Name: live-imaging of pkc translocation in sf9 cells and in aplysia sensory neurons
Uploaded: 2011-04-06T11:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Live-imaging of PKC Translocation in Sf9 Cells and in Aplysia Sensory Neurons at JoVE.com

इस काम कनाडा के स्वास्थ्य अनुसंधान अनुदान (CIHR) की वेन एस Sossin के लिए संस्थान द्वारा समर्थित किया गया था. कैरोल ए फराह डे ला Fonds Recherche एन SANTE डु (FRSQ) क्यूबेक और कॉनरोड Harrington फैलोशिप से एक postdoctoral फैलोशिप के प्राप्तकर्ता है. लेखकों वीडियो और ग्राफिक सिंहावलोकन के साथ मदद के लिए मेडलिन रिचमंड पूल शूट के साथ मदद के लिए Joanna बत्ती, मार्गरेट हेस्टिंग्स और मार्गरेट Labban धन्यवाद देना चाहूंगा.

1. तैयारी और Sf9 सेल monolayer संस्कृतियों का रखरखाव <ol><li> Sf9 सेल संस्कृति और रखरखाव एक टिशू कल्चर हुड में किया जाता है. </li><li> Sf9 कोशिकाओं Spodoptera frugiperda डिम्बग्रंथि कोशिकाओं (Sf21 सेल) से व्युत्पन्न हैं और Invitrogen से अनुग्रह म?...

<ol>
	<li>Farah, C. A., Nagakura, I., Weatherill, D., Fan, X. &. a. m. p. ;. a. m. p., Sossin, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+role+for+phosphatidic+acid+in+the+translocation+of+the+novel+protein+kinase+C+Apl+II+in+Aplysia+neurons.">Physiological role for phosphatidic acid in the translocation of the novel protein kinase C Apl II in Aplysia neurons.</a> Mol Cell Biol. 28, 4719-4733 (2008).</li><li>Zhao, Y., Leal, K., Abi-Farah, C., Martin, K. C., Sossin, W. S. &. a. m. p. ;. a. m. p., Klein, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M.Isoform+specificity+of+PKC+translocation+in+living+Aplysia+sensory+neurons+and+a+role+for+Ca2+-dependent+PKC+APL+I+in+the+induction+of+intermediate-term+facilitation.">M.Isoform specificity of PKC translocation in living Aplysia sensory neurons and a role for Ca2+-dependent PKC APL I in the induction of intermediate-term facilitation.</a> J Neurosci. 26, 8847-8856 (2006).</li><li>Farah, C. A., Weatherill, D., Dunn, T. W. &. a. m. p. ;. a. m. p., Sossin, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PKC+differentially+translocates+during+spaced+and+massed+training+in+Aplysia.">PKC differentially translocates during spaced and massed training in Aplysia.</a> J Neurosci. 29, 10281-10286 (2009).</li><li>Zhao, Y., Wang, D. O., Martin, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+Aplysia+sensory-motor+neuronal+cell+cultures.">Preparation of Aplysia sensory-motor neuronal cell cultures.</a> J Vis Exp. , (2009).</li><li>Manseau, F., Fan, X., Hueftlein, T., Sossin, W. S., Castellucci, V. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca2+-independent+PKC+Apl+II+mediates+the+serotonin+induced+facilitation+at+depressed+synapses+in+Aplysia.">Ca2+-independent PKC Apl II mediates the serotonin induced facilitation at depressed synapses in Aplysia.</a> J. Neuroscience. 21, 1247-1256 (2001).</li></ol>

हम fluorescently टैग PKCS की छवि स्थानान्तरण करने के लिए एक तकनीक का वर्णन है Sf9 कोशिकाओं में और Aplysia संवेदी न्यूरॉन्स में वास्तविक समय में. Sf9 कोशिकाओं छवि PKC स्थानान्तरण करने के लिए एक सरल प्रणाली प्रदान करते हैं ?...

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Sf9 frozen cells</td>
<td>Spodoptera frugiperda ovarian cells</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>B825-01</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Grace&#x2019;s Insect Medium, Supplemented (1X), liquid</td>
<td>Reagent</td>
<td>Gibco</td>
<td>11605-094</td>
<td>Use to culture Sf9 cells</td>
</tr>
<tr>
<td>Corning 75cm2 canted neck cell culture flask</td>
<td>Tool</td>
<td>Corning</td>
<td>430720</td>
<td>Use to culture Sf9 cells</td>
</tr>
<tr>
<td>Fetal Bovine Serum</td>
<td>Reagent</td>
<td>CanSera</td>
<td>CS-C08-500</td>
<td>Supplement Grace's media with FBS prior to use</td>
</tr>
<tr>
<td>Syringe</td>
<td>Tool</td>
<td>Becton Dickinson</td>
<td>309604</td>
<td>Use to filter Fast Green solution</td>
</tr>
<tr>
<td>Syringe</td>
<td>Tool</td>
<td>Becton Dickinson</td>
<td>309602</td>
<td>Use to filter plasmid DNA / Fast Green solution</td>
</tr>
<tr>
<td>Filter</td>
<td>Tool</td>
<td>Corning</td>
<td>431229</td>
<td>Use to filter Fast Green solution</td>
</tr>
<tr>
<td>Filter</td>
<td>Tool</td>
<td>Corning</td>
<td>431212</td>
<td>Use to filter plasmid DNA / Fast Green solution</td>
</tr>
<tr>
<td>Glass Bottom Dish</td>
<td>Tool</td>
<td>Mattek</td>
<td>P35G-1.5-14-C</td>
<td>Use to culture Sf9 cells prior to transfection and imaging</td>
</tr>
<tr>
<td>Cellfectin II Reagent</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>10362-100</td>
<td>Used to express fluorescently tagged PKCs in Sf9 cells</td>
</tr>
<tr>
<td>Fast Green FCF</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>F-7252</td>
<td>Use to visualize microinjection of plasmid DNA solution into Aplysia sensory neurons</td>
</tr>
<tr>
<td>Thin wall glass capillaries</td>
<td>Tool</td>
<td>World Precision Instruments</td>
<td>TW100F-4</td>
<td>Use to make microelectrodes for microinjection</td>
</tr>
<tr>
<td>Microloader pipette tip</td>
<td>Tool</td>
<td>Eppendorf</td>
<td>CA32950-050</td>
<td>Autoclave before using to fill up the microelectrodes for microinjection</td>
</tr>
<tr>
<td>PV820 Pneumatic PicoPump </td>
<td>Tool</td>
<td>World Precision Instruments</td>
<td>SYS-PV820</td>
<td>Part of microinjection station</td>
</tr>
<tr>
<td>Microelectrode holder</td>
<td>Tool</td>
<td>World Precision Instruments</td>
<td>MPH6S</td>
<td>Use to hold microelectrode </td>
</tr>
<tr>
<td>Micromanipulator</td>
<td>Tool</td>
<td>Sutter</td>
<td>MP-85</td>
<td>Use to position microelectrode in the three-axis</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

live-imaging of pkc translocation in sf9 cells and in aplysia sensory neurons

प्रोटीन kinase Cs (PKCS) threonine kinases है कि सेल के विकास और सीखने और स्मृति के रूप में सेलुलर प्रक्रियाओं की एक विस्तृत विविधता को विनियमित करने में एक केंद्रीय भूमिका निभा सेरीन हैं. PKC isoforms की रीढ़ में चार ज्ञात परिवारों हैं: शास्त्रीय PKCS (α, βI, βII और γ), उपन्यास प्रकार मैं PKCS (ε और η), उपन्यास प्रकार द्वितीय पीकेसीएस (δ और θ), और atypical (PKCS ζ और ι ). शास्त्रीय PKCS Ca 2 द्वारा सक्रिय कर रहे हैं + और ​​(DAG) diacylclycerol, जबकि उपन्यास PKCS DAG द्वारा सक्रिय कर रहे हैं, लेकिन 2 Ca + स्वतंत्र हैं . atypical PKCS न तो + न ही DAG 2 Ca द्वारा सक्रिय कर रहे हैं. Aplysia californica में, हमारे मॉडल प्रणाली स्मृति गठन का अध्ययन, वहाँ तीन तंत्रिका तंत्र विशिष्ट PKC प्रत्येक प्रमुख वर्ग से isoforms, अर्थात् पारंपरिक PKC एपीएल मैं, उपन्यास प्रकार मैं PKC एपीएल द्वितीय और atypical PKC एपीएल III हैं . PKCS kinases लिपिड सक्रिय हैं और इस प्रकार कोशिकी संकेतों के जवाब में शास्त्रीय और उपन्यास PKCS के सक्रियण अक्सर cytoplasm से प्लाज्मा झिल्ली PKC स्थानान्तरण के साथ सहसंबद्ध किया गया है. इसलिए, जीवित कोशिकाओं में वास्तविक समय में PKC स्थानान्तरण visualizing संकेत पारगमन मार्ग है कि PKC सक्रियण के लिए नेतृत्व elucidating के लिए एक अमूल्य उपकरण बन गया है. उदाहरण के लिए, इस तकनीक के लिए हमें की अनुमति दी गई है स्थापित करने के लिए है कि PKC के अलग isoforms अलग अलग परिस्थितियों में टसकाना synaptic plasticity के विशिष्ट प्रकार मध्यस्थता और PKC एपीएल द्वितीय की है कि serotonin सक्रियण (5HT) के लिए दोनों DAG और phosphatidic एसिड (PA) के उत्पादन की आवश्यकता है 1-2 स्थानान्तरण. महत्वपूर्ण बात, एक न्यूरॉन ही कल्पना करने की क्षमता को बार - बार हमें, उदाहरण के लिए, उत्तम विस्तार में 3 PKC प्रतिक्रिया की desensitization को मापने के लिए अनुमति दी गई है. इस वीडियो में, हम Sf9 सेल संस्कृतियों की तैयारी के हर कदम का प्रदर्शन, एक और वीडियो 4 लेख में Aplysia संवेदी न्यूरॉन्स की संस्कृतियों में वर्णित किया गया है, के जवाब में Sf9 कोशिकाओं में और Aplysia संवेदी न्यूरॉन्स और PKC स्थानान्तरण के रहते इमेजिंग में fluorescently टैग PKCS व्यक्त अलग लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी का उपयोग activators.

Watch this Scientific Journal Video about Live-imaging of PKC Translocation in Sf9 Cells and in Aplysia Sensory Neurons at JoVE.com

Live-imaging of PKC Translocation in Sf9 Cells and in Aplysia Sensory Neurons

इस वीडियो में, हम रहने वाले fluorescently टैग PKCS का उपयोग कर कक्षों में PKC स्थानान्तरण के दृश्य प्रदर्शित करता है.

Sf9 कक्ष में और Aplysia संवेदी न्यूरॉन्स में PKC स्थानान्तरण के लाइव इमेजिंग

Protein kinase Cs (PKCs) are serine threonine kinases that play a central role in regulating a wide variety of cellular processes such as cell growth and ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

विच्छेदन और भ्रूणीय स्पाइनल कॉर्ड से Commissural न्यूरॉन्स की संस्कृति

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Time-lapse Live Imaging of Clonally Related Neural Progenitor Cells in the Developing Zebrafish Forebrain

समय चूक विकास Zebrafish अग्रमस्तिष्क में Clonally संबंधित तंत्रिका पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं की लाइव इमेजिंग

Precise patterns of division, migration and differentiation of neural progenitor cells are crucial for proper brain development and function1,2. To ...

Neuromodulation and Mitochondrial Transport: Live Imaging in Hippocampal Neurons over Long Durations

Neuromodulation और Mitochondrial परिवहन: लंबे durations पर hippocampal न्यूरॉन्स में लाइव इमेजिंग

To understand the relationship between mitochondrial transport and neuronal function, it is critical to observe mitochondrial behavior in live cultured ...

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

संवेदी अंग अग्रदूत साबित कोशिकाओं के बरकरार में लाइव सेल इमेजिंग ड्रोसोफिला Pupae

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

Lentivirus-mediated Genetic Manipulation and Visualization of Olfactory Sensory Neurons in vivo

Lentivirus-mediated Genetic Manipulation and Visualization of Olfactory Sensory Neurons in vivo

Lentivirus की मध्यस्थता जेनेटिक और घ्राण संवेदी न्यूरॉन्स के हेरफेर विज़ुअलाइज़ेशन Vivo में</em

Development of a precise olfactory circuit relies on accurate projection of olfactory sensory neuron (OSN) axons to their synaptic 
targets in the ...

Flash Photolysis of Caged Compounds in the Cilia of Olfactory Sensory  Neurons

बंदी कम्पाउँड की घ्राण संवेदी न्यूरॉन्स की cilia में फ़्लैश Photolysis

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds1. ...

Extracellularly Identifying Motor Neurons for a Muscle Motor Pool in Aplysia californica

Extracellularly Identifying Motor Neurons for a Muscle Motor Pool in Aplysia californica

एक स्नायु मोटर पूल के लिए Extracellularly मोटर न्यूरॉन्स की पहचान<em&gt; Aplysia californica</em

In animals with large  identified neurons (e.g. mollusks), analysis of motor pools is done using  intracellular techniques1,2,3,4. Recently,  we developed ...

Isolation of Sensory Neurons of Aplysia californica for Patch Clamp Recordings of Glutamatergic Currents

Isolation of Sensory Neurons of Aplysia californica for Patch Clamp Recordings of Glutamatergic Currents

का संवेदी न्यूरॉन्स के अलगाव<em&gt; Aplysia californica</em&gt; Glutamatergic धाराओं के पैच दबाना रिकॉर्डिंग के लिए

The marine gastropod mollusk Aplysia californica has a venerable  history as a model of nervous system function, with particular significance in  studies ...

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

में घ्राण रिसेप्टर न्यूरॉन्स के पूरा पर्वत immunolabeling<em&gt; ड्रोसोफिला</em&gt; एंटीना

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

A Method to Target and Isolate Airway-innervating Sensory Neurons in Mice

एक विधि को लक्षित और चूहे में अलग-श्वासनली innervating संवेदी न्यूरॉन्स के लिए

Somatosensory nerves transduce thermal, mechanical, chemical, and noxious stimuli caused by both endogenous and environmental agents. The cell bodies of ...