Name: genotypic inference of hiv-1 tropism using population-based sequencing of v3
Uploaded: 2010-12-27T18:00:00
Duration: 11 min 10 s
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Le développement de ce test a été soutenue par ViiV Healthcare et les Instituts canadiens de recherche en santé du Canada (IRSC) et par le biais d&#39;une chaire de GlaxoSmithKline / IRSC sur la virologie clinique pour le Dr Harrigan. Le soutien fourni par Pfizer et ViiV Healthcare.

<ol>
	<li>Feng, Y., Broder, C. C., Kennedy, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+entry+cofactor:+functional+cDNA+cloning+of+a+seven+transmembrane,+G+protein-coupled+receptor.">HIV-1 entry cofactor: functional cDNA cloning of a seven transmembrane, G protein-coupled receptor.</a> Science. 272, 872-877 (1996).</li><li>Dragic, T., Litwin, V., Allaway, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+entry+into+CD4++cells+is+mediated+by+the+chemokine+receptor+CC-CKR-5.">HIV-1 entry into CD4+ cells is mediated by the chemokine receptor CC-CKR-5.</a> Nature. 381, 667-673 (1996).</li><li>Dorr, P., Westby, M., Dobbs, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maraviroc+(UK-427,857),+a+potent,+orally+bioavailable,+and+selective+small-molecule+inhibitor+of+chemokine+receptor+CCR5+with+broad-spectrum+anti-human+immunodeficiency+virus+type+1+activity.">Maraviroc (UK-427,857), a potent, orally bioavailable, and selective small-molecule inhibitor of chemokine receptor CCR5 with broad-spectrum anti-human immunodeficiency virus type 1 activity.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 49, 4721-4732 (2005).</li><li>Gulick, R. M., Lalezari, J., Goodrich, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maraviroc+for+previously+treated+patients+with+R5+HIV-1+infection.">Maraviroc for previously treated patients with R5 HIV-1 infection.</a> N. Engl. J. Med. 359, 1429-1441 (2008).</li><li>Cooper, D. A., Heera, J., Goodrich, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maraviroc+versus+efavirenz,+both+in+combination+with+zidovudine/lamivudine,+for+the+treatment+of+antiretroviral-na&#237;ve+subjects+with+CCR5-tropic+HIV-1.">Maraviroc versus efavirenz, both in combination with zidovudine/lamivudine, for the treatment of antiretroviral-na&#237;ve subjects with CCR5-tropic HIV-1.</a> J. Infect. Dis. 201, 803-813 (2010).</li><li>Low, A. J., McGovern, R. A., Harrigan, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trofile+HIV+co-receptor+usage+assay.">Trofile HIV co-receptor usage assay.</a> Expert Opin. Med. Diagnostics. 3, 181-191 (2000).</li><li>Sing, T., Low, A. J., Beerenwinkel, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predicting+HIV+co-receptor+usage+based+on+genetic+and+clinical+covariates.">Predicting HIV co-receptor usage based on genetic and clinical covariates.</a> Antiviral Ther. 12, 1097-1106 (2007).</li><li>Harrigan, P. R., McGovern, R., Dong, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+for+HIV+tropism+using+population-based+V3+genotypic+analysis:+a+retrospective+virological+outcome+analysis+using+stored+plasma+screening+samples+from+MOTIVATE-1.">Screening for HIV tropism using population-based V3 genotypic analysis: a retrospective virological outcome analysis using stored plasma screening samples from MOTIVATE-1.</a> , (2009).</li><li>Harrigan, P. R., McGovern, R., Dong, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+clinically+relevant+cut-points+for+the+determination+of+HIV+co-receptor+usage+to+predict+maraviroc+responses+in+treatment+experienced+(TE)+patients+using+population+V3+genotyping.">Optimization of clinically relevant cut-points for the determination of HIV co-receptor usage to predict maraviroc responses in treatment experienced (TE) patients using population V3 genotyping.</a> , (2009).</li><li>Swenson, L. C., McGovern, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+clinically+relevant+cutoffs+for+determining+HIV+co-receptor+use+by+population+and+"deep"+sequencing+methods.">Optimization of clinically relevant cutoffs for determining HIV co-receptor use by population and "deep" sequencing methods.</a> , (2009).</li><li>Swenson, L., McGovern, R., Dong, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+screening+for+HIV+tropism+versus+both+population-based+and+"deep"+sequencing.">Phenotypic screening for HIV tropism versus both population-based and "deep" sequencing.</a> , (2009).</li><li>Swenson, L. C., Moores, A., Low, A. J., Thielen, A., Dong, W., Woods, C., Jensen, M. A., Wynhoven, B., Chan, D., Glascock, C., Harrigan, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+Detection+of+CXCR4-Using+HIV+by+V3+Genotyping:+Application+of+Population-based+and+'Deep'+Sequencing+to+Plasma+RNA+and+Proviral+DNA.">Improved Detection of CXCR4-Using HIV by V3 Genotyping: Application of Population-based and 'Deep' Sequencing to Plasma RNA and Proviral DNA.</a> Journal of Acquired Immune Deficiency Syndromes. 54, 506-510 (2010).</li><li>Swenson, L. C., Boehme, R., Thielen, A., McGovern, R. A., Harrigan, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genotypic+determination+of+HIV-1+tropism+in+the+clinical+setting.">Genotypic determination of HIV-1 tropism in the clinical setting.</a> HIV Therapy. 4, 293-303 (2010).</li></ol>

P. Richard Harrigan a des conflits d&#39;intérêt avec ViiV Healthcare, Virco, Merck, Abbott, et Quest. Cette vidéo-article est sponsorisé par ViiV Healthcare.

La méthode présentée ici est une méthode de séquençage norme appliquée à des tests de tropisme. L&#39;application clinique de la boucle V3 du VIH enveloppe séquençage de prédire tropisme viral a été limitée jusqu&#39;à la fin. Cette méthode a été montré, dans des analyses rétrospectives de l&#39;maraviroc (ViiV Healthcare) les essais cliniques, pour être au minimum égale mesure de prédire le tropisme viral en comparaison à d&#39;autres essais validés utilisés en clinique. Il ya plusieurs avantages à effectuer une analyse génotypique de la boucle V3 pour la prédiction de tropisme. Tout d&#39;abord, cette procédure peut être effectuée à toute installation d&#39;équipements opérationnels séquençage, augmentant considérablement l&#39;accessibilité et de réduire les délais d&#39;exécution des tests de tropisme. En comparaison, le dosage phénotypique Enhanced Trofile Sensibilité (ESTA) (Monogram Biosciences), qui a servi comme l&#39;étalon-or pour le test de tropisme, est effectué à un centre en Californie du Sud. Les autres avantages incluent l&#39;exigence d&#39;une matière première moins et une charge virale plasmatique minimale requise des 500copies/mL. En outre, les coûts opérationnels de fonctionnement de l&#39;analyse génotypique sont relativement faibles en comparaison à celles d&#39;un test phénotypique. L&#39;utilisation du logiciel souviens en particulier d&#39;éliminer l&#39;exigence d&#39;examen séquence manuelle, ce qui tend à être une partie du travail intensif des analyses génotype. La méthode présentée ici est assez simple, sans aucune étape particulière emportant une autre importance. Nous ne vous suggérons de lancer PCR et séquençage en trois exemplaires à augmenter les chances de capturer des espèces minoritaires au sein de la population virale d&#39;un échantillon. Réplique de plus de trois peut être effectuée, cependant nous avons trouvé trois exemplaires à la fois efficace et fiable. Nous suggérons également d&#39;utiliser le One-Step Reverse Transcriptase PCR Kit (Qiagen) qui effectue à la fois par RT-PCR et PCR au premier tour dans la même réaction tout en conservant une sensibilité et une spécificité élevées.

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>RNA extraction using NucliSens easyMAG version 1.0</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>NucliSens easyMAG Magnetic Silica</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>bioMerieux</td>
<td>cat. # 280133</td>
<td>(48 x 0.6 ml)</td>
</tr>
<tr>
<td>NucliSens easyMAG Lysis Buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>bioMerieux</td>
<td>cat. # 280134</td>
<td>(4 x 1000 ml)</td>
</tr>
<tr>
<td>NucliSens easyMAG Extraction Buffer 1</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>bioMerieux</td>
<td>cat. # 280130</td>
<td>(4 x 1000 ml)</td>
</tr>
<tr>
<td>NucliSens easyMAG Extraction Buffer 2</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>bioMerieux</td>
<td>cat. # 280131</td>
<td>(4 x 1000 ml)</td>
</tr>
<tr>
<td>NucliSens easyMAG Extraction Buffer 3</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>bioMerieux</td>
<td>cat. # 280132</td>
<td>(4 x 1000 ml)</td>
</tr>
<tr>
<td>NucliSens easyMAG version 1.0 </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>bioMerieux</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Class II A2 biological safety cabinet</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>One-Step Reverse Transcriptase PCR and Second Round PCR</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DEPC-treated water</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ambion Corp.</td>
<td>cat. # 9922</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>SuperScrip III One-Step RT-PCR System with Platinum Taq High Fidelty</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>cat#12574-035</td>
<td>Kit components used: 
- SuperScript III RT/ Platinum Taq High Fidelty Enzyme Mix 
- 2X Reaction Mix (a buffer containing 0.4mM of each dNTP, 2.4mM MgSO4)</td>
</tr>
<tr>
<td>Expand High Fidelity PCR System</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche Diagnostics</td>
<td>cat. # 1 759 078</td>
<td>Kit components used: 
- Expand High Fidelity Buffer 10X conc. with 15 mM MgCl2 (lids labelled 2) 
- Expand HF PCR Enzyme Mix (3.5U/&mu;l) 
- MgCl2 Stock Solution (25mM) (lids labelled 4)</td>
</tr>
<tr>
<td>dNTPs: dATP, dGTP, dCTP, dTTP</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche Diagnostics</td>
<td>cat. # 11969064001</td>
<td>(100 mM)</td>
</tr>
<tr>
<td>Sucrose</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>cat. # S0389-500G</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Bromophenol blue sodium salt</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>cat.# B5525</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cresol Red</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>cat.# 114472-5G</td>
<td>indicator grade</td>
</tr>
<tr>
<td>Thermocycler </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Gel Electrophoresis</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>50X TAE buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>cat. # 24710030</td>
<td>(1000 ml) </td>
</tr>
<tr>
<td>SYBR Safe DNA gel stain</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen Life Technologies</td>
<td>cat. # S33102</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Agarose (ultra pure)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>cat. # 15510-027</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>E-Gel Low Range Quantitative DNA Ladder</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen Life Technologies</td>
<td>cat. # 12373-031</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Reagent Grade Type II water</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Gel apparatus</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sequencing</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>ABI PRISM BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Applied Biosciences</td>
<td>cat. # 4337458</td>
<td>(25000 reactions)</td>
</tr>
<tr>
<td>Hi-Di Formamide</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Applied Biosciences</td>
<td>cat. # 4311320</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium Acetate (NaOAc)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>cat. # S-2889</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>EDTA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>Cat.# 03690-100ML</td>
<td>0.5M, pH=8.0</td>
</tr>
<tr>
<td>TRIZMA Hydrochloride Buffer Solution</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>cat. # T-2819</td>
<td>1 M, pH 9.0</td>
</tr>
<tr>
<td>Magnesium Chloride (MgCl2)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>cat. # M-1028</td>
<td>1 M</td>
</tr>
<tr>
<td>95% Ethanol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Running Buffer (10X) with EDTA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Applied Biosystems</td>
<td>cat. # 4335613</td>
<td>500 mL</td>
</tr>
<tr>
<td>Polymer Pop-7 (25mL) Or Polymer Pop-7 (10mL)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Applied Biosystems</td>
<td>cat. # 44363929 or cat. # 4352759</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>3700/3730 BigDye Terminator v3.1 Sequencing Standard Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Applied Biosciences</td>
<td>Cat# 4336943</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Thermocycler </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Centrifuge with plate holders</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>3730xl DNA Analyzer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Applied Biosciences</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

genotypic inference of hiv-1 tropism using population-based sequencing of v3

Contexte: Avant de recevoir un médicament à partir du CCR5 antagoniste classe dans le traitement du VIH, le patient doit subir un test de tropisme du VIH pour confirmer que la population de son virale utilise le corécepteur CCR5 pour entrer cellulaire, et non pas un corécepteur alternatif. Une approche de test de tropisme est d&#39;examiner la séquence de la région V3 de l&#39;enveloppe du VIH, qui interagit avec le corécepteur. Méthodes: ARN viral est extrait du plasma sanguin. La région V3 est amplifié en triple avec imbriquées de la transcriptase inverse-PCR. Les amplifications sont ensuite séquencé et analysé en utilisant le logiciel, RE_Call. Les séquences sont ensuite soumises à un algorithme de bioinformatiques tels que geno2pheno d&#39;inférer tropisme viral à partir de la région V3. Les séquences sont présumées être non-R5 si leur geno2pheno taux de faux positifs est inférieur à 5,75%. Si l&#39;un des trois séquences à partir d&#39;un échantillon est déduite d&#39;être non-R5, le patient est peu probable pour répondre à une CCR5 antagoniste.

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Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

VIH tropisme peut être déduite de la région V3 de l&#39;enveloppe virale. V3 est amplifié par PCR en triple en utilisant RT-PCR nichée, séquencé, et interprétées en utilisant un logiciel de bioinformatique. Les échantillons ayant des séquences 1 ou plusieurs (s) avec des scores faibles G2P sont classés comme non-virus R5.

Inférence génotypique de tropisme du VIH-1 en utilisant la population basée séquençage du V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Assessment of Immunologically Relevant Dynamic Tertiary Structural Features of the HIV-1 V3 Loop Crown R2 Sequence by ab initio Folding

Assessment of Immunologically Relevant Dynamic Tertiary Structural Features of the HIV-1 V3 Loop Crown R2 Sequence by ab initio Folding

Évaluation des immunologiquement pertinents dynamiques tertiaires Caractéristiques structurelles de l&#39;épidémie de VIH-1 séquence de la boucle V3 de la Couronne par R2<em&gt; Ab initio</em&gt; Pliante

The antigenic diversity of HIV-1 has long been an obstacle to vaccine design, and this variability is especially pronounced in the V3 loop of the virus' ...

Recherche

Immunologie et infection

Specific Marking of HIV-1 Positive Cells using a Rev-dependent Lentiviral Vector Expressing the Green Fluorescent Protein

Marquage spécifique du VIH-1 des cellules positives à l&#39;aide d&#39;un vecteur Rev-dépendante lentiviraux exprimant la protéine fluorescente verte

Most of HIV-responsive expression vectors are based on the HIV promoter, the long terminal repeat (LTR). While responsive to an early HIV protein, Tat, ...

Prediction of HIV-1 Coreceptor Usage (Tropism) by Sequence Analysis using a Genotypic Approach

Prediction of HIV-1 Coreceptor Usage Tropism by Sequence Analysis using a Genotypic Approach

Prédiction du VIH-1 Utilisation corécepteur (tropisme) par analyse de séquence en utilisant une approche génotypique

Maraviroc (MVC) is the first licensed antiretroviral drug from the class of coreceptor antagonists. It binds to the host coreceptor CCR5, which is used by ...

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

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En décapsidation in vitro du VIH-1 Cores

The genome of the retroviruses is encased in a capsid surrounded by a lipid envelope. For lentiviruses, such as HIV-1, the conical capsid shell is ...

New Tools to Expand Regulatory T Cells from HIV-1-infected Individuals

De nouveaux outils pour multiplier des cellules T régulatrices de personnes VIH-1-infected

CD4+ Regulatory T cells (Tregs) are potent immune modulators and serve an important function in human immune homeostasis. Depletion of Tregs has led to ...

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

L&#39;évaluation de l&#39;Innate détection du VIH-1 CD4 infectés<sup&gt; +</sup&gt; Cellules T par les cellules dendritiques plasmacytoïdes Utilisation d&#39;un<em&gt; Ex vivo</em&gt; Système de co-culture.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the ...

Conformational Evaluation of HIV-1 Trimeric Envelope Glycoproteins Using a Cell-based ELISA Assay

Évaluation de conformation du VIH-1 trimère glycoprotéines d&#39;enveloppe l&#39;aide d&#39;un base de cellules test ELISA

HIV-1 envelope glycoproteins (Env) mediate viral entry into target cells and are essential to the infectious cycle. Understanding how those glycoproteins ...

Isolation of Exosomes from the Plasma of HIV-1 Positive Individuals

Isolement des exosomes dans le plasma du VIH-1 individus positifs

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Visualization of HIV-1 Gag Binding to Giant Unilamellar Vesicle (GUV) Membranes

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Visualisation du VIH-1 Gag Reliure Giant unilamellaires vésiculaires (GUV) Membranes

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