Name: live-imaging of pkc translocation in sf9 cells and in aplysia sensory neurons
Uploaded: 2011-04-06T11:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Live-imaging of PKC Translocation in Sf9 Cells and in Aplysia Sensory Neurons at JoVE.com

이 작품은 웨인 S. Sossin으로 보건 연구 (CIHR) 부여 캐나다 연구소에 의해 지원되었다. 캐롤 A. 파라이 드 라 퐁 물리 엉 쌍떼 두 퀘벡 (FRSQ)와 콘라드 해링턴 교제에서 박사 후 교제의 수상자이다. 저자는 그래픽 개요 도움 비디오 촬영과 매들린 리치몬드 풀에 대한 도움 조애너 부기, 마가렛 헤이스팅스와 마가렛 Labban 감사하고 싶습니다.

1. 준비 및 Sf9 세포 Monolayer 문화의 유지 보수 <ol><li> Sf9 세포 배양 및 유지 관리는 조직 문화 후드에서 수행됩니다. </li><li> Sf9 세포 Spodoptera frugiperda의 난소 세포 (Sf21 세포)에서 파생되며 Invitrogen에서 그레이스의 미디어에 냉동 세포로 구입할 수 있습니다. </li><li> 보충 그레이스의 곤충 매체 (1X), 30 % 태아 소 혈청 (FBS) canted 목이 75cm 2 세포 배양 플라스크에 추가되었습니다. 장소 8 ML ...

<ol>
	<li>Farah, C. A., Nagakura, I., Weatherill, D., Fan, X. &. a. m. p. ;. a. m. p., Sossin, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+role+for+phosphatidic+acid+in+the+translocation+of+the+novel+protein+kinase+C+Apl+II+in+Aplysia+neurons.">Physiological role for phosphatidic acid in the translocation of the novel protein kinase C Apl II in Aplysia neurons.</a> Mol Cell Biol. 28, 4719-4733 (2008).</li><li>Zhao, Y., Leal, K., Abi-Farah, C., Martin, K. C., Sossin, W. S. &. a. m. p. ;. a. m. p., Klein, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M.Isoform+specificity+of+PKC+translocation+in+living+Aplysia+sensory+neurons+and+a+role+for+Ca2+-dependent+PKC+APL+I+in+the+induction+of+intermediate-term+facilitation.">M.Isoform specificity of PKC translocation in living Aplysia sensory neurons and a role for Ca2+-dependent PKC APL I in the induction of intermediate-term facilitation.</a> J Neurosci. 26, 8847-8856 (2006).</li><li>Farah, C. A., Weatherill, D., Dunn, T. W. &. a. m. p. ;. a. m. p., Sossin, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PKC+differentially+translocates+during+spaced+and+massed+training+in+Aplysia.">PKC differentially translocates during spaced and massed training in Aplysia.</a> J Neurosci. 29, 10281-10286 (2009).</li><li>Zhao, Y., Wang, D. O., Martin, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+Aplysia+sensory-motor+neuronal+cell+cultures.">Preparation of Aplysia sensory-motor neuronal cell cultures.</a> J Vis Exp. , (2009).</li><li>Manseau, F., Fan, X., Hueftlein, T., Sossin, W. S., Castellucci, V. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca2+-independent+PKC+Apl+II+mediates+the+serotonin+induced+facilitation+at+depressed+synapses+in+Aplysia.">Ca2+-independent PKC Apl II mediates the serotonin induced facilitation at depressed synapses in Aplysia.</a> J. Neuroscience. 21, 1247-1256 (2001).</li></ol>

우리는 Sf9 세포와 감각 뉴런 Aplysia에서 실시간으로 찬란 태그 PKCS의 이미지 translocation에 기술을 설명합니다. culturing 그들을 transfecting 아주 스트레이트 포워드이기 때문에 Sf9 세포 이미지 PKC translocation하는 간단한 시스템을 제공합니다. 대조적으로, Aplysia 감각 뉴런의 microinjection은 주인에게 몇 시간이 걸립니다, 최대 몇 개월까지. 이 기법에 관한 어려움 전극 막히는가 포함되어 있습...

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Sf9 frozen cells</td>
<td>Spodoptera frugiperda ovarian cells</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>B825-01</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Grace&#x2019;s Insect Medium, Supplemented (1X), liquid</td>
<td>Reagent</td>
<td>Gibco</td>
<td>11605-094</td>
<td>Use to culture Sf9 cells</td>
</tr>
<tr>
<td>Corning 75cm2 canted neck cell culture flask</td>
<td>Tool</td>
<td>Corning</td>
<td>430720</td>
<td>Use to culture Sf9 cells</td>
</tr>
<tr>
<td>Fetal Bovine Serum</td>
<td>Reagent</td>
<td>CanSera</td>
<td>CS-C08-500</td>
<td>Supplement Grace's media with FBS prior to use</td>
</tr>
<tr>
<td>Syringe</td>
<td>Tool</td>
<td>Becton Dickinson</td>
<td>309604</td>
<td>Use to filter Fast Green solution</td>
</tr>
<tr>
<td>Syringe</td>
<td>Tool</td>
<td>Becton Dickinson</td>
<td>309602</td>
<td>Use to filter plasmid DNA / Fast Green solution</td>
</tr>
<tr>
<td>Filter</td>
<td>Tool</td>
<td>Corning</td>
<td>431229</td>
<td>Use to filter Fast Green solution</td>
</tr>
<tr>
<td>Filter</td>
<td>Tool</td>
<td>Corning</td>
<td>431212</td>
<td>Use to filter plasmid DNA / Fast Green solution</td>
</tr>
<tr>
<td>Glass Bottom Dish</td>
<td>Tool</td>
<td>Mattek</td>
<td>P35G-1.5-14-C</td>
<td>Use to culture Sf9 cells prior to transfection and imaging</td>
</tr>
<tr>
<td>Cellfectin II Reagent</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>10362-100</td>
<td>Used to express fluorescently tagged PKCs in Sf9 cells</td>
</tr>
<tr>
<td>Fast Green FCF</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>F-7252</td>
<td>Use to visualize microinjection of plasmid DNA solution into Aplysia sensory neurons</td>
</tr>
<tr>
<td>Thin wall glass capillaries</td>
<td>Tool</td>
<td>World Precision Instruments</td>
<td>TW100F-4</td>
<td>Use to make microelectrodes for microinjection</td>
</tr>
<tr>
<td>Microloader pipette tip</td>
<td>Tool</td>
<td>Eppendorf</td>
<td>CA32950-050</td>
<td>Autoclave before using to fill up the microelectrodes for microinjection</td>
</tr>
<tr>
<td>PV820 Pneumatic PicoPump </td>
<td>Tool</td>
<td>World Precision Instruments</td>
<td>SYS-PV820</td>
<td>Part of microinjection station</td>
</tr>
<tr>
<td>Microelectrode holder</td>
<td>Tool</td>
<td>World Precision Instruments</td>
<td>MPH6S</td>
<td>Use to hold microelectrode </td>
</tr>
<tr>
<td>Micromanipulator</td>
<td>Tool</td>
<td>Sutter</td>
<td>MP-85</td>
<td>Use to position microelectrode in the three-axis</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

live-imaging of pkc translocation in sf9 cells and in aplysia sensory neurons

단백질 키나제 고사 (PKCS)는 같은 세포 성장과 학습과 메모리로 휴대 프로세스의 다양한 규제에 중심 역할을 트레오닌 kinases 세린입니다. 척추 동물에서 PKC isoforms 네 가지 알려진 가족이 있습니다 : 고전 PKCS (α, βI, βII 및 γ), 소설 형식 내가 PKCS (ε와 η), 소설 유형 II PKCS (δ와 θ) 및 비정형 PKCS (ζ 및 ι ). 고전 PKCS는 칼슘이 활성화하는 소설 PKCS는 가리비 활성화하지만, 칼슘 2 + - 독립하는 동안 +와 diacylclycerol (가리비). 비정형 PKCS는 +이나 가리비 칼슘이도에 의해 활성화됩니다. Aplysia californica에서는, 메모리 형성을 공부하기 위해 모델 시스템, 즉 세 신경계 특정 PKC isoforms 각 주요 클래스에서 하나 기존의 PKC APL I, 소설 종류 I PKC APL II 및 비정형 PKC APL III있다. PKCS는 지질 활성화 kinases되며 따라서 세포 신호에 대한 응답으로 고전과 소설 PKCS의 활성화가 자주 세포질에서 플라즈마 막에 PKC translocation와 상관되었습니다. 따라서, 라이브 세포에서 실시간으로 PKC translocation을 시각화하는 것은 PKC 활성화로 이어질 신호 전달 경로를 elucidating위한 소중한 도구가되고있다. 예를 들어,이 기술은 PKC의 다른 isoforms은 시냅스 소성의 독특한 유형을 중재하기 위해 서로 다른 조건에서 이동시키다 및 PKC APL II의 세로토닌 (5HT) 활성화가 가리비와 phosphatidic 산성 (PA) 모두의 생산을 필요로 설립 우리에게 허용되었습니다 translocation 1-2. 중요한 것은, 같은 신경을 시각화하는 능력은 반복해서 우리가 예를 들어, 정교한 세부 3 PKC 응답의 desensitization를 측정할 수있다. 이 비디오에서는, 우리는 Sf9 세포 문화를 준비하는 각 단계를 보여, Aplysia 감각 뉴런의 문화가에 대한 응답으로 Sf9 세포에서 Aplysia 감각 뉴런과 PKC translocation 라이브 영상에 찬란 태그 PKCS을 표현, 다른 영상 제 4에 설명되어있다 레이저 스캐닝 현미경을 사용하여 다른 activators.

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Live-imaging of PKC Translocation in Sf9 Cells and in Aplysia Sensory Neurons

이 비디오에서는, 우리는 찬란 태그 PKCS을 사용하여 살아있는 세포에서 PKC translocation의 시각화를 보여줍니다.

Sf9 세포에서 Aplysia 감각 뉴런에서 PKC Translocation의 라이브 영상

Protein kinase Cs (PKCs) are serine threonine kinases that play a central role in regulating a wide variety of cellular processes such as cell growth and ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

배아 척수에서 뉴런의 Commissural 해부와 문화

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

연구

신경과학

Time-lapse Live Imaging of Clonally Related Neural Progenitor Cells in the Developing Zebrafish Forebrain

개발 Zebrafish Forebrain에 Clonally 관련 신경 전구 세포의 시간 경과 라이브 영상

Precise patterns of division, migration and differentiation of neural progenitor cells are crucial for proper brain development and function1,2. To ...

Neuromodulation and Mitochondrial Transport: Live Imaging in Hippocampal Neurons over Long Durations

Neuromodulation 및 Mitochondrial 교통 : 긴 기간이 이상 Hippocampal 뉴런의 라이브 영상

To understand the relationship between mitochondrial transport and neuronal function, it is critical to observe mitochondrial behavior in live cultured ...

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

손상의 감각 오르간 전구체 세포 라이브 셀 이미징 Drosophila Pupae

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

Lentivirus-mediated Genetic Manipulation and Visualization of Olfactory Sensory Neurons in vivo

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강한 감각 뉴런의 Lentivirus - 중재 유전자 조작 및 시각화 생체내에</em

Development of a precise olfactory circuit relies on accurate projection of olfactory sensory neuron (OSN) axons to their synaptic 
targets in the ...

Flash Photolysis of Caged Compounds in the Cilia of Olfactory Sensory  Neurons

강한 감각 뉴런의 속눈썹에 갇힌 화합물의 플래시 광분해

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds1. ...

Extracellularly Identifying Motor Neurons for a Muscle Motor Pool in Aplysia californica

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Extracellularly의 근육 모터 풀에 모터 뉴런을 확인<em&gt; Aplysia californica</em

In animals with large  identified neurons (e.g. mollusks), analysis of motor pools is done using  intracellular techniques1,2,3,4. Recently,  we developed ...

Isolation of Sensory Neurons of Aplysia californica for Patch Clamp Recordings of Glutamatergic Currents

Isolation of Sensory Neurons of Aplysia californica for Patch Clamp Recordings of Glutamatergic Currents

의 감각 뉴런의 분리<em&gt; 군소 californica</em&gt; 글루타메이트 전류의 패치 클램프 녹음을위한

The marine gastropod mollusk Aplysia californica has a venerable  history as a model of nervous system function, with particular significance in  studies ...

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

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에있는 후각 수용체 뉴런의 전체 마운트 Immunolabeling<em&gt; 초파리</em&gt; 안테나

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

A Method to Target and Isolate Airway-innervating Sensory Neurons in Mice

Method는 목표와 마우스의 격리기도 - 근에 분포하는 감각 뉴런하기

Somatosensory nerves transduce thermal, mechanical, chemical, and noxious stimuli caused by both endogenous and environmental agents. The cell bodies of ...