Name: collecting variable-concentration isothermal titration calorimetry datasets in order to determine binding mechanisms
Uploaded: 2011-04-07T11:00:00
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Questo lavoro è stato sostenuto dal Canadian Institutes of Health Research (CIHR), National Science and Engineering Research Council (NSERC), e una formazione CIHR borsa di studio (di LF). Ringraziamo il Prof. Gerard D. Wright (McMaster University, Canada) per la CAA (6)-Ii plasmide di espressione.

1. Preparazione di soluzioni di riserva <ol><li> Purificare la macromolecola di interesse. (In questo caso, aminoglicosidi N-6&#39;-acetiltransferasi-Ii (AAC6&#39;-II), è isolato come riportato altrove. 13) </li><li> Preparare 4 litri di buffer di dialisi. (In questo caso abbiamo utilizzato 25 mm 4 - (2-idrossietil)-1-piperazineethanesulfonic acido (HEPES, MW 238,3 g / mol), contenente 2 mM acido etilendiamminotetraacetico (EDTA, 292,2 MW), a pH 7.5.) </li><li> Dializzare la proteina La (6 &#39;)-Ii AAC ca...

<ol>
	<li>Cliff, M. J., Ladbury, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+survey+of+the+year+2002+literature+on+applications+of+isothermal+titration+calorimetry.">A survey of the year 2002 literature on applications of isothermal titration calorimetry.</a> Journal of Molecular Recognition. 16, 383-391 (2003).</li><li>Cliff, M. J., Gutierrez, A., Ladbury, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+survey+of+the+year+2003+literature+on+applications+of+isothermal+titration+calorimetry.">A survey of the year 2003 literature on applications of isothermal titration calorimetry.</a> Journal of Molecular Recognition. 17, 513-523 (2004).</li><li>Ababou, A., Ladbury, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survey+of+the+year+2004:+literature+on+applications+of+isothermal+titration+calorimetry.">Survey of the year 2004: literature on applications of isothermal titration calorimetry.</a> Journal of Molecular Recognition. 19, 79-89 (2006).</li><li>Ababou, A., Ladbury, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survey+of+the+year+2005:+literature+on+applications+of+isothermal+titration+calorimetry.">Survey of the year 2005: literature on applications of isothermal titration calorimetry.</a> Journal of Molecular Recognition. 20, 4-14 (2007).</li><li>Okhrimenko, O. k. s. a. n. a., J, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+survey+of+the+year+2006+literature+on+applications+of+isothermal+titration+calorimetry.">A survey of the year 2006 literature on applications of isothermal titration calorimetry.</a> Journal of Molecular Recognition. 21, 1-19 (2008).</li><li>Bjelic, S., Jelesarov, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+survey+of+the+year+2007+literature+on+applications+of+isothermal+titration+calorimetry.">A survey of the year 2007 literature on applications of isothermal titration calorimetry.</a> Journal of Molecular Recognition. 21, 289-312 (2008).</li><li>Leavitt, S., Freire, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+measurement+of+protein+binding+energetics+by+isothermal+titration+calorimetry.">Direct measurement of protein binding energetics by isothermal titration calorimetry.</a> Current Opinion in Structural Biology. 11, 560-566 (2001).</li><li>Wiseman, T., Williston, S., Brandts, J. F., Lin, L. -. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+measurement+of+binding+constants+and+heats+of+binding+using+a+new+titration+calorimeter.">Rapid measurement of binding constants and heats of binding using a new titration calorimeter.</a> Analytical Biochemistry. 179, 131-137 (1989).</li><li>Capaldi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+X-Ray+Structure+of+Zebrafish+(Danio+rerio)+Ileal+Bile+Acid-Binding+Protein+Reveals+the+Presence+of+Binding+Sites+on+the+Surface+of+the+Protein+Molecule.">The X-Ray Structure of Zebrafish (Danio rerio) Ileal Bile Acid-Binding Protein Reveals the Presence of Binding Sites on the Surface of the Protein Molecule.</a> Journal of Molecular Biology. 385, 99-116 (2009).</li><li>Freiburger, L. A., Auclair, K., Mittermaier, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elucidating+Protein+Binding+Mechanisms+by+Variable-c+ITC.">Elucidating Protein Binding Mechanisms by Variable-c ITC.</a> ChemBioChem. 10, 2871-2873 (2009).</li><li>Wybenga-Groot, L. E., Draker, K. -. a., Wright, G. D., Berghuis, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+an+aminoglycoside+6'-N-acetyltransferase:+defining+the+GCN5-related+N-acetyltransferase+superfamily+fold.">Crystal structure of an aminoglycoside 6'-N-acetyltransferase: defining the GCN5-related N-acetyltransferase superfamily fold.</a> Structure. 7, 497-507 (1999).</li><li>Draker, K., Northrop, D. B., Wright, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+Mechanism+of+the+GCN5-Related+Chromosomal+Aminoglycoside+Acetyltransferase+AAC(6')-Ii+from+Enterococcus+faecium:+Evidence+of+Dimer+Subunit+Cooperativity.">Kinetic Mechanism of the GCN5-Related Chromosomal Aminoglycoside Acetyltransferase AAC(6')-Ii from Enterococcus faecium: Evidence of Dimer Subunit Cooperativity.</a> Biochemistry. 42, 6565-6574 (2003).</li><li>Wright, G. D., Ladak, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+and+characterization+of+the+chromosomal+aminoglycoside+6'-N-acetyltransferase+from+Enterococcus+faecium.">Overexpression and characterization of the chromosomal aminoglycoside 6'-N-acetyltransferase from Enterococcus faecium.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 41, 956-960 (1997).</li><li>MicroCal. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> ITC Data Analysis in Origin. , (2004).</li></ol>

Questa porzione analitica di variabile-c raccordo è stato precedentemente descritto in dettaglio 10. Qui riportiamo gli aspetti pratici della raccolta di set di dati idonei per questo approccio variabile-c. E &#39;essenziale che tutte le proteine ​​e campioni ligando sono tratti dalle soluzioni stesso ceppo. Perciò è importante che la soluzione scorte sufficienti è preparato inizialmente per completare l&#39;intera serie di esperimenti. In questo modo il rapporto tra AAC (6 &#39;)-Ii e ACCOA è costan...

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Acetyl coenzyme A (AcCoA)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>A2056</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>7365-45-9</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>431788</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Spectra/Por 2 Dialysis Tubing</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Spectrum Labs</td>
<td>132678</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sterile Syringe Filter (0.2 &mu;m)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>281445-477</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cellulos Nitrate Membrane Filters (0.45 &mu;m)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Whatman</td>
<td>7184-004</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>VP-ITC</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MicroCal</td>
<td>VP-ITC</td>
<td>Microcalorimeter used for measurements</td>
</tr>
<tr>
<td>ThermoVac</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MicroCal</td>
<td>USB Thermo Vac</td>
<td>Temperature Controlled Degassing Station</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

collecting variable-concentration isothermal titration calorimetry datasets in order to determine binding mechanisms

Calorimetria isotermica di titolazione (ITC) è comunemente usato per determinare i parametri termodinamici associati al legame di un ligando ad una macromolecola host. ITC ha alcuni vantaggi rispetto ai comuni approcci spettroscopiche per lo studio di host / ligando interazioni. Per esempio, il calore prodotto o assorbito quando le due componenti interagiscono viene misurata direttamente e non richiede alcuna giornalisti esogeni. Così l&#39;entalpia vincolante e la costante di associazione (Ka) sono direttamente ottenute dai dati ITC, e può essere utilizzato per calcolare il contributo entropico. Inoltre, la forma della isoterma dipende dal c-valore e il modello meccanicistico coinvolti. Il c-valore è definito come c = n [P] PTG, dove [P] t è la concentrazione di proteine, e n è il numero di siti di legame all&#39;interno dell&#39;ospite. In molti casi, diversi siti di legame per un ligando dato non sono equivalenti e ITC permette la caratterizzazione dei parametri termodinamici vincolanti per ogni singolo sito vincolanti. Ciò richiede tuttavia che il modello corretto vincolante essere utilizzato. Questa scelta può essere problematico se diversi modelli può andare bene gli stessi dati sperimentali. Abbiamo già dimostrato che questo problema può essere aggirato effettuando esperimenti in diverse c-valori. Le isoterme più disponibili presso diversi c-i valori sono idonei contemporaneamente modelli separati. Il modello corretto è vicino identificato sulla base della bontà di adattamento su tutta la variabile-c dataset. Questo processo viene applicato qui per la aminoglicosidi resistenza che causano aminoglicosidi enzima N-6&#39;-acetiltransferasi-Ii (AAC (6 &#39;)-II). Anche se la nostra metodologia è applicabile a qualsiasi sistema, la necessità di questa strategia è meglio dimostrato con una macromolecola-ligando sistema che mostra allostery o cooperatività e, quando diversi modelli vincolanti fornire adatta sostanzialmente identica agli stessi dati. A nostra conoscenza, non esistono sistemi di questo tipo disponibile in commercio. AAC (6 &#39;)-II, è un homo-dimero contenente due siti attivi, che mostra cooperatività tra le due subunità. Tuttavia i dati ITC ottenuti ad un singolo c-valore può essere adatta altrettanto bene ad almeno due diversi modelli un modello a due-set-di-siti indipendenti e due siti sequenziale (cooperativa) modello. Attraverso variando il valore C come spiegato sopra, è stato stabilito che il modello corretto vincolante per AAC (6 &#39;)-II è un due siti modello sequenziale vincolanti. Qui, descriviamo i passi che devono essere presi durante l&#39;esecuzione di esperimenti ITC al fine di ottenere set di dati idonei per la variabile-c analisi.

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Collecting Variable-concentration Isothermal Titration Calorimetry Datasets in Order to Determine Binding Mechanisms

ITC è un potente strumento per studiare il legame di un ligando al suo ospite. Nei sistemi complessi tuttavia, alcuni modelli può montare il dati ugualmente bene. Il metodo qui descritto fornisce un mezzo per chiarire il modello appropriato vincolante per i sistemi complessi ed estrarre i parametri termodinamici corrispondenti.

Raccolta variabile concentrazione dataset Calorimetria isotermica di titolazione per determinare meccanismi vincolanti

Isothermal titration calorimetry (ITC) is commonly used to determine the thermodynamic parameters associated with the binding of a ligand to a host ...

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