Name: live-imaging of pkc translocation in sf9 cells and in aplysia sensory neurons
Uploaded: 2011-04-06T11:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Live-imaging of PKC Translocation in Sf9 Cells and in Aplysia Sensory Neurons at JoVE.com

Detta arbete stöddes av kanadensiska Institutes of Health Research (CIHR) Bidrag till Wayne S. Sossin. Carole A. Farah är mottagare av ett postdoktorsstipendium från Fonds de la recherche en Santé du Québec (FRSQ) och en Conrad Harrington gemenskap. Författarna vill tacka Joanna Bougie, Margaret Hastings och Margaret Labban för hjälp med video skjuta och Madeline Richmond Pool för hjälp med grafisk översikt.

1. Upprättande och underhåll av Sf9 cellodlingar monolager <ol><li> Sf9 cellkultur och underhåll utförs i en vävnad kultur huva. </li><li> Sf9 celler kommer från Spodoptera frugiperda äggstockscancer celler (Sf21 celler) och kan köpas som frysta celler i Graces media från Invitrogen. </li><li> Plats 8 ml Grace insekt medelstora kompletteras (1X), till vilken 30% fetalt bovint serum (FBS) har lagts till i en 75 cm 2 cellodling kolv med en snedställd hals. </li><li> Tina frysta tub Sf9 cell...

<ol>
	<li>Farah, C. A., Nagakura, I., Weatherill, D., Fan, X. &. a. m. p. ;. a. m. p., Sossin, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+role+for+phosphatidic+acid+in+the+translocation+of+the+novel+protein+kinase+C+Apl+II+in+Aplysia+neurons.">Physiological role for phosphatidic acid in the translocation of the novel protein kinase C Apl II in Aplysia neurons.</a> Mol Cell Biol. 28, 4719-4733 (2008).</li><li>Zhao, Y., Leal, K., Abi-Farah, C., Martin, K. C., Sossin, W. S. &. a. m. p. ;. a. m. p., Klein, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M.Isoform+specificity+of+PKC+translocation+in+living+Aplysia+sensory+neurons+and+a+role+for+Ca2+-dependent+PKC+APL+I+in+the+induction+of+intermediate-term+facilitation.">M.Isoform specificity of PKC translocation in living Aplysia sensory neurons and a role for Ca2+-dependent PKC APL I in the induction of intermediate-term facilitation.</a> J Neurosci. 26, 8847-8856 (2006).</li><li>Farah, C. A., Weatherill, D., Dunn, T. W. &. a. m. p. ;. a. m. p., Sossin, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PKC+differentially+translocates+during+spaced+and+massed+training+in+Aplysia.">PKC differentially translocates during spaced and massed training in Aplysia.</a> J Neurosci. 29, 10281-10286 (2009).</li><li>Zhao, Y., Wang, D. O., Martin, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+Aplysia+sensory-motor+neuronal+cell+cultures.">Preparation of Aplysia sensory-motor neuronal cell cultures.</a> J Vis Exp. , (2009).</li><li>Manseau, F., Fan, X., Hueftlein, T., Sossin, W. S., Castellucci, V. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca2+-independent+PKC+Apl+II+mediates+the+serotonin+induced+facilitation+at+depressed+synapses+in+Aplysia.">Ca2+-independent PKC Apl II mediates the serotonin induced facilitation at depressed synapses in Aplysia.</a> J. Neuroscience. 21, 1247-1256 (2001).</li></ol>

Vi har beskrivit en teknik för att bilden förflyttning av fluorescerande taggade PKCS i realtid i Sf9 celler och i Aplysia sensoriska neuroner. Sf9 celler ger ett enkelt system för att bilden PKC translokation sedan odling och transfecting dem är ganska enkel. Däremot tar mikroinjektion av Aplysia sensoriska neuroner lite tid att bemästra, upp till några månader. Svårigheter i samband med denna teknik inkluderar elektrod igensättning. Filtrering injektionslösningen och centrifugering det oft...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Sf9 frozen cells</td>
<td>Spodoptera frugiperda ovarian cells</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>B825-01</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Grace&#x2019;s Insect Medium, Supplemented (1X), liquid</td>
<td>Reagent</td>
<td>Gibco</td>
<td>11605-094</td>
<td>Use to culture Sf9 cells</td>
</tr>
<tr>
<td>Corning 75cm2 canted neck cell culture flask</td>
<td>Tool</td>
<td>Corning</td>
<td>430720</td>
<td>Use to culture Sf9 cells</td>
</tr>
<tr>
<td>Fetal Bovine Serum</td>
<td>Reagent</td>
<td>CanSera</td>
<td>CS-C08-500</td>
<td>Supplement Grace's media with FBS prior to use</td>
</tr>
<tr>
<td>Syringe</td>
<td>Tool</td>
<td>Becton Dickinson</td>
<td>309604</td>
<td>Use to filter Fast Green solution</td>
</tr>
<tr>
<td>Syringe</td>
<td>Tool</td>
<td>Becton Dickinson</td>
<td>309602</td>
<td>Use to filter plasmid DNA / Fast Green solution</td>
</tr>
<tr>
<td>Filter</td>
<td>Tool</td>
<td>Corning</td>
<td>431229</td>
<td>Use to filter Fast Green solution</td>
</tr>
<tr>
<td>Filter</td>
<td>Tool</td>
<td>Corning</td>
<td>431212</td>
<td>Use to filter plasmid DNA / Fast Green solution</td>
</tr>
<tr>
<td>Glass Bottom Dish</td>
<td>Tool</td>
<td>Mattek</td>
<td>P35G-1.5-14-C</td>
<td>Use to culture Sf9 cells prior to transfection and imaging</td>
</tr>
<tr>
<td>Cellfectin II Reagent</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>10362-100</td>
<td>Used to express fluorescently tagged PKCs in Sf9 cells</td>
</tr>
<tr>
<td>Fast Green FCF</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>F-7252</td>
<td>Use to visualize microinjection of plasmid DNA solution into Aplysia sensory neurons</td>
</tr>
<tr>
<td>Thin wall glass capillaries</td>
<td>Tool</td>
<td>World Precision Instruments</td>
<td>TW100F-4</td>
<td>Use to make microelectrodes for microinjection</td>
</tr>
<tr>
<td>Microloader pipette tip</td>
<td>Tool</td>
<td>Eppendorf</td>
<td>CA32950-050</td>
<td>Autoclave before using to fill up the microelectrodes for microinjection</td>
</tr>
<tr>
<td>PV820 Pneumatic PicoPump </td>
<td>Tool</td>
<td>World Precision Instruments</td>
<td>SYS-PV820</td>
<td>Part of microinjection station</td>
</tr>
<tr>
<td>Microelectrode holder</td>
<td>Tool</td>
<td>World Precision Instruments</td>
<td>MPH6S</td>
<td>Use to hold microelectrode </td>
</tr>
<tr>
<td>Micromanipulator</td>
<td>Tool</td>
<td>Sutter</td>
<td>MP-85</td>
<td>Use to position microelectrode in the three-axis</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

live-imaging of pkc translocation in sf9 cells and in aplysia sensory neurons

Proteinkinas Cs (PKCS) är serine treonin-kinaser som spelar en central roll i regleringen av en mängd olika cellulära processer såsom celltillväxt och inlärning och minne. Det finns fyra kända familjer av PKC isoformer hos ryggradsdjur: klassiska PKCS (α, βI, βII och γ), ny typ jag PKCS (ε och η), ny typ II PKCS (δ och θ) och atypiska PKCS (ζ och ι ). De klassiska PKCS aktiveras av Ca 2 + och diacylclycerol (DAG), medan romanen PKCS aktiveras av Dag, men är Ca2 +-oberoende. De atypiska PKCS aktiveras av varken Ca 2 + eller DAG. I Aplysia californica, vår modell för att studera minnet bildas, finns det tre nervsystemet specifik PKC isoformer en från varje större klass, nämligen den konventionella PKC APL jag, romanen typ I PKC APL II och atypiska PKC APL III. PKCS är lipid-aktiverade kinaser och därmed aktivering av klassiska och nya PKCS som svar på extracellulära signaler har ofta korrelerad med PKC translokation från cytoplasman till plasmamembranet. Därför har visualisera PKC translokation i realtid i levande celler blir ett ovärderligt verktyg för att belysa signaltransduktionsvägar som leder till PKC aktivering. Till exempel har denna teknik möjlighet för oss att konstatera att olika isoformer av PKC translocate under olika förhållanden för att förmedla olika typer av synaptisk plasticitet och att serotonin (5HT) aktivering av PKC APL II krävs produktion av både Dag och fosfatinsyra (PA) för translokation 1-2. Viktigt är förmågan att visualisera samma neuron upprepade gånger har gjort att vi, till exempel för att mäta hyposensibilisering av PKC svar i utsökt detalj 3. I den här videon visar vi varje steg för att förbereda Sf9 cellkulturer har kultur Aplysia sensoriska neuroner har beskrivits i en annan video artikel 4, uttrycka fluorescerande taggade PKCS i Sf9 celler och i Aplysia sensoriska neuroner och live-avbildning av PKC translokationen som svar på olika aktivatorer med hjälp av laser-scanning mikroskopi.

Watch this Scientific Journal Video about Live-imaging of PKC Translocation in Sf9 Cells and in Aplysia Sensory Neurons at JoVE.com

Live-imaging of PKC Translocation in Sf9 Cells and in Aplysia Sensory Neurons

I denna video visar vi visualisering av PKC translokationen i levande celler med fluorescerande taggade PKCS.

Live-avbildning av PKC translokation hos Sf9 celler och i Aplysia sensoriska neuroner

Protein kinase Cs (PKCs) are serine threonine kinases that play a central role in regulating a wide variety of cellular processes such as cell growth and ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Dissektion och kultur commissural neuroner från embryonala ryggmärg

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Time-lapse Live Imaging of Clonally Related Neural Progenitor Cells in the Developing Zebrafish Forebrain

Time-lapse Live avbildning av kloner som är närbesläktade neurala stamceller i utvecklingsländerna Zebrafish framhjärnan

Precise patterns of division, migration and differentiation of neural progenitor cells are crucial for proper brain development and function1,2. To ...

Neuromodulation and Mitochondrial Transport: Live Imaging in Hippocampal Neurons over Long Durations

Neuromodulering och mitokondriell Transport: Bildproduktion i hippocampus nervceller under långa löptider

To understand the relationship between mitochondrial transport and neuronal function, it is critical to observe mitochondrial behavior in live cultured ...

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-cell imaging av sensoriska celler orgel Precursor i intakt Drosophila Puppor

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

Lentivirus-mediated Genetic Manipulation and Visualization of Olfactory Sensory Neurons in vivo

Lentivirus-mediated Genetic Manipulation and Visualization of Olfactory Sensory Neurons in vivo

Lentivirus-medierad genetisk manipulation och visualisering av Olfactory sensoriska neuroner In vivo</em

Development of a precise olfactory circuit relies on accurate projection of olfactory sensory neuron (OSN) axons to their synaptic 
targets in the ...

Flash Photolysis of Caged Compounds in the Cilia of Olfactory Sensory  Neurons

Flash Fotolys av Caged föreningar i Cilia av Olfactory sensoriska neuroner

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds1. ...

Extracellularly Identifying Motor Neurons for a Muscle Motor Pool in Aplysia californica

Extracellularly Identifying Motor Neurons for a Muscle Motor Pool in Aplysia californica

Extracellulärt Identifiera motoriska nervceller för en muskel Motor Pool i<em&gt; Aplysia californica</em

In animals with large  identified neurons (e.g. mollusks), analysis of motor pools is done using  intracellular techniques1,2,3,4. Recently,  we developed ...

Isolation of Sensory Neurons of Aplysia californica for Patch Clamp Recordings of Glutamatergic Currents

Isolation of Sensory Neurons of Aplysia californica for Patch Clamp Recordings of Glutamatergic Currents

Isolering av sensoriska neuroner av<em&gt; Aplysia californica</em&gt; För Patch Clamp Inspelningar av glutamaterg Currents

The marine gastropod mollusk Aplysia californica has a venerable  history as a model of nervous system function, with particular significance in  studies ...

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Hela Mount immunomärkning av luktreceptor nervceller i<em&gt; Drosophila</em&gt; Antenn

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

A Method to Target and Isolate Airway-innervating Sensory Neurons in Mice

En metod att rikta och Isolera Airway-innerverar sensoriska neuroner hos möss

Somatosensory nerves transduce thermal, mechanical, chemical, and noxious stimuli caused by both endogenous and environmental agents. The cell bodies of ...