Name: using whole mount in situ hybridization to link molecular and organismal biology
Uploaded: 2011-03-31T11:00:00
Duration: 12 min 50 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using Whole Mount in situ Hybridization to Link Molecular and Organismal Biology at JoVE.com

Författarna vill tacka för institutionen för biologi vid Syracuse University och Dr Marilyn Kerr för deras roller i förvaltningen av jämförande vertebratzoologi Biologi kurs. Den Albertson labbet stöds av bidrag R21DE019223 från National Institutes of Health / National Institute of Dental och Craniofacial forskning, samt ge R01AG031922 från National Institutes of Health / National Institute on Aging.

1. Plasmid Omvandling av Target cDNA Del I: Omvandling av Plasmid (Tidsåtgång: 3 timmar plus natten inkubation) <ol><li> Varm SOC näringsämne buljong i en 42 ° C vattenbad (500 mikroliter per reaktion) </li><li> Tina behöriga celler på is </li><li> Tillsätt 1 mikroliter plasmid till 25 mikroliter behöriga celler </li><li> Placera på isen i 20 minuter </li><li> Heat shock celler i 42 ° C vattenbad i 45 sekunder </li><li> Placera omedelbart celler på is i 2 minuter </li><li> Tillsätt 500 mikroliter 42 ° C näringsämnen buljong till varje injektionsflaska av celler </li><li> Skaka vid 37 ° C under 2 timmar vid 255 varv per minut (rpm) </li><li> Plate 75 mikroliter omvandling mix på Luria Bertani (LB) agarplattor </li><li> Inkubera plattorna vändas vid 37 ° C över natten </li></ol> Del II: E. coli Kultur (Tidsåtgång: 15 minuter plus natten inkubation) <ol><li> För varje reaktion, alikvot 3 ml LB buljong och 3 mikroliter av 50 mg / ml ampicillin in i en kultur tub </li><li> Skrapa 1 bakterier koloni från agarplatta och lägger till varje kultur rör </li><li> Skaka kultur rören vid 37 ° C vid 255 rpm natten </li></ol> Del III: Plasmid Prep (Tidsåtgång: 1,5 timmar) <ol><li> Isolera plasmid från natten kulturer med 5 Prime FastPlasmid Mini Kit (Catalog # 2.300.000) </li><li> För att kontrollera förekomsten av beredd plasmiden, kör DNA elueras från kit från 1% tris-acetat-EDTA (TAE) gel färgad med etidiumbromid </li></ol> 2. In Situ DIG-märkt RNA sond Syntes Del I: Linjärisering av Plasmid (Tidsåtgång: 2,5 timmar) <ol><li> I en 1,5 ml mikrofugrör, kombinera: <table border="1"><tbody><tr><td> Förberedd Plasmid </td><td> 20 ml </td></tr><tr><td> Restriktionsenzymanalys * </td><td> 2 ml </td></tr><tr><td> Buffert ** </td><td> 10 ml </td></tr><tr><td> 10X bovint serumalbumin (BSA) </td><td> 10 ml </td></tr><tr><td> Diethyl Pyrocarbonate (DEPC) Vatten </td><td> 58 ml </td></tr><tr><td></td><td> 100 ml </td></tr></tbody></table></li><li> Inkubera vid 37 ° C i 2 timmar * Varierar med plasmid ** Varierar med restriktionsenzym </li></ol> Del II: Transkription (Tidsåtgång: 3 timmar) <ol><li> I en 1,5 ml mikrofugrör, kombinera: <table border="1"><tbody><tr><td> Linjär Plasmid </td><td> 4 mL </td></tr><tr><td> 10X Transkription buffert ** </td><td> 4 mL </td></tr><tr><td> Digoxigenin Label Mix </td><td> 4 mL </td></tr><tr><td> Polymeras * </td><td> 2 ml </td></tr><tr><td> RNas Inhibitor </td><td> 2 ml </td></tr><tr><td> DEPC Vatten </td><td> 24 ml </td></tr><tr><td></td><td> 40 ml </td></tr></tbody></table></li><li> Inkubera vid 37 ° C under 1 timme </li><li> Tillsätt 2 mikroliter av polymeras * </li><li> Inkubera vid 37 ° C under 1 timme </li><li> Tillsätt 2 mikroliter av DNase </li><li> Inkubera vid 37 ° C i 20 minuter * Varierar med plasmid ** Varierar med polymeras </li></ol> Del III: Nederbörd (Tidsåtgång: 5 minuter plus 2 timme natten inkubation, 1 timme till centrifug och återsuspendera) <ol><li> Tillsätt 4 mikroliter av 0,2 EDTA </li><li> Tillsätt 5 mikroliter av 4M litiumklorid </li><li> Tillsätt 150 mikroliter av iskall 100% etanol </li><li> Inkubera vid -80 ° C i 2 timmar eller över natten </li><li> Centrifugera vid 14.000 rpm i 30 minuter vid 4 ° C, dekantera bort supernatanten </li><li> Torr pellets i 7 minuter </li><li> Återsuspendera i 20 mikroliter DEPC vatten </li><li> Inkubera vid 37 ° C i 5 minuter </li></ol> Del IV: Fraktionering - Utför endast om givaren storlek är större än 0,6 kB (Tidsåtgång varierar beroende på givare storlek, vanligen inte mer än 20 minuter) <ol><li> I en 1,5 ml mikrofugrör, kombinera: <table border="1"><tbody><tr><td> RNA-Probe </td><td> 20 ml </td></tr><tr><td> DEPC Vatten </td><td> 12 ml </td></tr><tr><td> Natriumbikarbonat </td><td> 4 mL </td></tr><tr><td> Natriumkarbonat </td><td> 4 mL </td></tr><tr><td></td><td> 40 ml </td></tr></tbody></table></li><li> Inkubera i 60 ° C vattenbad. Basera inkubationstiden på följande ekvation: Tid (min) = (start kB - önskad kb) / (0,11 x start kb x önskad kb) Genomsnittlig önskad storlek = 0,6 kb </li></ol> Del V: Final Nederbörd (Tid: 5 minnuter plus 2 timme natten inkubation, 1 timme till centrifug och återsuspendera, 1 timme för gelelektrofores) <ol><li> Tillsätt 40 mikroliter DEPC vatten </li><li> Lägg 8 mikroliter Natriumacetat </li><li> Tillsätt 1,04 mikroliter koncentrerad ättiksyra </li><li> Tillsätt 240 mikroliter iskall 100% etanol </li><li> Inkubera vid -80 ° C i 2 timmar eller över natten </li><li> Centrifugera vid 14.000 rpm i 30 minuter vid 4 ° C, dekantera bort supernatanten </li><li> Torr pellets i 7 minuter </li><li> Återsuspendera i 20 mikroliter DEPC vatten </li><li> Vortex att blanda </li><li> För att kontrollera förekomsten av riboprobe kör resuspenderas lösning på ett 1% TAE gel färgad med etidiumbromid </li></ol> 3. Hela Mount In Situ Hybridization Del I: Fixering av embryon och proteinas K Digestion (Tidsåtgång Fix övernattning plus 4 timmar nästa dag för lagring, 2,5 timmar från lager till del II) <ol><li> Samla iscensatt zebrafisk embryon och fixa i 4% paraformaldehyd (PFA) över natten vid 4 ° C </li><li> Tvätta fast embryon i fosfatbuffrad saltlösning som innehåller 0,1% Tween-20 (PBST) 3 gånger 10 minuter varje </li><li> För att säkerställa exponering av embryon till det experimentella reagenser, manuellt dechorionate embryon (om nödvändigt) med spetsig pincett </li><li> Torka embryon genom att tvätta i en graderad serie av 25% och 50% metanol i PBST en timme varje tvätt och förvara i 100% metanol vid -20 ° C </li><li> När de är färdiga att använda, rehydrera embryon PBST genom att tvätta i 50% (2 gånger) och 25% (1 tid) metanol i PBST i 10 minuter vardera. Slutligen tvättas 2 gånger under 10 minuter vardera i 100% PBST. Exakt tidpunkt är inte viktigt för PBST / metanol tvättar </li><li> Bleach embryon i en 10% väteperoxid lösning i PBST, om nödvändigt, att ta bort mörka pigment. Embryon bör inkubera i väteperoxidlösning i 10-20 minuter, beroende på ålder av embryot, och locket på mikrofugrör bör förbli öppna för att förhindra ansamling av lufttryck </li><li> Digest embryon med 50 mg / ml proteinas K utspädd 1:5000 i PBST i 3-15 minuter, beroende på ålder av embryot </li><li> Re-fix embryon i 4% PFA i 30 minuter, och sedan tvätta 3 gånger i PBST i 5 minuter varje </li></ol> Del II: Hybridisering av Riboprobes (Tidsåtgång: 3 timmar plus över natten för hybridisering, 1,5 timmar nästa dag till del III) <ol start="9"><li> Prehybridize embryon med prehybridization lösning (PHS) i en förvärmd 70 ° C vattenbad i 2-3 timmar </li><li> Ta bort PHS, tillsätt 0,5 ml hybridisering och 1,5 mikroliter tidigare syntetiserat Digoxigenin märkt riboprobes, inkubera vid 70 ° C över natten. Temperaturen kan variera inom ett par grader beroende på riboprobe målet </li><li> Nästa dag, tvätta embryon vid 70 ° C i graderade lösningar av 75%, 50% och 25% PHS i 2X saltlösning-natriumcitrat (SSC) i 10 minuter vardera, tvätta sedan i 0,2 X SSC i 30 minuter vid 68 ° C </li><li> Tvätta i maleinsyra Buffer (MAB) 2 gånger 10 minuter vardera vid rumstemperatur </li></ol> Del III: Anti-Digoxigenin (α-DIG) Antikropp Inkubation (Tidsåtgång: 3 timmar plus över natten för att blockera, 2,5 timmar nästa dag för att del IV) <ol start="13"><li> Överför embryon till en 12 brunnar </li><li> Pre-block embryon i 1-2 ml blockerande lösningen i minst 3 timmar i rumstemperatur </li><li> Samtidigt pre-block antikroppen genom att förbereda en andra volym av blockerande lösningen och späda anti-digoxigenin antikroppar 1:2000 i denna lösning </li><li> Ta bort pre-blocket och lägger till 1-2 ml i förväg blockerade α-DIG lösning, inkubera över natten vid 4 ° C </li><li> Nästa dag, tvätta embryon i MAB. Låt de embryon som inkubera i MAB i 5 minuter först, sedan utför buffert förändringar och inkubera i två 10 minuter, en 30 minut och en 60 minuters intervall. Exakt tidpunkt är inte nödvändigt </li><li> Tvätta embryon 3 gånger i 5 minuter vardera i alkaliskt fosfatas (AP) buffert </li></ol> Del IV: Färgning och slutbehandling (Tidsåtgång 1 timme till över natten för färgning, beroende på vilken riboprobe kanske 4 timmar till början av glycerol tvättar, 60-10 timmar per glycerol tvätta, förvaras i glycerol) <ol start="19"><li> Tillsätt 1-2 ml färgning på embryon, linda in plattan i folie och kontrollera färgning med jämna mellanrum (ca var 20 minut) tills färgningen är tillräcklig </li><li> Tvätta embryon med PBST 2 gånger under 5 minuter för att stoppa färgningsreaktionen </li><li> Torka embryon med 10 minuters tvättar i 25% (1 tid) och 50% (2 gånger) metanol i PBST, sedan i 100% metanol, att ta bort bakgrundsfärgning </li><li> Låt embryon till inkubera i 100% metanol i minst 2 timmar vid rumstemperatur </li><li> Rehydrera i PBST med 10 minuters tvättar i 50% (2 gånger) och 25% (1 tid) metanol i PBST, tvätta sedan i 100% PBST 2 gånger </li><li> Överföring färgade embryos till en 80% glycerol lösning i PBST, med hjälp av en graderad serie av tvättar och förvara vid 4 ° C. </li></ol> Recept: <ul><li> LB agarplattor-10 g LB agar + 250 ml destillerat vatten, autoklav, när sval vid beröring lägga 250 mikroliter ampicillin, häll 15-20 ml varm lösning i varje petriskål, låt agar stelna </li><li> LB buljong-12,5 g LB buljong + 200 ml destillerat vatten, autoklav, låt svalna innan användning </li><li> 1% TAE gel 0,4 g agaros, 40 ml 1X TAE, 2 mikroliter etidiumbromid, last 7 mikroliter plasmid (Plasmid Omvandling av Target cDNA) eller 3 mikroliter riboprobe och 4 mikroliter DEPC vatten (in situ DIG-märkt RNA sond Synthesis) + 1 mikroliter laddningsfärg, 5 mikroliter DNA stege </li><li> Prehybridization lösning-50% formamid, 5X Rymdbolaget, 9.2mM citronsyra, 1% Tween-20 </li><li> Hybridisering lösning-prehybridization lösning plus 500 mikrogram / ml tRNA och 50 mikrogram / ml Heparin </li><li> MAB-100mm maleinsyra, 150mm NaCl, 0.2M NaOH, 0,1% Tween-20, pH till 7,5 </li><li> Blockerande lösningen-3 delar MAB, 1 del 10% Boehringer blockera reagens i MAB, 1 del värme avaktiveras lamm serum </li><li> AP buffert-60mm Tris-HCl pH till 9,5, 60mm NaCl, 30mm MgCl 2, 0,1% Tween-20 </li><li> Färglösningen-5-Bromo-4-klor-3-indolyl fosfat (BCIP) och Nitro blå tetrazolium (NBT) i AP buffert </li></ul> 4. Representativa resultat När de utförs på rätt sätt, kommer reaktionen mellan NBT, BCIP och alkaliskt fosfatas bildar en lila fällning som ska visas på zebrafisk embryot som en lila fläck. Riboprobes bör tidigare syntetiseras från cDNA som motsvarar den genen av intresse. Därför kan man dra slutsatsen någon fläck visualiserat representerar delar av zebrafisk där genen av intresse har skrivits på just utvecklingsstadiet. Vid tillämpning av detta var naturligtvis riboprobes syntetiseras från aldh1a2 (tidigare raldh2; Begemann et al, 2001;. Figur 1), fgf8a (Reifers et al, 1998;. Figur 2), deltaC (Oates et al, 2005.) myod1 (Weinberg et al, 1996.) shha (. Krauss et al, 1993), pax2a (Brand et al, 1996;. figur 3) och myl7 (tidigare cmlc2;. Yelon et al, 1999) cDNA. Infärgning väntades i mittlinjen och anatomiska strukturer, inklusive somites, tailbud, myotome, hjärna och hjärta. Ace/fgf8a mutanter förväntades ha brister i många av dessa strukturer. Färgning enkelt visualiseras med en vanlig dissekera mikroskop. Ytterligare källor innehåller mer information och felsökning på VILL tekniker liknande dem som beskrivs här (Clark, 2003;. D&#39;Costa et al, 2009; Schmoldt et al, 2009;. Schoenwolf, 2009). <img src="/files/ftp_upload/2533/2533fig1.jpg" alt="Figur 1" /> Figur 1. En zebrafisk embryo 24 timmar efter befruktningen, som har hybridiseras med riboprobes specifika för aldh1a2. Specifik färgning kan ses i ögonen, hindbrain, bröstfenan knopp primordia och somites. Främre är att toppen är posterior till botten. <img src="/files/ftp_upload/2533/2533fig2.jpg" alt="Figur 2" /> Figur 2. En zebrafisk embryo i 13 somit utvecklingsstadium som har hybridiseras med en sond specifika för fgf8a. Specifik infärgning ses i telencephalon, rygg diencephalon, mitthjärnan-hindbrain gränsen, somites och tailbud. Ventrala är till vänster, är rygg till höger. <img src="/files/ftp_upload/2533/2533fig3.jpg" alt="Figur 3" /> Figur 3. En 22 timmar efter befruktningen zebrafisk embryo som har hybridiseras med en riboprobe specifika för pax2a, en robust markör användbart för visualisering av nervsystemet. Specifik färgning kan ses i åderhinnan spricka, mitthjärnan-hindbrain gränsen, öron vesikler och ryggmärgen nervceller sladd. Dorsal syfte med främre till vänster.

<ol>
	<li>Albertson, R. C., Yelick, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+for+fgf8+signaling+in+left-right+patterning+of+the+visceral+organs+and+craniofacial+skeleton.">Roles for fgf8 signaling in left-right patterning of the visceral organs and craniofacial skeleton.</a> Dev. Biol. 283, 310-321 (2005).</li><li>Aramaki, M., Kimura, T., Udaka, T., Kosaki, R., Mitsuhashi, T., Okada, Y., Takahashi, T., Kosaki, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+expression+profile+of+chicken+CHD7,+the+ortholog+of+the+causative+gene+for+CHARGE+syndrome.">Embryonic expression profile of chicken CHD7, the ortholog of the causative gene for CHARGE syndrome.</a> Birth Defects Res A Clin Mol Teratol. 79, 50-57 (2007).</li><li>Begemann, G., Schilling, T. F., Rauch, G. J., Geisler, R., Ingham, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+neckless+mutation+reveals+a+requirement+for+raldh2+in+mesodermal+signals+that+pattern+the+hindbrain.">The zebrafish neckless mutation reveals a requirement for raldh2 in mesodermal signals that pattern the hindbrain.</a> Development. 128, 3081-3094 (2001).</li><li>Brand, M., Heisenberg, C. P., Jiang, Y. J., Beuchle, D., Lun, K., Furutani-Seiki, M., Granato, M., Haffter, P., Hammerschmidt, M., Kane, D. A., Kelsh, R. N., Mullins, M. C., Odenthal, J., van Eeden, F. J., Kane, D. A., N&#252;sslein-Volhard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+zebrafish+genes+affecting+the+formation+of+the+boundary+between+midbrain+and+hindbrain.">Mutations in zebrafish genes affecting the formation of the boundary between midbrain and hindbrain.</a> Development. 123, 179-190 (1996).</li><li>Clark, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> In situ Hybridization: Laboratory Companion. , (2003).</li><li>D'Costa, A., Shepherd, I. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+development+and+genetics:+Introducing+undergraduates+to+developmental+biology+and+genetics+in+a+large+introductory+laboratory+class.">Zebrafish development and genetics: Introducing undergraduates to developmental biology and genetics in a large introductory laboratory class.</a> Zebrafish. 6, 169-177 (2009).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Emerging Model Organisms: A Laboratory Manual, Volume 1. , (2008).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Emerging Model Organisms: A Laboratory Manual, Volume 2. , (2010).</li><li>Geetha-Loganathan, P., Nimmagadda, S., Scaal, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+signaling+in+limb+organogenesis.">Wnt signaling in limb organogenesis.</a> Organogenesis. 4, 109-115 .</li><li>Geetha-Loganathan, P., Nimmagadda, S., Scaal, M., Huang, R., Christ, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+signaling+in+somite+development.">Wnt signaling in somite development.</a> Ann Anat. 190, 208-222 .</li><li>Huelsken, J., Behrens, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Wnt+signaling+pathway.">The Wnt signaling pathway.</a> J Cell Sci. 15, 3977-3978 (2002).</li><li>Krauss, S., Concordet, J. P., Ingham, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+functionally+conserved+homolog+of+the+Drosophila+segment+polarity+gene+hh+is+expressed+in+tissues+with+polarizing+activity+in+zebrafish+embryos.">A functionally conserved homolog of the Drosophila segment polarity gene hh is expressed in tissues with polarizing activity in zebrafish embryos.</a> Cell. 75, 1431-1444 (1993).</li><li>Oates, A. C., Mueller, C., Ho, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cooperative+function+of+deltaC+and+her7+in+anterior+segment+formation.">Cooperative function of deltaC and her7 in anterior segment formation.</a> Dev. Biol. 280, 133-149 (2005).</li><li>Pizard, A., Haramis, A., Carrasco, A. E., Franco, P., L&#243;pez, S., Paganelli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-mount+in+situ+hybridization+and+detection+of+RNAs+in+vertebrate+embryos+and+isolated+organs.">Whole-mount in situ hybridization and detection of RNAs in vertebrate embryos and isolated organs.</a> Curr Protoc Mol Biol. Chapter 14, (2004).</li><li>Reifers, F., Bohli, H., Walsh, E. C., Crossley, P. H., Stainier, D. Y., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fgf8+is+mutated+in+zebrafish+acerebellar+(ace)+mutants+and+is+required+for+maintenance+of+midbrain-hindbrain+boundary+development+and+somitogenesis.">Fgf8 is mutated in zebrafish acerebellar (ace) mutants and is required for maintenance of midbrain-hindbrain boundary development and somitogenesis.</a> Development. 125, 2381-2395 (1998).</li><li>Schmoldt, A., Forecki, J., Hammond, D. R., Udvadia, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+differential+gene+expression+in+zebrafish+to+teach+basic+molecular+biology+skills.">Exploring differential gene expression in zebrafish to teach basic molecular biology skills.</a> Zebrafish. 6, 187-199 (2009).</li><li>Schoenwolf, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Laboratory Studies of Vertebrate and Invertebrate Embryos: Guide and Atlas of Descriptive and Experimental Development. , (2008).</li><li>Stickney, H. L., Barresi, M. J., Devoto, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somite+development+in+zebrafish.">Somite development in zebrafish.</a> Dev Dyn. 219, 287-303 (2000).</li><li>Weinberg, E. S., Allende, M. L., Kelly, C. S., Abdelhamid, A., Murakami, T., Andermann, P., Doerre, O. G., Grunwald, D. J., Riggleman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+regulation+of+zebrafish+MyoD+in+wild-type,+no+tail+and+spadetail+embryos.">Developmental regulation of zebrafish MyoD in wild-type, no tail and spadetail embryos.</a> Development. 122, 271-280 (1996).</li><li>Yelon, D., Horne, S. A., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Restricted+expression+of+cardiac+myosin+genes+reveals+regulated+aspects+of+heart+tube+assembly+in+zebrafish.">Restricted expression of cardiac myosin genes reveals regulated aspects of heart tube assembly in zebrafish.</a> Dev. Biol. 214, 23-37 (1999).</li></ol>

WISH användes i en jämförande ryggradsdjur biologi laborationskurs att hjälpa studenterna att förstå funktionen hos genetik i anatomiska utveckling genom visualisering av kända mönster genuttryck. För den första delen av kursen, som utförs studenter dissektioner på organismer som representerar flera olika chordate taxa, så att de gott om tid att studera, förstå, jämföra och kontrast ryggradsdjur anatomi. Som en inledning till den andra delen av kursen var studenter ges en formell föreläsning som beskriver zebrafisk utveckling och anatomi. De metoder och förväntade resultat för en önskan försöket diskuterades också. Eleverna fick sedan leva zebrafisk på somitogenesis och prim-6 stadier av utveckling, och på 2 och 5 dagar efter befruktningen (DPF) för att undersöka under dissekera mikroskop. Detta var att ge studenterna en bättre förståelse för vad zebrafisk embryon ser ut och vilka typer av morfologiska förändringar som uppkommer över ontogeni. I nästa laboration, fick eleverna ges zebrafisk embryon som önskar tidigare hade utförts. De ombads att studera och beskriva mönster genuttrycket för varje gen av intresse (riboprobe används). Embryon som används för WISH härrör från parningar mellan medlemmarna i en heterozygot ace/fgf8a linje. Baserat på Mendels arv, var 25% av embryon från ace/fgf8a parningar förväntas vara homozygota mutanter och uppvisa brister i många av de anatomiska strukturer fokuserat på i denna kurs. Baserat på publicerade rapporter och opublicerade observationer i Albertson labbet, var brister i hjärnan och felaktig hjärta looping väntat, liksom brister i somites (Brand et al, 1996;. Albertson och Yelick, 2005; personliga observationer). Eleverna ombads att granska alla prover, vild typ (heterozygot djur inte kan skiljas från vildtyp syskon i tidiga stadier av utveckling) och homozygota mutanter, för varje gen som presenteras uttryck mönster. De blev sedan ombedda att skriva labbrapporter som beskriver sina resultat, och baserat på sina kunskaper i anatomi och genetik, hur defekta genen uttryck kan ha fällt anatomiska missbildningar. Eleverna verkade få denna laboration med spänning och nyfikenhet. De flesta hade aldrig använt VILL förut och var mycket intresserade av denna del av kursen. Eleverna fann olika mönster av genuttryck i zebrafisk embryon spännande, visualiserade vissa till och med beskrivit färgningsmönster genom att associera dem med välkända mönster och symboler, t.ex. en smiley. Den resulterande labbrapporter visade studenterna hade en allmän förståelse av WISH protokoll och uttrycket av gener i specifika anatomiska strukturer. Studenterna var också krävs för att förstå de specifika funktioner de gener studeras med WISH under laborationen (Stickney et al, 2000;. Huelsken et al, 2002;. Geetha-Loganathan et al, 2008a;.. Geetha-Loganathan et al, 2008b ). Det var uppenbart dock att vissa elever hade begränsade förkunskaper i signalvägar och gener av intresse. Mer information om dessa begrepp i WISH inledande föreläsning kan vara ett välkommet tillskott till användningen av vill i framtiden Jämförande kurser Vertebrate biologi. Eftersom protokollet generally tar fyra dagar i rad, beroende på schemat för kursen, kan eleverna endast kunna slutföra en del av experimentet i klassen och instruktören måste ansvara för resten. I vår jämförande ryggradsdjur biologi klass, avslutade eleverna färgning reaktioner i laboratoriet, medan assistenten utfört alla föregående steg. Om det är att föredra att ha eleverna utför önskan i klassen, kan protokollet delas in subenheter som kan utföras på flera laborationer, beroende på tid i klassen. Om det inte är möjligt för studenter att utföra hela protokollet, eftersom det var här på grund av labbet möte en gång i veckan kan eleverna lägga färglösningen i början av klassen och, beroende på vilken riboprobe har fläckar kompletta inom en timme. Den tid det tar för fläcken att utvecklas varierar kraftigt med varje riboprobe och olika experimentella förhållanden, och bör förutbestämd innan klassen. Särskilt om eleverna bara kommer att utveckla fläcken i labbet kommer instruktörer att ansvara för alla föregående steg, vilket kommer att kräva mycket tid och ansträngning utanför klassrummet. Om så önskas kan ett kortare alternativ till WISH vara immunohistokemi, med hjälp av antikroppar etiketter för att visualisera protein lokalisering, men vid denna tid, zebrafisk-specifika antikroppar för utvecklingstoxicitet gener är inte lätt tillgänglig. Ett annat alternativ skulle vara att utföra vill på olika ryggradsdjur ettnd har studenterna jämföra uttrycket mönster av samma gener i olika organismer (Pizard et al, 2004;. Aramaki et al, 2007;. Emerging modellorganismer, 2008; Emerging modellorganismer, 2010). Det övergripande målet med att använda önskan i ett jämförande ryggradsdjur biologi kursen var att visa för eleverna hur molekylärbiologiska tekniker används för att studera anatomiska utveckling. Det gav också en möjlighet för studenter att spekulera om hur förändrad genexpression kan leda inte bara till utveckling missbildningar, men också till evolutionära förändringar. Formaliserat som evolutionär utvecklingsbiologi (ofta kallad &quot;Evo-Devo&quot;), syftar detta snabbt växande område studie för att länka genotyp och fenotyp genom utveckling, och att belysa eventuella mekanistiska grunderna för evolutionär förändring. Med anledning av detta område är mer ekologer, organismbiologi biologer och fysiologer anställa molekylära tekniker i sin forskning. Vi hävdar att användningen av önskan i ett jämförande ryggradsdjur Biologi kurs hjälper till att hålla läroplanen uppdaterad med nuvarande tekniska och konceptuella framsteg inom forskningen, och för att underlätta en bättre horisontell justering av övre kurser på biologi genom att kombinera biologiska delområden. Dessutom kommer den här integrerad strategi att ge studenterna möjlighet att lära sig ett sortiment av biologisk forskning tekniker i en kurs, vilket leder till en mer diversifierad utbildning och främjande av framtida tvärvetenskaplig forskning.

<ul><li> Autoklav </li><li> Micro-centrifug </li><li> 37 ° C inkubator (med shaker) </li><li> 4 ° C mikro-centrifug </li><li> Vattenbad </li><li> Vortex </li><li> Gelelektrofores apparater </li><li> -20 ° C frys </li><li> -80 ° C frys </li><li> Rocker / shaker </li><li> 4 ° C kylskåp </li><li> Analysera mikroskop (helst med en undervisning skärm eller kamera) </li></ul>

using whole mount in situ hybridization to link molecular and organismal biology

Hela montera in situ hybridisering (vill) är en vanlig teknik i molekylärbiologi laboratorier för att studera genuttryck genom lokalisering av specifika mRNA transkript inom hela montera exemplar. Denna teknik (anpassad från Albertson och Yelick, 2005) användes i en övre nivå grundnivå Jämförande ryggradsdjur Biology Laboratory klassrum på Syracuse University. De första två tredjedelar av de jämförande vertebratzoologi biologi labb Kursen gav studenterna möjlighet att studera embryologi och anatomi i ett flertal organismer som representerar olika chordate taxa främst via traditionella dissektioner och användning av modeller. Den sista delen av kursen deltar ett innovativt förhållningssätt till undervisning anatomi genom observationer av ryggradsdjur utveckling anställa molekylära tekniker som önskar utfördes på zebrafisk embryon. En heterozygot fibroblast tillväxtfaktor 8 ett (fgf8a) mutant linje, ess, användes. På grund av Mendels arv, intercrosses ess producerade vild typ, heterozygota och homozygota ace/fgf8a mutanter i ett 1:02:01 förhållande. RNA sonder med kända uttryck mönster i mittlinjen och utveckla anatomiska strukturer som hjärta, somites, tailbud, myotome, och hjärnan har använts. WISH utfördes med hjälp av zebrafisk vid 13 somit och prim-6 steg, med studenter som utför färgning reaktionen i klassen. Studien av zebrafisk embryon i olika stadier av utveckling gav eleverna möjlighet att observera hur dessa anatomiska strukturer förändrats under ontogeni. Dessutom visas några ace/fgf8a mutanter felaktig hjärta looping, och defekter i somit och hjärnans utveckling. Eleverna i denna laboration observerade den normala utvecklingen av olika organsystem med både externa anatomi samt gen mönster uttryck. De har också identifierat och beskrivit embryon visa felaktig anatomiska utveckling och genuttryck (dvs förmodad mutanter). För instruktörer på institutioner som inte redan äger den nödvändiga utrustningen eller där medel för labb och innovation i kursplanerna är begränsad kan den finansiella kostnaden för reagens och apparatur vara en faktor att beakta, liksom den tid och ansträngning som krävs på den del av instruktör oavsett inställningen. Trots detta hävdar vi att användningen av önskan i denna typ av klassrummet laboratoriemiljö kan ge en viktig länk mellan utveckling genetik och anatomi. Eftersom tekniken går framåt och förmågan att studera organismbiologi utveckling på molekylär nivå blir lättare, billigare och allt mer populärt, många evolutionsbiologer, ekologer och fysiologer vänder sig till forskningsstrategier inom området molekylärbiologi. Använda önskan i ett jämförande ryggradsdjur Biology Laboratory klassrummet är ett exempel på hur molekyler och anatomi kan mötas i en enda kurs. Detta ger övre nivå studenter möjlighet att öva modern biologisk forskning tekniker, vilket leder till en mer diversifierad utbildning och främjande av framtida tvärvetenskaplig forskning.

Watch this Scientific Journal Video about Using Whole Mount in situ Hybridization to Link Molecular and Organismal Biology at JoVE.com

Using Whole Mount in situ Hybridization to Link Molecular and Organismal Biology

Hela montera<em&gt; På plats</em&gt; Hybridisering (vill) har använts i en övre nivå grundnivå Jämförande ryggradsdjur Biologi kurs vid sidan av ryggradsdjur dissektioner. Detta gav eleverna möjlighet att studera mönster genuttryck samt anatomi, koppla studiet av molekylära och organismbiologi inom en kurs.

Använda Hela Mount På plats Hybridisering till Link Molekyl-och organismbiologi

Whole mount in situ hybridization (WISH) is a common technique in molecular biology laboratories used to study gene expression through the localization of ...

Research

JoVE Journal

Biology

Using Whole Mount in situ Hybridization to Link Molecular and Organismal Biology

Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos

Dubbel Hela Montera in situ hybridisering för tidig kycklingembryon

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Method for Whole Mount Antibody Staining in Chick

Metod för hela berget antikropp färgning i Chick

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Zebrafisk Hela Mount högupplöst Dubbel Fluorescerande In Situ Hybridisering

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology.  Here, we present a high-resolution double ...

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

Hela berget<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisering av E8.5 till E11.5 musembryon

Whole mount in situ hybridization is a very informative approach for defining gene expression patterns in embryos. The in situ hybridization procedures ...

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

Hög kapacitet fysisk Kartläggning av kromosomer med hjälp av automatiserad<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisering

Projects to obtain whole-genome sequences for 10,000 vertebrate species1 and for 5,000 insect and related arthropod species2 are expected to take place ...

Chromosome Replicating Timing Combined with Fluorescent In situ Hybridization

Chromosome Replicating Timing Combined with Fluorescent In situ Hybridization

Kromosom Replikera Timing kombination med fluorescerande<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisering

Mammalian DNA replication initiates at multiple sites along chromosomes at different times during S phase, following a temporal replication program. The ...

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Hel Mount RNA Lysrör<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisering av<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryon

Assessing  the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization  properties of its transcribed RNA, are key features for ...

RNA In situ Hybridization in Whole Mount Embryos and Cell Histology Adapted for Marine Elasmobranchs

RNA In situ Hybridization in Whole Mount Embryos and Cell Histology Adapted for Marine Elasmobranchs

RNA<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisering i hela Mount Embryon och Cell Histologi Anpassad för marina Elasmobranchii

Marine  elasmobranchs are valued animal models for biomedical and genomic studies as  they are the most primitive vertebrates to have adaptive immunity ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Visualisering och analys av mRNA-molekyler användning av fluorescens<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisering i<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function

High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function

Hög upplösning Hela Mount<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisering inom Zebrafish embryon för att studera genuttryck och funktion

This article focuses on whole-mount in situ hybridization (WISH) of zebrafish embryos. The WISH technology facilitates the assessment of gene expression ...