Name: live-imaging of pkc translocation in sf9 cells and in aplysia sensory neurons
Uploaded: 2011-04-06T11:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Live-imaging of PKC Translocation in Sf9 Cells and in Aplysia Sensory Neurons at JoVE.com

Ce travail a été soutenu par les Instituts de recherche en santé du Canada (IRSC) Subvention à Wayne S. Sossin. Carole A. Farah est le récipiendaire d&#39;une bourse postdoctorale du Fonds de la Recherche en Santé du Québec (FRSQ) et un Conrad Harrington bourse. Les auteurs tiennent à remercier Joanna Bougie, Margaret Hastings et Margaret Labban de l&#39;aide pour le tournage vidéo et Madeline Richmond Piscine pour aider à la présentation graphique.

1. Préparation et entretien des cultures monocouche cellulaire Sf9 <ol><li> Sf9 culture cellulaire et de la maintenance est effectuée sous une hotte de culture de tissus. </li><li> Les cellules Sf9 sont dérivées de cellules de Spodoptera frugiperda l&#39;ovaire (cellules Sf21) et peut être acheté comme cellules congelées dans les médias Grace chez Invitrogen. </li><li> Placer 8 ml de milieu d&#39;insectes de Grace, complétées (1X), à laquelle 30% de sérum bovin fœtal (FBS) a été ajoutée dans u...

<ol>
	<li>Farah, C. A., Nagakura, I., Weatherill, D., Fan, X. &. a. m. p. ;. a. m. p., Sossin, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+role+for+phosphatidic+acid+in+the+translocation+of+the+novel+protein+kinase+C+Apl+II+in+Aplysia+neurons.">Physiological role for phosphatidic acid in the translocation of the novel protein kinase C Apl II in Aplysia neurons.</a> Mol Cell Biol. 28, 4719-4733 (2008).</li><li>Zhao, Y., Leal, K., Abi-Farah, C., Martin, K. C., Sossin, W. S. &. a. m. p. ;. a. m. p., Klein, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M.Isoform+specificity+of+PKC+translocation+in+living+Aplysia+sensory+neurons+and+a+role+for+Ca2+-dependent+PKC+APL+I+in+the+induction+of+intermediate-term+facilitation.">M.Isoform specificity of PKC translocation in living Aplysia sensory neurons and a role for Ca2+-dependent PKC APL I in the induction of intermediate-term facilitation.</a> J Neurosci. 26, 8847-8856 (2006).</li><li>Farah, C. A., Weatherill, D., Dunn, T. W. &. a. m. p. ;. a. m. p., Sossin, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PKC+differentially+translocates+during+spaced+and+massed+training+in+Aplysia.">PKC differentially translocates during spaced and massed training in Aplysia.</a> J Neurosci. 29, 10281-10286 (2009).</li><li>Zhao, Y., Wang, D. O., Martin, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+Aplysia+sensory-motor+neuronal+cell+cultures.">Preparation of Aplysia sensory-motor neuronal cell cultures.</a> J Vis Exp. , (2009).</li><li>Manseau, F., Fan, X., Hueftlein, T., Sossin, W. S., Castellucci, V. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca2+-independent+PKC+Apl+II+mediates+the+serotonin+induced+facilitation+at+depressed+synapses+in+Aplysia.">Ca2+-independent PKC Apl II mediates the serotonin induced facilitation at depressed synapses in Aplysia.</a> J. Neuroscience. 21, 1247-1256 (2001).</li></ol>

Nous avons décrit une technique pour la translocation des PKC l&#39;image par fluorescence marqués en temps réel dans des cellules Sf9 et dans les neurones sensoriels aplysie. Les cellules Sf9 de fournir un système simple à l&#39;image de translocation de PKC, depuis la culture et de les transfecter est assez simple. En revanche, la micro-injection de neurones sensoriels aplysie prend un certain temps à maîtriser, jusqu&#39;à quelques mois. Difficultés liées à cette technique comprennent col...

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Sf9 frozen cells</td>
<td>Spodoptera frugiperda ovarian cells</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>B825-01</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Grace&#x2019;s Insect Medium, Supplemented (1X), liquid</td>
<td>Reagent</td>
<td>Gibco</td>
<td>11605-094</td>
<td>Use to culture Sf9 cells</td>
</tr>
<tr>
<td>Corning 75cm2 canted neck cell culture flask</td>
<td>Tool</td>
<td>Corning</td>
<td>430720</td>
<td>Use to culture Sf9 cells</td>
</tr>
<tr>
<td>Fetal Bovine Serum</td>
<td>Reagent</td>
<td>CanSera</td>
<td>CS-C08-500</td>
<td>Supplement Grace's media with FBS prior to use</td>
</tr>
<tr>
<td>Syringe</td>
<td>Tool</td>
<td>Becton Dickinson</td>
<td>309604</td>
<td>Use to filter Fast Green solution</td>
</tr>
<tr>
<td>Syringe</td>
<td>Tool</td>
<td>Becton Dickinson</td>
<td>309602</td>
<td>Use to filter plasmid DNA / Fast Green solution</td>
</tr>
<tr>
<td>Filter</td>
<td>Tool</td>
<td>Corning</td>
<td>431229</td>
<td>Use to filter Fast Green solution</td>
</tr>
<tr>
<td>Filter</td>
<td>Tool</td>
<td>Corning</td>
<td>431212</td>
<td>Use to filter plasmid DNA / Fast Green solution</td>
</tr>
<tr>
<td>Glass Bottom Dish</td>
<td>Tool</td>
<td>Mattek</td>
<td>P35G-1.5-14-C</td>
<td>Use to culture Sf9 cells prior to transfection and imaging</td>
</tr>
<tr>
<td>Cellfectin II Reagent</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>10362-100</td>
<td>Used to express fluorescently tagged PKCs in Sf9 cells</td>
</tr>
<tr>
<td>Fast Green FCF</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>F-7252</td>
<td>Use to visualize microinjection of plasmid DNA solution into Aplysia sensory neurons</td>
</tr>
<tr>
<td>Thin wall glass capillaries</td>
<td>Tool</td>
<td>World Precision Instruments</td>
<td>TW100F-4</td>
<td>Use to make microelectrodes for microinjection</td>
</tr>
<tr>
<td>Microloader pipette tip</td>
<td>Tool</td>
<td>Eppendorf</td>
<td>CA32950-050</td>
<td>Autoclave before using to fill up the microelectrodes for microinjection</td>
</tr>
<tr>
<td>PV820 Pneumatic PicoPump </td>
<td>Tool</td>
<td>World Precision Instruments</td>
<td>SYS-PV820</td>
<td>Part of microinjection station</td>
</tr>
<tr>
<td>Microelectrode holder</td>
<td>Tool</td>
<td>World Precision Instruments</td>
<td>MPH6S</td>
<td>Use to hold microelectrode </td>
</tr>
<tr>
<td>Micromanipulator</td>
<td>Tool</td>
<td>Sutter</td>
<td>MP-85</td>
<td>Use to position microelectrode in the three-axis</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

live-imaging of pkc translocation in sf9 cells and in aplysia sensory neurons

La protéine kinase C (PKC) sont des sérine thréonine kinases qui jouent un rôle central dans la régulation d&#39;une grande variété de processus cellulaires tels que la croissance cellulaire et de l&#39;apprentissage et la mémoire. Il ya quatre familles connues des isoformes de la PKC chez les vertébrés: PKC classiques (α, ßi, βII et γ), le type de roman que je PKC (ε et η), le roman de type II PKC (δ et θ), et des PKC atypiques (ζ et ι ). La PKC classiques sont activés par le Ca 2 + et diacylclycerol (DAG), tandis que le roman de PKC sont activées par le DAG, mais sont Ca 2 +-indépendante. La PKC atypiques sont activés par Ca 2 + ni, ni DAG. En Aplysia californica, notre système modèle pour étudier la formation de la mémoire, il ya trois système nerveux spécifiques isoformes de PKC un de chaque grande catégorie, à savoir le traditionnel PKC Apl I, le type de roman que je PKC Apl II et l&#39;atypique PKC Apl III. PKC sont des lipides kinases activées et donc l&#39;activation des PKC classiques et novatrices en réponse aux signaux extracellulaires a été fréquemment corrélée à la translocation de la PKC cytoplasme vers la membrane plasmique. Ainsi, en visualisant la translocation de la PKC dans le temps réel dans des cellules vivantes est devenu un outil précieux pour élucider les voies de transduction du signal qui conduisent à l&#39;activation de PKC. Par exemple, cette technique a permis d&#39;établir que différentes isoformes de la PKC translocation dans des conditions différentes de médiation types distincts de la plasticité synaptique et que la sérotonine (5HT) activation de la PKC Apl II nécessite la production de deux DAG et l&#39;acide phosphatidique (PA) pour translocation 1-2. Fait important, la capacité de visualiser le même neurone a à plusieurs reprises nous a permis, par exemple, pour mesurer la désensibilisation de la réponse de la PKC dans le détail exquis 3. Dans cette vidéo, nous démontrons chaque étape de la préparation des cultures de cellules Sf9, des cultures de neurones sensoriels aplysie ont été décrites dans un autre article 4 vidéo, en exprimant PKC fluorescence marqués dans les cellules Sf9 et dans les neurones sensoriels aplysie et en direct de la translocation de la PKC imagerie en réponse à activateurs différents en utilisant le laser-microscopie à balayage.

Watch this Scientific Journal Video about Live-imaging of PKC Translocation in Sf9 Cells and in Aplysia Sensory Neurons at JoVE.com

Live-imaging of PKC Translocation in Sf9 Cells and in Aplysia Sensory Neurons

Dans cette vidéo, nous démontrons la visualisation de la translocation de la PKC dans les cellules vivantes en utilisant PKC fluorescence marqués.

Live-imagerie de la translocation de la PKC dans les cellules Sf9 et dans les neurones sensoriels aplysie

Protein kinase Cs (PKCs) are serine threonine kinases that play a central role in regulating a wide variety of cellular processes such as cell growth and ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

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Dissection et la culture de neurones de la moelle épinière commissurales embryonnaires

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