plates+with+excellent+optical+properties+for+fast,+inexpensive+crystallization+screening+of+membrane+proteins.">Nano-volume plates with excellent optical properties for fast, inexpensive crystallization screening of membrane proteins.</a> J. Appl. Cryst. 36, 1372-1377 (2003).</li><li>Cherezov, V., Fersi, H., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallization+screens:+compatibility+with+the+lipidic+cubic+phase+for+in+meso+crystallization+of+membrane+proteins.">Crystallization screens: compatibility with the lipidic cubic phase for in meso crystallization of membrane proteins.</a> Biophys J. 81, 225-242 (2001).</li></ol>

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

प्रोटोकॉल मुख्य meso crystallization प्रयोगों में प्रदर्शन में शामिल चरणों के लिए एक बुनियादी दृश्य मार्गदर्शन प्रदान करते हैं . में गहराई इन प्रोटोकॉल से संबंधित जानकारी, संभावित नुकसान पर बल, कमियों या वैकल्पिक मार्गों 1,2 कहीं उपलब्ध हैं. वैकल्पिक LCP FRAP assays के पहले चरण में मदद करने के लिए सबसे होनहार प्रोटीन का निर्माण, LCP मेजबान लिपिड और लिपिड additives, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से संभव precipitants और बफर शर्तों 3 की सीमा की सीमा का चयन कर सकते हैं. एक बार एक प्रारंभिक crystallization हिट पाया जाता है, यह करने के लिए बेहतर गुणवत्ता क्रिस्टल प्राप्त करने के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए. Meso crystallization स्थितियों में अनुकूलन अनिवार्य रूप से अतिरिक्त पैरामीटर 1 LCP की संरचना के साथ जुड़े के अलावा के साथ घुलनशील प्रोटीन के लिए शर्तों का अनुकूलन करने के लिए समान है. झिल्ली प्रोटीन lipídic mesophase में बड़े क्रिस्टल आम तौर पर कर रहे हैं क्रिस्टल डिटर्जेंट समाधान में प्राप्त की तुलना में आकार में छोटी है, लेकिन अधिक का आदेश दिया है, इस प्रकार microfocus का उपयोग करने से दृढ़ता से benefitting आधुनिक सिंक्रोटॉन 6 स्रोतों पर उपलब्ध beamlines. Meso स्थापना crystallization या परख प्लेटें, LCP FRAP assays के आयोजन और क्रिस्टल का पता लगाने सहित crystallization, में करने के लिए संबंधित प्रक्रियाओं के कई अर्ध या पूरी तरह से 1,2,8,9 स्वचालित किया गया है, की अनुमति स्थितियों की एक बड़ी रेंज की स्क्रीनिंग जबकि प्रोटीन और लिपिड की खपत छोटी मात्रा. दूसरी ओर, LCP और क्रिस्टल कटाई में प्रोटीन reconstitutions मैनुअल और अधिक थकाऊ संचालन रहते हैं और इस प्रकार, सुधार के लिए एक की जरूरत है.

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>100 &mu;L gas-tight syringe</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hamilton</td>
<td>7656-01</td>
<td>2 syringes are required</td>
</tr>
<tr>
<td>10 &mu;L gas-tight syringe</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hamilton</td>
<td>7653-01</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Syringe coupler</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hamilton</td>
<td>7770-02 30902</td>
<td>The coupler can be made using available parts as described in refs. 10</td>
</tr>
<tr>
<td>Repetitive syringe dispenser</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hamilton</td>
<td>83700</td>
<td>The repetitive syringe dispenser can be modified to reduce dispensing volume by ~3 times11</td>
</tr>
<tr>
<td>Short (0.375&#x201D;) flat-tipped removable needle (point style 3, gauge 26)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hamilton</td>
<td>7804-03</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>96-well glass sandwich plate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Marienfeld</td>
<td>08 900 03</td>
<td>For manual operations it is more convenient to assemble the glass sandwich plate using a standard microscope glass slides and a double sticky tape with punched holes1,2,12.</td>
</tr>
<tr>
<td>Glass cover slip</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Electron Microscopy Sciences</td>
<td>63787-01</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>monoolein</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>M7765</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Crystallization screens</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hampton Research, Molecular Dimensions, Emerald Biosystems, Jena Bioscience</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Most of available commercial screens can be used for initial screening. Conditions that consistently disrupt LCP can be diluted 2x for better compatibility13.</td>
</tr>
<tr>
<td>Capillary cutting stone</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hampton Research</td>
<td>HR4-334</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fine point tweezers</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ted Pella</td>
<td>510</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Angled sharp probe</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ted Pella</td>
<td>13650</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MicroMounts</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MiTeGen</td>
<td>M1-Lxx-xx</td>
<td>Select MicroMount diameter to match the crystal size</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

crystallization of membrane proteins in lipidic mesophases

झिल्ली प्रोटीन रहने वाले पारगमन परिवहन और ऊर्जा परिवर्तनों, और, जैसे, malfunctions और रोगों के एक भीड़ में फंसा रहे हैं संकेत करने के लिए संबंधित कोशिकाओं में महत्वपूर्ण कार्य है. हालांकि, कि उनके घुलनशील भागीदारों के पीछे झिल्ली प्रोटीन के संरचनात्मक और कार्यात्मक समझ जोरदार ठंड है, मुख्य रूप से उनके और विवर्तन गुणवत्ता क्रिस्टल के solubilization पीढ़ी के साथ जुड़े कठिनाइयों के कारण,. Lipídic mesophases में Crystallization (meso या LCP crystallization के रूप में भी जाना जाता है) एक आशाजनक तकनीक है जो सफलतापूर्वक माइक्रोबियल rhodopsins, संश्लेषक प्रोटीन, बाहरी झिल्ली बीटा बैरल और जी प्रोटीन रिसेप्टर्स मिलकर की उच्च संकल्प संरचनाओं प्राप्त लागू किया गया है . Meso में crystallization एक झिल्ली देशी जैसे वातावरण का लाभ लेता है और आम तौर पर कम विलायक सामग्री और बेहतर आदेश के रूप में डिटर्जेंट के समाधान से पारंपरिक crystallization की तुलना के साथ क्रिस्टल का उत्पादन. विधि मुश्किल नहीं है, लेकिन लिपिड चरण और चिपचिपा mesophase सामग्री से निपटने में व्यवहार अभ्यास के एक समझने की आवश्यकता है है. यहाँ हम LCP बनाने और LCP के लिपिड bilayer एक सिरिंज मिक्सर, एक परख या crystallization थाली में LCP के nanoliter भाग वितरण, पूर्व crystallization assays के आयोजन से क्रिस्टल कटाई द्वारा पीछा का उपयोग में एक झिल्ली प्रोटीन का पुनर्गठन करने का एक सरल और कारगर तरीका का प्रदर्शन LCP मैट्रिक्स. ये प्रोटोकॉल meso crystallization परीक्षण में आ करने के लिए एक बुनियादी मार्गदर्शन प्रदान, लेकिन, किसी भी crystallization प्रयोग, व्यापक प्रदर्शन और अनुकूलन के साथ रूप में आवश्यक हैं, और एक सफल परिणाम के लिए जरूरी गारंटी नहीं है.

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Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

प्रोटोकॉल विवर्तन एक झिल्ली एक lipídic घन चरण (LCP) में प्रोटीन का पुनर्गठन से शुरू प्रोटीन की गुणवत्ता क्रिस्टल प्राप्त करने के लिए आवश्यक कदम का वर्णन है, LCP - FRAP पूर्व crystallization assays के साथ प्रारंभिक स्थितियों खोजने LCP crystallization परीक्षण और क्रिस्टल कटाई की स्थापना .

झिल्ली प्रोटीन के lipídic Mesophases में Crystallization

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are ...

Research

JoVE Journal

Biology

Crystallizing Membrane Proteins for Structure Determination using Lipidic Mesophases

संरचना lipídic Mesophases का उपयोग कर निर्धारण के लिए झिल्ली प्रोटीन crystallizing

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the ...

Assessing Two-dimensional Crystallization Trials of Small Membrane Proteins for Structural Biology Studies by Electron Crystallography

स्ट्रक्चरल बायोलॉजी के अध्ययन के लिए इलेक्ट्रॉन क्रि द्वारा लघु झिल्ली प्रोटीन के दो आयामी Crystallization परीक्षण मूल्यांकन

Electron crystallography has evolved as a method that can be used either alternatively or in combination with three-dimensional crystallization and X-ray ...

Examining the Conformational Dynamics of Membrane Proteins in situ with Site-directed Fluorescence Labeling

Examining the Conformational Dynamics of Membrane Proteins in situ with Site-directed Fluorescence Labeling

झिल्ली प्रोटीन के गठनात्मक गतिशीलता की जांच बगल में साइट - निर्देश प्रतिदीप्ति लेबल के साथ

Two electrode voltage clamp electrophysiology (TEVC) is a powerful tool to investigate the mechanism of ion transport1 for a wide variety of membrane ...

High-throughput Crystallization of Membrane Proteins Using the Lipidic Bicelle Method

Lipídic Bicelle विधि का प्रयोग झिल्ली प्रोटीन की उच्च throughput Crystallization

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane ...

Use of a Robot for High-throughput Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Lipidic Mesophases में उच्च throughput झिल्ली प्रोटीन का Crystallization के लिए एक रोबोट का प्रयोग

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through ...

Harvesting and Cryo-cooling Crystals of Membrane Proteins Grown in Lipidic Mesophases for Structure Determination by Macromolecular Crystallography

झिल्ली macromolecular क्रिस्टलोग्राफी द्वारा संरचना निर्धारण के लिए lipidic Mesophases में बढ़ी प्रोटीन की कटाई और क्रायो ठंडा कण

An important route to understanding how proteins function at a mechanistic level is to have the structure of the target protein available, ideally at ...

Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त करते रहते चूहों में इमेजिंग subcellular संरचनाओं के लिए intravital माइक्रोस्कोपी

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...

Immunodetection of Outer Membrane Proteins by Flow Cytometry of Isolated Mitochondria

पृथक माइटोकॉन्ड्रिया के फ्लो द्वारा बाहरी झिल्ली प्रोटीन की Immunodetection

Methods to detect and monitor mitochondrial outer membrane protein components in animal tissues are vital to study mitochondrial physiology and ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

झिल्ली प्रोटीन की हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन आधारित अभिव्यक्ति स्क्रीनिंग में<em&gt; Escherichia कोलाई</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

Microperfusion Technique to Investigate Regulation of Microvessel Permeability in Rat Mesentery

Microperfusion तकनीक चूहा अन्त्रपेशी में microvessel पारगम्यता के नियमन जांच

Experiments to measure the permeability properties of individually perfused microvessels provide a bridge between investigation of molecular and cellular ...