Name: bioenergetic profile experiment using c2c12 myoblast cells
Uploaded: 2010-12-06T16:50:00
Duration: 7 min 20 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Bioenergetic Profile Experiment using C2C12 Myoblast Cells at JoVE.com

В этом эксперименте C2C12 клетках миобластов высевают при заданной плотности в Морской конек пластин культуре клеток. Базального потребления кислорода (OCR) и внеклеточной подкисления (ECAR) ставки намерены установить базовые ставки. 1. Клетки инъекций Клетки метаболически возмущенного три дополнения различных соединений (подряд), что сдвиг биоэнергетический профиль клеток. Одна группа будет служить контролем, работает медиа добавлены как контроль &quot;соединения&quot;. <ol><li> Первая инъекция является олигомицину. Олигомицин ингибирует синтез АТФ путем блокирования протонного канала часть F о АТФ-синтаза (комплекс V). В митохондриальной исследования, она используется для предотвращения состояния 3 (фосфорилирования) дыхания. С клетки, он может быть использован для отличать процент потребления О2 посвящена синтез АТФ, а доля потребления О2, необходимых для преодоления природных утечки протонов через внутреннюю мембрану митохондрий. </li><li> Вторая инъекция FCCP. FCCP (Карбонильные цианид-р-trifluoromethoxyphenylhydrazone) является ионофором то есть оператор мобильной связи иона. Это разобщение агента, поскольку он нарушает синтез АТФ за счет транспортировки ионов водорода через мембрану митохондрий, а не протона канал АТФ-синтазы (комплекс V). Это крах митохондриального потенциала мембраны приводит к быстрому потреблению энергии и кислорода без поколение АТФ. В этом случае, как OCR и ECAR будет увеличиваться, OCR-за разобщение, а ECAR как клетки попытке сохранить их энергетический баланс с помощью гликолиза для генерации АТФ. FCCP лечения может быть использована для расчета &quot;запасных&quot; дыхательные способности клеток, который определен как количественная разница между максимальным и неконтролируемое OCR начальной базальной OCR. Было высказано предположение, что сохранение некоторых запасных дыхательных мощностей даже в условиях максимальных физиологических или патофизиологических стимул является основным фактором, определяющим жизнеспособность и / или выживание клеток. Способность клеток реагировать на стресс в условиях повышенного спроса на энергию в большей части зависит от биоэнергетического потенциала митохондрий. Это биоэнергетический потенциал определяется несколькими факторами, включая способность ячейки для доставки субстрата митохондрий и функциональной способности ферментов, участвующих в электронном транспорте </li><li> В третьей инъекции, ротенон, комплекс ингибитор I, добавляется в клетки. Это позволит закрыть митохондриального дыхания и позволит обеим митохондриальной и не митохондриальной фракции способствуют дыханию, чтобы быть рассчитаны. Будет наблюдаться снижение OCR в связи с нарушением функции митохондрий, с сопутствующим увеличением ECAR как клетка переходит на более гликолитических государства в целях поддержания энергетического баланса Ротенон является митохондриальная ингибитор, который предотвращает переход электронов из Fe-S центр в комплексе, чтобы я убихинон (коэнзим Q). Это торможение Комплекс I препятствует потенциальной энергии в NADH от того, преобразуется в полезную энергию в виде АТФ. </li></ol> 2. Реагенты и материалы <ol><li> Олигомицин, FCCP, и Ротенон Solutions (Морской конек Mito Stress Test Kit) </li><li> DMEM Запуск Media (Морской конек # 100965-000) </li><li> ДМСО (Sigma D8418) </li><li> Дистиллированная вода (Gibco 15230-170) </li><li> Калибровка буфер (Морской конек Bioscience) </li></ol> 3. Рост среднего <ol><li> 500 мл DMEM (Gibco 11965-092) </li><li> 10% FBS (Hyclone SH90070.03) </li><li> 5 мл Пенн / Strep (Gibco 15140-122) </li><li> 5 мл пирувата натрия (Sigma S8636) </li><li> 5 мл Glutamax (Gibco 35050-061) </li></ol> 4. Посев протокола <ol><li> Клетки высевают в XF96 клеточных культур пластин с 10 000 клеток / лунку в 100 мкл питательной среды и помещен в 37 ° С инкубатор с 10% CO 2. </li><li> Клетки будут придерживаться XF96 пластины культуре клеток в течение 1 часа. </li><li> Анализ клеток в XF96 24 часов после посева. </li></ol> 5. Подготовка Пробирной шаблона <ol><li> Использование пробирного мастера (Приложение I), создавать шаблон следующее расположение группы: <img src="/files/ftp_upload/2511/2511fig1.jpg" alt="Рисунок 1" /> Рисунок 1. Ну макет сетки определения столбца и групповых заданий </li></ol> 6. Подготовка соединений <ol><li> Подготовьте следующие соединения в XF DMEM Пробирной СМИ следующим образом: 10 мкМ Олигомицин, 30,0 мкМ FCCP, 20,0 мкМ ротенон, Эти концентрации представляют 10X разведение, которые будут сделаны, когда соединения вводятся в колодец. Рабочая концентрация: 1 мкМ Олигомицин, 3,0 мкМ FCCP, 2,0 мкМ Ротенон </li></ol> 7. Медиа Изменение и клеточной подготовка <oл&gt; <li> Место ячейки пластины на XF Подготовка станции </li><li> Установить окончательный объем среды до 160 мкл на лунку. </li><li> Инкубируйте в 37 ° C инкубатор без CO 2 в течение 60 минут, чтобы клетки предварительно уравновешиваются с анализа среды. </li></ol> 8. Загрузка датчика картриджа <ol><li> Теплый соединений до 37 ° C до загрузки датчика картриджа и нагрузки соединений в портах инжектора следующим образом: <ol><li> Столбцы 1-4: 16 Нагрузка, 18 и 20 мкл XF Анализ средств массовой информации (DMEM) в порты A, B и C, соответственно. </li><li> Столбцы 5-12: Нагрузка 16 мкл Олигомицин в порты Нагрузка 18 мкл FCCP в порты B Нагрузка 20 мкл Ротенон в порты C </li></ol></li></ol> 9. Протокол команд <table border="1"><tbody><tr><td> Команда </td><td> Время (мин) </td><td> Порт </td></tr><tr><td> Калибровать </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Уравновешивать </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Loop Start </td><td> 3X </td><td></td></tr><tr><td> Смесь </td><td> 3 </td><td></td></tr><tr><td> Ждать </td><td> 2 </td><td></td></tr><tr><td> Мера </td><td> 3 </td><td></td></tr><tr><td> Loop End </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Вводить </td><td></td><td> </td></tr><tr><td> Loop Start </td><td> 2X </td><td></td></tr><tr><td> Смесь </td><td> 3 </td><td></td></tr><tr><td> Ждать </td><td> 2 </td><td></td></tr><tr><td> Мера </td><td> 3 </td><td></td></tr><tr><td> Вводить </td><td></td><td> B </td></tr><tr><td> Loop Start </td><td> 2X </td><td></td></tr><tr><td> Смесь </td><td> 3 </td><td></td></tr><tr><td> Ждать </td><td> 2 </td><td></td></tr><tr><td> Мера </td><td> 3 </td><td></td></tr><tr><td> Вводить </td><td></td><td> C </td></tr><tr><td> Loop Start </td><td> 2X </td><td></td></tr><tr><td> Смесь </td><td> 3 </td><td></td></tr><tr><td> Ждать </td><td> 2 </td><td></td></tr><tr><td> Мера </td><td> 3 </td><td></td></tr><tr><td> Конец </td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Таблица 1. Протокол команд

<ol>
	<li>Choi, W. S., Gerencser, A. A., Nicholls, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioenergetic+analysis+of+isolated+cerebrocortical+nerve+terminals+on+a+microgram+scale:+spare+respiratory+capacity+and+stochastic+mitochondrial+failure.">Bioenergetic analysis of isolated cerebrocortical nerve terminals on a microgram scale: spare respiratory capacity and stochastic mitochondrial failure.</a> J Neurochem. 109, 1179-1191 (2009).</li><li>Hill, B. G., Dranka, B. P., Zou, L., Chatham, J. C., Darley-Usmar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Importance+of+the+bioenergetic+reserve+capacity+in+response+to+cardiomyocyte+stress+induced+by+4-hydroxynonenal.">Importance of the bioenergetic reserve capacity in response to cardiomyocyte stress induced by 4-hydroxynonenal.</a> Biochem J. 424, 99-107 (2009).</li><li>Liu, J., Cao, L., Chen, J., Song, S., Lee, I. H., Quijano, C., Liu, H., Keyvanfar, K., Chen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bmi1+regulates+mitochondrial+function+and+the+DNA+damage+response+pathway.">Bmi1 regulates mitochondrial function and the DNA damage response pathway.</a> Nature. , 459-7245 (2009).</li><li>Malmgren, S., Nicholls, D. G., Taneera, J., Bacos, K., Koeck, T., Tamaddon, A., Wibom, R., Groop, L., Ling, C., Mulder, H., Sharoyko, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tight+coupling+between+glucose+and+mitochondrial+metabolism+in+clonal+beta-cells+is+required+for+robust+insulin+secretion.">Tight coupling between glucose and mitochondrial metabolism in clonal beta-cells is required for robust insulin secretion.</a> J Biol Chem. 284, 32395-32404 (2009).</li><li>Dranka, B. P., Hill, B. G., Darley-Usmar, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+reserve+capacity+in+endothelial+cells:+The+impact+of+nitric+oxide+and+reactive+oxygen+species.">Mitochondrial reserve capacity in endothelial cells: The impact of nitric oxide and reactive oxygen species.</a> Free Radic Biol Med. 48, 905-914 (2010).</li><li>Perez, J., Hill, B. G., Benavides, G. A., Dranka, B. P., Darley-Usmar, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+cellular+bioenergetics+in+smooth+muscle+cell+proliferation+induced+by+platelet-derived+growth+factor.">Role of cellular bioenergetics in smooth muscle cell proliferation induced by platelet-derived growth factor.</a> Biochem J. 428, 255-267 (2010).</li><li>Mor&#225;n, M., Rivera, H., S&#225;nchez-Arag&#243;, M., Bl&#225;zquez, A., Merinero, B., Ugalde, C., Arenas, J., Cuezva, J. M., Mart&#237;n, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+bioenergetics+and+dynamics+interplay+in+complex+I-deficient+fibroblasts.">Mitochondrial bioenergetics and dynamics interplay in complex I-deficient fibroblasts.</a> Biochim Biophys Acta. , 1802-185 (2010).</li><li>C&#225;rdenas, C., Miller, R. A., Smith, I., Bui, T., Molg&#243;, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Essential+regulation+of+cell+bioenergetics+by+constitutive+InsP3+receptor+Ca2++transfer+to+mitochondria.">Essential regulation of cell bioenergetics by constitutive InsP3 receptor Ca2+ transfer to mitochondria.</a> Cell. , 142-142 (2010).</li></ol>

Мин Ву, Пер Бо Йенсен, Джордж Роджерс и Дэвид А. Ferrick являются сотрудниками Морской конек Bioscience, которая производит реагенты и приборы описаны в этой статье.

Этот анализ происходит от классического эксперимента для исследования митохондриальной функции и выступает в качестве основы, с которой для построения более сложных экспериментов, направленных на понимание различных изменений в клеточном метаболизме, функции митохондрий, и в целом биоэнергетики. Все соединения, используемые в этом эксперименте должен быть оптимизирован для концентрации, которая обеспечивает максимальный эффект. То есть, надо выполнять отдельные эксперименты титрования установить эти значения. Это особенно важно с FCCP, как кривой титрования, как правило, довольно резкий, и слишком много FCCP может реально уменьшить ответы в OCR. Типичные диапазоны (конечные концентрации), чтобы проверить будет выглядеть так: <ul><li> 0,1 - 1,0 мкг / мл Олигомицин </li><li> 0,1 - 5,0 мкМ FCCP </li><li> 0,1 - 1,0 мкМ Ротенон </li></ul> Обратите внимание, что ответы на каждое соединение выше (особенно FCCP) будет зависеть от состава анализа СМИ (базовый тип, [глюкоза], [пируват], наличие / отсутствие BSA и т.д.). Далее, если анализ XF СМИ состава меняется, оптимизации необходимо будет повторно выполнена. Наличие и концентрацию пирувата особенно важно в получении максимальной мощности дыхательной из-за FCCP. Морской конек Bioscience уже наблюдается в ряде клеток линий, что отсутствие пируват отменяет способность клеток реагировать максимально (выше базовой), чтобы FCCP. Как правило, концентрации 1-10 мМ пирувата должны быть проверены, чтобы понять оптимальной концентрации пирувата для получения максимального дыхания. Заметим, что [пируват] И [глюкоза], возможно, должны быть «кросс-титровать», чтобы получить оптимальные условия среды для эксперимента. Типичные результаты этого эксперимента представлены ниже в график, показывающий OCR в зависимости от времени, а другой показывает ECAR в зависимости от времени: <img src="/files/ftp_upload/2511/2511fig2.jpg" alt="Рисунок 2" /> Рисунок 2. OCR по времени <img src="/files/ftp_upload/2511/2511fig3.jpg" alt="Рисунок 3" /> Рисунок 3. ECAR по времени Здесь мы наблюдали ожидать ответов в OCR и ECAR как клетки обрабатывают с каждым последующим соединением. Для олигомицину, OCR уменьшается в результате блокирующий синтез АТФ на митохондриальной комплекс V. Так как клетки не способны синтезировать АТФ через OXPHOS, они возвращаются к гликолиза, чтобы удовлетворить свои потребности в АТФ, таким образом, мы наблюдаем увеличение ECAR. Как было показано ранее, FCCP выступает в качестве агента расцепления. Поскольку клетки теперь должны преодолеть протонов утечки через внутреннюю мембрану митохондрий, OCR значительно возрастает по мере O2 потребляется для перекачки избыточных протонов назад через митохондриальную мембрану. Наконец, ротенон ингибирует митохондриальный комплекс я и комплекс III, соответственно, в результате чего поток электронов прекратить в электрон-транспортной цепи, и, следовательно, потребление О2 резко снижается. <img src="/files/ftp_upload/2511/2511fig4.jpg" alt="Рисунок 4" /> Рисунок 4. Дыхание параметры Помимо ожидаемых изменений в дыхании и ECAR, число дыхательных параметров могут быть получены из этих данных. Это суммированы на рисунке выше: Здесь мы видим, что мы можем получить информацию о базальной дыхание клеток, процент потребления О2 посвящена АТФ производства, а также количество посвященных поддержанию протонный градиент (из-за утечки Н +). Кроме того, мы можем получить максимальные частоты дыхания в условиях несвязанных дыхания (иногда их называют запасных дыхательной емкости) и, наконец, мы можем определить объем потребления О2 не из-за митохондриальных процессов. Быстро растущего числа исследований использования этого митохондриальной профиля для оценки сотовой биоэнергетика, выявление митохондриальной дисфункции и прогнозировать способность клеток реагировать на стресс и / или оскорбления. Более подробную информацию и подробную информацию об этом экспериментальный метод и идея запасных дыхательной емкости, см. ссылки на следующие публикации 1-8.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Oligomycin, FCCP, Rotenone and Antimycin A Solutions</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Seahorse Bioscience</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Seahorse Mito Stress Test Kit</td>
</tr>
<tr>
<td>DMEM Running Media</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Seahorse Bioscience</td>
<td>100965-000</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DMSO</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>D8418</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Distilled Water</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>15230-170</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Calibration buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Seahorse Bioscience</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

bioenergetic profile experiment using c2c12 myoblast cells

Возможность измерения клеточного метаболизма и понять митохондриальной дисфункцией, позволил ученым во всем мире для продвижения своих исследований в понимании роли функции митохондрий при ожирении, сахарном диабете, старения, рака, сердечно-сосудистой системы и безопасность токсичности. Клеточного метаболизма это процесс поглощения подложки, такие как кислород, глюкоза, жирные кислоты и глутамина, и последующее преобразование энергии с помощью ряда ферментативно контролируемого окисления и восстановления реакций. Эти внутриклеточные биохимические реакции в результате производства АТФ, выделение тепла и химических побочных продуктов, таких как лактат и CO 2 в внеклеточной среде. Ценную информацию о физиологическом состоянии клеток, и изменение состояния этих клеток, могут быть получены путем измерения скорости потребляемого кислорода клетками, показатель митохондриального дыхания - Скорость потребления кислорода - или OCR. Клетки также генерировать АТФ через гликолиз, т.е. превращения глюкозы в лактат, независимо от кислорода. В культурной скважин, лактат является основным источником протонов. Измерение молочная кислота производится косвенно через протоны попадают внеклеточной среды, окружающей клетки, что вызывает закисление среды обеспечивает внеклеточного Подкисление Оценить - или ECAR. В этом эксперименте C2C12 клетках миобластов высевают при заданной плотности в Морской конек пластин культуре клеток. Базального потребления кислорода (OCR) и внеклеточной подкисления (ECAR) ставки намерены установить базовые ставки. Затем клетки метаболически возмущенного три дополнения различных соединений (подряд), что сдвиг биоэнергетический профиль клеток. Этот анализ происходит от классического эксперимента для оценки митохондрии и выступает в качестве основы, с которой для построения более сложных экспериментов, направленных на понимание как физиологических и патофизиологических функций митохондрий и прогнозировать способность клеток реагировать на стресс и / или оскорбления.

Watch this Scientific Journal Video about Bioenergetic Profile Experiment using C2C12 Myoblast Cells at JoVE.com

Bioenergetic Profile Experiment using C2C12 Myoblast Cells

Описание метода для профилирования функции митохондрий в клетках предоставляется. Митохондриальной профиля порожденных предоставляет четыре параметра функции митохондрий, которые можно измерить в одном эксперименте: базальный уровень дыхания, АТФ-связанных дыхания, протон течь, и резервные мощности.

Биоэнергетический Эксперимент профиля использования C2C12 клетках миобластов

The ability to measure cellular metabolism and understand mitochondrial dysfunction, has enabled scientists worldwide to advance their research in ...

Research

JoVE Journal

Biology

Testing Nicotine Tolerance in Aphids Using an Artificial Diet Experiment

Тестирование Никотин толерантности в Тли Использование искусственного эксперимента диета

Plants may upregulate the production of many different seconday metabolites in response to insect feeding. One of these metabolites, nicotine, is well ...

Morris Water Maze Experiment

Моррис воды Лабиринт Эксперимент

The Morris water maze is widely used to study spatial memory and learning. Animals are placed in a pool of water that is colored opaque with powdered ...

Eukaryotic Polyribosome Profile Analysis

Эукариотические Polyribosome Анализ профиля

Protein synthesis is a complex cellular process that is regulated at many levels. For example, global translation can be inhibited at the initiation phase ...

Metabolic Profile Analysis of Zebrafish Embryos

Метаболический Анализ профиля эмбрионов данио рерио

A growing goal in the field of metabolism is to determine the impact of genetics on different aspects of mitochondrial function. Understanding these ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Индукционные и анализ эпителиальных к мезенхимальных перехода

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Preparation of Primary Myogenic Precursor Cell/Myoblast Cultures from Basal Vertebrate Lineages

Подготовка первичной Миогенный предшественников Cell / миобластов культур от базальной позвоночных линий

Due to the inherent difficulty and time involved with studying the myogenic program in vivo, primary culture systems derived from the resident adult stem ...

Real Time Analysis of Metabolic Profile in Ex Vivo Mouse Intestinal Crypt Organoid Cultures

Real Time Analysis of Metabolic Profile in Ex Vivo Mouse Intestinal Crypt Organoid Cultures

В режиме реального времени Анализ метаболического профиля в<em&gt; Экс Vivo</em&gt; Мышь Кишечная Crypt Органоид Культуры

The small intestinal mucosa exhibits a repetitive architecture organized into two fundamental structures: villi, projecting into the intestinal lumen and ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

Nephrotoxin Микроинъекция в данио рерио к модели острое повреждение почек

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...

Detection of Modified Forms of Cytosine Using Sensitive Immunohistochemistry

Обнаружение измененных форм цитозина с использованием чувствительных иммуногистохимии

Methylation of cytosine bases (5-methylcytosine, 5mC) occurring in vertebrate genomes is usually associated with transcriptional silencing. ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Графический пользовательский интерфейс для отслеживания концентрации белка в программном сопровождении в динамических клеточных выпячиваниях

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...