Name: use of a hanging weight system for coronary artery occlusion in mice
Uploaded: 2011-04-19T11:00:00
Duration: 8 min 30 s
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El presente estudio son apoyados por National Heart, Lung, and Blood Institute Grant R01-HL0921, R01-R01-DK083385 y HL098294 a HK Eltzschig, el 1K08HL102267-01 a T. Eckle, y la Fundación para la Educación Anestesia y becas de investigación de T. Eckle y HK Eltzschig, y la American Heart Association Grant T. Eckle y Eltzschig HK y Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) beca de investigación de M. Koeppen. Damos las gracias a Shelley Eltzschig de la obra de arte.

Observaciones generales: Todas las operaciones deberán realizarse bajo un microscopio de disección en posición vertical (Olympus, SZX10 con Post manivela del eje Z con soporte StandBoom STU2) y utilizando un coagulador quirúrgico. La ventilación es crítica para el procedimiento y por lo tanto, una cierta cantidad de tiempo debe ser dedicado a la elección del ventilador y la optimización de la técnica de ventilación. La temperatura, la presión arterial y la anestesia debe ser estable a lo largo. 1. Anestesia, intubación y monitoreo <ol><li> Use ratones C57BL / 6 que son al menos 10 semanas de edad. Inducir la anestesia con pentobarbital sódico a una dosis de 70 mg / kg peso corporal ip mantener la anestesia con aproximadamente 10 mg / kg / h de sodio pentobarbital. Tenga cuidado con la sobredosis ya que esto podría reducir significativamente la presión arterial. Volver a la dosis de pentobarbital - incluso después de horas-puede conducir a un aumento severo en los niveles plasmáticos. Sobre la base de pruebas sólidas en relación con el isoflurano compuesto cardioprotectora se recomienda el uso del &quot;inertes&quot; y así estableció el pentobarbital en un modelo de isquemia miocárdica 46-56. </li><li> Ratones a cabo sobre una mesa se calienta a temperatura controlada (RT, Effenberg, Munich, Alemania) con una sonda del termómetro rectal conectado a un controlador de retroalimentación térmica para mantener la temperatura corporal a 37 º C. </li><li> Después de los ratones inducción de la anestesia segura en posición supina, con las extremidades superiores e inferiores unido a la mesa con una cinta y una sutura sujeta a los tobillos. Haga lo mismo con la cabeza con los dientes. Una restricción suficiente es importante para una intubación exitosa y cirugía bien controlados. Antes de la cirugía, la cubierta del ratón con aceite mineral para reducir el riesgo de alergia del ratón de pelo. </li><li> Exponer la tráquea mediante cirugía y realizar una intubación traqueal mediante cánulas bluntpolyethylene (Insyte 22g, Beckton Dickinson, EE.UU.). Usted tendrá que mitigar la aguja para poder usarlo como un estilete. </li><li> Tirar de la lengua con un par de pinzas y presionar suavemente en un ángulo de 15 grados hacia el cuerpo. Incluso después de la exposición de la tráquea y el uso de un microscopio, lo que podría requerir algún tipo de formación. Tenga en cuenta que un pequeño daño de la tráquea podría conducir a la incapacidad para ventilar el animal a lo largo de la sutura. Por lo tanto, si tiene problemas de vías respiratorias comprobar la tráquea para agujeros pequeños. </li><li> Confirmar la colocación correcta del tubo mediante la visualización directa de la cánula en la tráquea anteriormente expuesto encima de la carina. </li><li> Conecte el tubo a un ventilador. Se recomienda una técnica de ventilación con presión controlada mediante el uso de un Servo 900 C de Siemens (DRE Veterinaria, EE.UU.). Animales será ventilado con presión inspiratoria máxima de 10 mbar, la frecuencia de 110 respiraciones / min y una presión espiratoria final positiva de 5.3 mbar con una FiO 2 = 0,4. Configuración puede ser que necesite algunos ajustes que se pueden lograr más fácilmente mediante la comprobación de los pulmones durante la cirugía de tórax abierto. Asegúrese de que los pulmones no se contraen o extendido. A pesar del hecho de que el Servo 900 C es construido como ventilador para los seres humanos, su uso en un entorno de presión del ventilador controlado excelentes trabajos para la ventilación de los ratones. </li><li> Realizar un análisis de gases en sangre para confirmar el intercambio de gases normales (presión parcial de oxígeno, la PaO 2 de 115 ± 15 mmHg y la presión parcial de dióxido de carbono, la PaCO 2 de 38 ± 6 mmHg) después de 4 a 6 horas de tiempo de ventilación con el i-STAT sistema (Abbott, EE.UU.). </li><li> Monitor de ritmo cardíaco con un electrocardiograma (por ejemplo, Hewlett Packard, Böblingen, Alemania). Asegúrese de que la frecuencia cardiaca no baja por debajo de 450. Si el ratón desarrolla bradicardia comprobar la temperatura y la dosis de anestesia / concentración. Xylacin / ketamina induce anestesia el corazón del corazón de 250 / min y por lo tanto no se recomienda. </li><li> Aplicar una adecuada reposición de líquidos. Una infusión de solución salina normal 0,1 ml / hora a través de un catéter arterial o venosa debe realizarse antes del inicio de la isquemia. Además, un bolo de solución salina de 500 l se podría dar ip antes de la cirugía. Thoractomy puede inducir una caída de la presión arterial y puede requerir bolos de solución salina adicional. Después de la isquemia, una velocidad de infusión de hasta 1 ml / hora podría ser necesario para mantener una presión arterial media por encima de 60 mmHg y para garantizar una reperfusión crítica suficiente para la tinción del infarto utilizando TTC. </li><li> Lugar de la arteria carótida (PE10, Consejo OD (mm / &quot;), rebajados&gt; 0.024 mm/.011&quot;) para el registro continuo de la presión arterial. La arteria carótida se expone a través de una disección roma de los músculos paratraqueales. Después de la exposición y evitar más cuidadosa de cualquier trauma tisular (en particular del nervio vago), se inserta un catéter en el vaso con dos puntos de sutura y una pequeña abrazadera. Fije el brazo al cuerpo antes de comenzar la disección de la arteria. Esto expondrá una pieza más de la arteria. Nudo al final de la parte proximal de la arteria carótida. Coloque una pinza más grande hasta el final de la suturaobtener la muestra. En otro lugar de sutura alrededor de la arteria y la disección de la arteria hasta el final distal. Aquí, el lugar una pequeña abrazadera. Use las tijeras micro a un pequeño corte diagonal en la arteria. Mantener la apertura con una pinza fina (Dumont, IPM) y el catéter de tamaño adecuado con las manos / pinzas. Hacer un nudo con su segunda sutura y seguro de la arteria. Afloje la abrazadera y el catéter más. Asegure el catéter con varios nudos y cinta adhesiva. </li></ol> 2. La técnica de oclusión de la arteria coronaria <ol><li> Disección de la piel y exponer la pared del tórax izquierdo utilizando una técnica de disección roma. </li><li> Corte de las aletas pectorales músculos mayores y menores para exponer la pared del tórax con un cauterio. Al tirar del pectoral mayor, el de pulmón disminuye, con lo que una pinza de la unidad electroquirúrgica se puede insertar, y, de 1-3 mm por encima del de pulmón, una línea horizontal cruzando la rompe debe ser coagulada. </li><li> Mediante el uso de una tijera embotada, corte la pared del tórax. Modificar los pernos de seguridad, donde se extrae la placa de captura y el extremo romo se inclinó, se utilizan para mantener el tórax abierto. </li><li> Para facilitar la colocación final de la sutura, coagular y cortar la pared del tórax a lo largo del diafragma hacia la parte inferior izquierda del tórax. </li><li> Exponer el corazón mediante la disección del pericardio. Para evitar los movimientos del diafragma quitar y cortar el nervio frénico. </li><li> Utilice un palillo de algodón humedecido con una pinza y volver el corazón hacia el lado derecho. Identificar la arteria coronaria izquierda (LCA) y asegúrese de que los pulmones no están demasiado inflados. Optimizar la apertura del tórax para tener un agarre seguro del corazón al colocar la sutura. Si la presión arterial es demasiado baja, la identificación podría ser complicado. Bolos adicionales de solución salina puede mejorar la identificación de la LCA. El LCA es un recipiente de color rojo brillante cruzar el centro horizontal (a diferencia de las venas regresan). A veces, el ACV es mejor ver sin un microscopio. No utilice demasiada luz. Esto puede llevar a romper reflexiones haciendo imposible la visualización. </li><li> Una vez que el LCA se identifica visualmente, coloque una sutura de nylon 8,0 (Prolene, Ethicon, Notiefies, EE.UU.), alrededor de la LCA. A los efectos de la oclusión intermitente LCA, hemos adoptado un modelo de crónica de miocardiopatía 42 mediante un sistema de peso que cuelga. </li><li> Hilo de la sutura a través de un pequeño trozo de tubo de plástico (PE-10 tubos) con bordes romos y adjuntar dos pequeñas pesas (1 g, por ejemplo, utilizar tubos Eppendorf lleno de agua) a cada extremo. Con los pesos que cuelgan libremente sobre una barra, el ACV debe ser inmediatamente obstruida. Además, cuando el peso se alivia, LCA oclusión se termina a la vez. El éxito de la oclusión del ACV deben ser confirmados por un cambio de color inmediata del buque de la luz roja de color violeta oscuro, el cambio de color del miocardio proporcionados por la nave (de color rojo brillante y blanco) y la presencia de elevación del ST en el ECG. Durante la reperfusión, los cambios de color al instante desaparecen. Mantener el corazón en húmedo con un 37 ° C, solución salina pieza empapado, de algodón absorbente, a través de (véase también la figura 1). </li><li> Elija su tiempo de isquemia, según su principal interés. De hecho, para los estudios de los efectos cardioprotectores de la IP, lo ideal sería utilizar un tiempo de isquemia asociada con un infarto en tamaños de 30 a 40% de la AAR. Por lo tanto, sería posible demostrar los cambios en ambas direcciones, por ejemplo, de menor tamaño del infarto cardíaco o con IP de mayor tamaño del infarto con una terapia experimental o una deleción del gen específico. Además, los ratones con el tamaño del infarto de menos de 50% suele sobrevivir el experimento, mientras que el tamaño del infarto de 60 a 80% son a menudo no sobrevivieron y los animales mueren antes de la hora de reperfusión se ha completado. Utilizando nuestro modelo de 10 minutos de isquemia miocárdica seguido de 2 horas de reperfusión en el resultado de un tamaño del infarto de 3,5 ± 1,3% de la AAR. Por el contrario, un tiempo de isquemia de 60 minutos los resultados en un tamaño del infarto media de 42 ± 5,2% de la AAR (p &lt;0,01) 39. Por lo tanto, consideramos que una de 60 minutos de isquemia como ideal para estudiar los cambios en ambas direcciones. Sin embargo, es posible que tengas que ajustar el tiempo de isquemia en los ratones de genes específicos con un fenotipo cortar. </li><li> Elija el tiempo de reperfusión derecha. El tiempo de reperfusión es de vital importancia para la tinción de TTC. El tinte incoloro se reduce a un precipitado de color rojo ladrillo de color por deshidrogenasas en la presencia de la coenzima NADH. Muerte de las células pierden su capacidad de retener el NADH y, por tanto, se delinean en áreas pálidas en el miocardio viable teñidas de rojo. Delimitación tamaño del infarto por TTC requiere que el NADH se ha lavado por completo de la zona necrótica. Sin embargo, si la reperfusión no es lo suficientemente largo, la delimitación del tamaño del infarto por tinción con TTC puede resultar en una subestimación del tamaño del infarto actual 43. En nuestras manos, después de un tiempo de isquemia de 60 minutos, la medición del tamaño del infarto aumentó de 11,5 ± 4,5% después de 30 minutos a 42,2 ± 5,1%después de 120 minutos. No hay aumento en el tamaño del infarto podría ser detectada con más tiempo de reperfusión (240 minutos) 39. Por lo tanto, se recomienda un período de 2 horas de reperfusión, que parece también razonable en el contexto de determination.If enzimas cardíacas se tiene en cuenta la isquemia pre-acondicionamiento, recomendamos 4 ciclos de IP (5 min de isquemia, 5 min de reperfusión), seguido por un tiempo de isquemia de 60 min y un tiempo de 2 horas de reperfusión. En estas condiciones, IP se asoció con una reducción de 3,2 veces del tamaño del infarto del 42,2 ± 5,1% a 13,3 ± 3,3% de la AAR 39. Sin embargo, debido al sistema de peso que cuelga, diferentes regimientos preacondicionamiento podría aplicarse fácilmente. </li></ol> 3. Determinación de la zona de riesgo (AAR) y el tamaño del infarto de miocardio Después de la inducción de un infarto de miocardio (con o sin IP), la zona es perfundida por la ACI (zona de riesgo, AAR) y el tamaño del infarto en sí se determinará mediante una técnica de tinción. Posteriormente, el infarto luego se calculará como porcentaje de infarto de miocardio en comparación con el AAR. Para ello, una técnica descrita anteriormente doble tinción con cloruro de azul y trifeniltetrazolio Evan (TTC) se utiliza 44. <ol><li> Determinar el AAR por inyección retrógrada de Evans colorante azul al 1% en la aorta, mientras que el LCA se ocluye. Por otra parte, si un catéter carótida en su lugar, utilizar esta ruta para Evans inyección azul. Azul de Evans se mancha todo azul tejido miocárdico, con excepción de la AAR. Es de suma importancia para este paso para evitar burbujas de aire dentro del catéter, ya que se inyecta en la circulación coronaria y prevenir las manchas azul de Evans. Antes de la tinción de azul de Evans es posible que desee tomar muestras de sangre para la medición de enzimas cardíacas. Además, la extracción de sangre mediante la inyección de 5 ml de solución salina a través de un catéter o la aorta carótida se recomienda. </li><li> Los impuestos especiales del corazón y de lavado en frío de hielo solución salina al 0,9% </li><li> Insertar en agarosa al 2%. No utilice calor de agarosa ya que esto evitar que se manchen con éxito. </li><li> Después de 30 minutos a 4 ° C (o 15 minutos -20 ° C), cortar el corazón en rodajas de 1 mm utilizando una matriz de corazón o de microtomo. Si usted pone el corazón en el congelador evitar la congelación en seco, que implicará el corazón manchado. </li><li> Incubar las rebanadas con un 1% TTC a 37 ° C durante 10 minutos usando una gorra azul de 15 ml en un baño de agua. Esto permitirá que el área infartada a delimitar como una zona blanca, mientras que las manchas de tejido viable rojo. </li><li> Fijar los cortes teñidos con un 10% fomol durante la noche. De esta manera, el área del infarto es mejor contraste para mejorar la calidad de las imágenes. </li><li> Determinar el área en riesgo (AAR) y el tamaño del infarto mediante planimetría con el NIH software Image 1.0 45. </li><li> Calcular el porcentaje de infarto de miocardio de la zona de riesgo. </li></ol> 4. La medición de enzimas cardíacas Debido a las limitaciones asociadas con la tinción de TTC se recomienda la lectura como adicional de la gravedad del infarto de miocardio a la determinación de la troponina I (cTnI) los niveles en el suero de los ratones. La sangre se extrae de la vena porta y los niveles séricos de cTnI se determinan con un ensayo cuantitativo rápido cTnI (Life Diagnostics, Inc., West Chester, PA, EE.UU.). 5. Los resultados representativos: <img src="/files/ftp_upload/2526/2526fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. (A) Modelo de IP cardíaco utilizando un sistema de suspensión-el peso de la oclusión coronaria. Esta técnica no requiere de un nudo de la oclusión coronaria. (B, C) instalación quirúrgica. (D) de la imagen de un corazón murino con la arteria coronaria izquierda (LCA, flechas) después de la oclusión. La identificación visual de la LCA es necesario para la ligadura y el precondicionamiento isquémico en los ratones. Una sutura de nylon 8,0 se coloca alrededor del LCA 1-2 mm por debajo de la aurícula izquierda. La sutura se pasa a través de un pequeño tubo de plástico (*). El final de cada sutura se conecta a un pequeño peso (1 g) y la sutura se coloca sobre las barras de ambos lados. (E) Determinación de la AAR después de LCA oclusión y la inyección retrógrada del colorante azul de Evans en la aorta. El RPA no se tiñe, mientras que el resto del miocardio es de color azul. Después de la incubación del tejido IAA con TTC, el área blanca manchada infarto, mientras que el rojo viable tejido teñido.

El presente estudio describe una nueva técnica de realización de IP en un modelo murino intacta mediante un sistema de suspensión de peso y así evitar oclusión de la arteria coronaria por un nudo. De hecho, este estudio demuestra tamaño del infarto altamente reproducible y protección cardíaca a través de IP, lo que reduce la variabilidad asociada con un nudo modelos basados ​​en la oclusión coronaria. Los investigadores que consideran que el estudio de la cardioprotección por IP en ratones se pueden beneficiar de este modelo.

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		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Sodium Pentobarbital (Fatal Plus)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Vortech Pharmaceutical Ls, Ltd</td>
<td>V.P.L. 9372</td>
<td>4mg/mL in saline</td>
</tr>
<tr>
<td>TTC</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>17779 Fluka</td>
<td>1.5 % in PBS</td>
</tr>
<tr>
<td>Evans Blue</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>E2129</td>
<td>10g in 1 L PBS</td>
</tr>
<tr>
<td>Insyte 22 G</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckton Dickinson</td>
<td>n/a</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Suture, silk 4.0</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Harvard Apparatus</td>
<td>517698</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Suture, Prolene 8.0</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ethicon, USA</td>
<td>M8739</td>
<td>reusable</td>
</tr>
<tr>
<td>Heart Matrix</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Zivic Instruments</td>
<td># HSMS001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Siemens 900 C</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>DRE Veterinary, USA</td>
<td># 336</td>
<td>refurbished</td>
</tr>
<tr>
<td>dissecting microscope (SZX10 )</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Olympus</td>
<td>n/a</td>
<td>consider generous working distance</td>
</tr>
<tr>
<td>Heating Table</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Rt, Effenberger, Germany</td>
<td>n/a</td>
<td>only and single provider</td>
</tr>
<tr>
<td>Blood pressure device</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cyber Sense, Inc</td>
<td>BPM02</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>I STAT</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Abbott</td>
<td>n/a</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

use of a hanging weight system for coronary artery occlusion in mice

Estudios murino de lesión aguda son un área de intensa investigación, como los ratones knockout de genes diferentes se están volviendo cada vez más disponibles 1-38. Cardioprotección por precondicionamiento isquémico (PI) sigue siendo un área de intensa investigación. Para aclarar aún más su base molecular, el uso de estudios con ratones knock-out es particularmente importante 7, 14, 30, 39. A pesar de que estudios anteriores ya han realizado con éxito la isquemia cardiaca y reperfusión en ratones, este modelo es técnicamente muy difícil. En particular, la identificación visual de la arteria coronaria, la colocación de la sutura alrededor del vaso y la oclusión coronaria ate el vaso con un nudo de apoyo es técnicamente difícil. Además, la reapertura del nudo de la reperfusión intermitente de la arteria coronaria durante el período de sin causar trauma quirúrgico añade desafío adicional. Por otra parte, si el nudo no está atado fuerte reperfusión suficiente, inadvertida debido a la oclusión de la coronaria imperfecta puede afectar los resultados. De hecho, esto puede ocurrir debido al movimiento de los latidos del corazón. Sobre la base de los problemas potenciales asociados con el uso de un sistema de nudos oclusión coronaria, hemos adoptado un modelo publicado previamente de miocardiopatía crónica sobre la base de un sistema de peso que cuelga de la oclusión intermitente la arteria coronaria durante el período de 39. De hecho, la oclusión de la arteria coronaria por lo tanto se puede lograr sin necesidad de ocluir la arteria coronaria por un nudo. Por otra parte, la reperfusión del vaso se puede conseguir fácilmente mediante el apoyo a los pesos colgantes que se encuentran en una localización remota de los tejidos cardíacos. Hemos probado este sistema de forma sistemática, incluida la variación de los tiempos de isquemia y reperfusión, los regimientos de preacondicionamiento, la temperatura del cuerpo y las bases genéticas 39. Además de la tinción de infarto, hemos probado la troponina I (cTnI) como un marcador de infarto de miocardio en este modelo. De hecho, los niveles plasmáticos de cTnI correlaciona con un tamaño de infarto (R2 = 0,8). Finalmente, se pudo mostrar en varios estudios que esta técnica produce tamaños infarto altamente reproducible durante el período de murino y el infarto de miocardio 6, 8, 30, 40, 41. Por lo tanto, esta técnica puede ser útil para los investigadores que persiguen los mecanismos moleculares involucrados en la cardioprotección por IP a través de una aproximación genética en ratones con deleción del gen objetivo. Otros estudios sobre IP cardíaca utilizando ratones transgénicos puede considerar esta técnica.

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Use of a Hanging Weight System for Coronary Artery Occlusion in Mice

Un modelo murino de isquemia miocárdica y el precondicionamiento isquémico es una herramienta importante para estudiar los mecanismos cardioprotectores<em&gt; In vivo</em&gt;. En este sentido, un informe de fácil aplicación<em&gt; In situ</em&gt; Modelo de IP cardíaco utilizando un sistema de suspensión de peso para la oclusión de la arteria coronaria.

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