Name: using a pan-viral microarray assay (virochip) to screen clinical samples for viral pathogens
Uploaded: 2011-04-27T14:00:00
Duration: 13 min 45 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using a Pan-Viral Microarray Assay Virochip to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens at JoVE.com

Vi tackar David Wang, Anatolij Urisman, Amy Kistler, Kael Fischer, Patrick Tang, och Alexander Greninger för den inledande utvecklingen och optimering av Virochip protokollet. Detta arbete stöds av en NIH K08 bidrag och Abbott Discovery Award (till CC) och Howard Hughes Medical Institute (till JLD).

Stegen i Virochip analysen omfattar (1) nukleinsyra extraktion från kliniska prover, (2) omvänd transkription av extraherat RNA och 2: a-strand cDNA syntes, (3) PCR-amplifiering av slumpmässigt primas cDNA, (3) Cy3 fluorescerande färg inbyggnad , (4) hybridisering av märkt material till Virochip microarray, och (5) scanning och analys (Figur 1). Protokollet nedan kommer att visa användningen av Virochip analysen på en nasal kompress prov från ett barn med en influensaliknande sjukdom. Primer Sekvenser Primer En 5&#39;-GTTTCCCAGTCACGATA-(N 9) -3 &quot; Primer B 5&#39;-GTTTCCCAGTCACGATA-3 &quot; 1. Nukleinsyra Extraktion <ol><li> Nukleinsyra extraktion från kliniska prover bör ske under biosäkerhetsnivå 2 (BSL-2) eller högre villkor, eftersom dessa prover är potentiellt smittsamma. </li><li> Nasal provstickan provet transporteras i viral hålla medium. Alikvotera 200 mikroliter av provet i ett 1,5 ml Eppendorf mikrocentrifugrör. </li><li> Tillval: passera provet genom ett 0,22 ìm filter (för att rena för viruspartiklar) </li><li> Tillval: förbehandla provet med DNAse (att bryta ned DNA värd genomiska och rena för skyddade, encapsidated virusets nukleinsyra) med hjälp av Turbo DNAse kit (Ambion) per tillverkarens anvisningar </li><li> Extrahera provet med hjälp av Zymo ZR RNA Extraction Kit eller Qiagen Ultrasens Virus Kit per tillverkarens anvisningar. </li></ol> 2. Omvänd transkription och 2: a-strängen cDNA syntes (&quot;v&quot;) <ol><li> Tillsätt 1 uL 40 pmol / mikroliter Primer A till 4 uL extraherat RNA. Värm till 65 ° C i 5 min i en termocykler (t.ex. GeneAmp PCR System 9700) och låt svalna i rumstemperatur x 5 min. </li><li> Tillsätt 5 mikroliter av en mästare blandning bestående av 2 mikroliter 5X RT-buffert, 1 mikroliter 12,5 mM dNTP, 1 mikroliter vatten, 0,5 mikroliter 0,1 miljoner DTT och 0,5 mikroliter SSIII RT (Invitrogen). Inkubera vid 42 ° C x 60 minuter. </li><li> I en programmerbar termocykler, värm till 94 ° C x 2 min (för att avbryta omvänt transkriptas reaktion), kyl till 10 ° C, puls centrifugering, och tillsätt därefter 5 mikroliter Sequenase blandning bestående av 1 mikroliter 5X Sequenase buffert, 3,8 mikroliter vatten, och 0,15 mikroliter Sequenase (USB Corporation). För 2: a del syntes, ramp upp från 10 ° C till 37 ° C över 8 minuter, håll 8 min, värm sedan till 94 ° C x 2 min (för att inaktivera Sequenase) och kyl till 10 ° C (håll). </li><li> Tillval: Rd Ett prov cDNA kan lagras på denna punkt vid -20 ° C. </li></ol> 3. PCR-amplifiering av Grundmålade slumpmässigt cDNA (&quot;Round B&quot;) <ol><li> Tillsätt 5 ul av RD Ett prov till 45 mikroliter av Master Mix består av 5 mikroliter 10X PCR-buffert, 1 mikroliter 12,5 mM dNTP, 1 mikroliter 100 pmol / mikroliter primer B, 1 mikroliter KlenTaq LA (Sigma), och 37 mikroliter vatten. </li><li> Kör PCR-protokoll som följer: 94 ° C, 2 min → (25 cykler av 94 ° C, 30 s / 50 ° C, 45 s / 72 ° C, 1 min) → 72 ° C, 5 min → 10 ° C ( håll) </li><li> Kontrollera Rd B-provet på en 1,5% agaros elektrofores gel. En smear från cirka 200 - 1000 BP ska visualiseras (Figur 2A) </li></ol> 4. Cy3 fluorescerande färg Bolagsbildning <ol><li> Tillval: andra prov kan märkas med Cy5 fluorescerande färg och hybridiseras till samma microarray. </li><li> Att införliva aa-dNTP, tillsätt 5 ul Rd B prov till 45 ul av en mästare mix bestående av 5 ul 10X PCR-buffert, en uL 12,5 mm AA-dNTP (Invitrogen), 1 uL 100 pmol / UL primer B, 1, 1 uL KlenTaq LA (Sigma), och 37 uL vatten. Kör PCR-protokoll som följer: 94 ° C, 2 min → (15 cykler av 94 ° C, 30 s / 50 ° C, 45 s / 72 ° C, 1 min) → 72 ° C, 5 min → 10 ° C ( håll) </li><li> Rengör Rd C provet med DNA Clean och Concentrator-5 Kit (Zymo Forskning) enligt tillverkarens anvisningar. Eluera i 10 mikroliter. </li><li> Tillsätt 1 ul 1M bikarbonat (Sigma) och 1 uL Cy5 (GE Healthcare) till RD C provet. </li><li> Inkubera x 1 timme i mörker. </li><li> Rengör Cy3-märkta prov med DNA Clean och Concentrator-5 Kit (Zymo Forskning) enligt tillverkarens anvisningar. Eluera i 12 mikroliter. </li></ol> 5. Hybridisering till Virochip microarray <ol><li> Tillval: Använd 1,5 mikroliter att kolla cDNA koncentrationen och mängden färg som ingår i en Nanodrop spektrofotometer (för normalisering av prover) </li><li> I ett PCR-remsa rör tillsätt 1 mikroliter 25X fragmentering buffert, 5 mikroliter 5X blockerande buffert, 9,5 mikroliter (eller belopp att normalisera) av Cy3 märkt prov, och vatten till en total volym av 25 mikroliter (Agilent) </li><li> Tillsätt 25 mikroliter av 2X Gex hybridisering buffert (Agilent). Spinn ner kort för att ta bort bubblor. </li><li> Belastning 40 mikroliter av provet på packningen bild. </li><li> Placera Agilent tryckta Virochip array (University of Californien, San Francisco / Agilent) (sidan märkt &quot;Agilent&quot; nedåt) ovanpå packningen bilden och fäst skruven hårt. </li><li> Hybridisera över natten i 65 ° C ugn, hastighet inställning vid 10 rpm. </li><li> För att tvätta arrayer, förvärma buffert 2 (Agilent) till 37 ° C. Ta isär packning bild / array smörgås under vattnet i buffert 1 (Agilent). Tvätta i buffert 1 x 1 min. Tvätta i förvärmd buffert 2 x 1 min. Ta långsamt glida ur buffert 2, som är noga med att undvika bubblor (använd kimwipe att transportera bort extra fukt Var noga med att undvika en direkt beröring aktiva sidan av Array) </li><li> Placera glida in diapositivhållaren och sätt in array scanner. </li></ol> 6. Virochip Scanning och analys <ol><li> Scan Cy3-märkta samling på 5 ìm eller 2 ìm enligt instrumentets standard scanning protokoll (Figur 2B). </li><li> Analysera Virochip microarrays genom okulär besiktning, klusteranalys, eller den automatiserade Virochip analysprogram, E-Förutspå 11. Genom alla dessa tre metoder är influensavirus lätt påvisas i näsans pinnen prov (från ett barn med influensaliknande sjukdom) (Figur 2C) </li></ol> 7. Representativa resultat: När protokollet är gjort rätt ska ett utstryk ses på agarosgelelektrofores efter Rd B steg (Figur 2A). Den Virochip microarray på Agilent plattformen kommer att vara svårt att analysera visuellt (Figur 2B), men om ett virus finns det ska vara lätt identifieras genom visuell inspektion, klusteranalys, och / eller E-förutsäga (Figur 1C). Prover kan spetsas med uppmätta mängder av nukleinsyra från ett känt virus (t ex tobak viruset, MS2 bakteriofag) att fungera som en positiv kontroll för analysen. <img src="/files/ftp_upload/2536/2536fig1.jpg" alt="Figur 1" /> Figur 1. Schematisk bild av Virochip microarray bearbetning och analys. Utvinns nukleinsyra från kliniska prover slumpmässigt förstärks, märkta med fluorescerande färger och hybridiseras till Virochip microarray. Microarrays skannas på 2 ìm upplösning och analyseras med hjälp av olika beräkningsmodeller verktyg, inklusive E-förutse. <img src="/files/ftp_upload/2536/2536fig2.jpg" alt="Figur 2" /> Figur 2. Stegen i Virochip analysen Efter förstärkningen av slumpmässig PCR, ett utstryk av 200 -. 1000 BP kan visualiseras med gelelektrofores (A) (B) Tre Virochip mikroarrayer av de 8 arrayer / glasskiva visas, med en liten region. av en microarray blåst upp i infällda i nedre högra hörnet. (c) Automatisk microarray virus analys med hjälp av E-Förutsäga avslöja förekomsten av influensa A-virus i den kliniska prov. Den höga likheten poäng (s = 0,55) motsvarar ett p-värde som är nära noll, vilket gör detta till ett mycket viktigt förutsägelse.

<ol>
	<li>Wang, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microarray-based+detection+and+genotyping+of+viral+pathogens.">Microarray-based detection and genotyping of viral pathogens.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 15687-15692 (2002).</li><li>Chiu, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnosis+of+a+critical+respiratory+illness+caused+by+human+metapneumovirus+by+use+of+a+pan-virus+microarray.">Diagnosis of a critical respiratory illness caused by human metapneumovirus by use of a pan-virus microarray.</a> J Clin Microbiol. 45, 2340-2343 (2007).</li><li>Chiu, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microarray+detection+of+human+parainfluenzavirus+4+infection+associated+with+respiratory+failure+in+an+immunocompetent+adult.">Microarray detection of human parainfluenzavirus 4 infection associated with respiratory failure in an immunocompetent adult.</a> Clin Infect Dis. 43, e71-e76 (2006).</li><li>Chiu, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Utility+of+DNA+microarrays+for+detection+of+viruses+in+acute+respiratory+tract+infections+in+children.">Utility of DNA microarrays for detection of viruses in acute respiratory tract infections in children.</a> J Pediatr. 153, 76-83 (2008).</li><li>Kistler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pan-viral+screening+of+respiratory+tract+infections+in+adults+with+and+without+asthma+reveals+unexpected+human+coronavirus+and+human+rhinovirus+diversity.">Pan-viral screening of respiratory tract infections in adults with and without asthma reveals unexpected human coronavirus and human rhinovirus diversity.</a> J Infect Dis. 196, 817-825 (2007).</li><li>Rota, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+novel+coronavirus+associated+with+severe+acute+respiratory+syndrome.">Characterization of a novel coronavirus associated with severe acute respiratory syndrome.</a> Science. 300, 1394-1399 (2003).</li><li>Wang, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+discovery+and+sequence+recovery+using+DNA+microarrays.">Viral discovery and sequence recovery using DNA microarrays.</a> PLoS Biol. 1, e2-e2 (2003).</li><li>Urisman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+novel+Gammaretrovirus+in+prostate+tumors+of+patients+homozygous+for+R462Q+RNASEL+variant.">Identification of a novel Gammaretrovirus in prostate tumors of patients homozygous for R462Q RNASEL variant.</a> PLoS Pathog. 2, 25-25 (2006).</li><li>Kistler, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recovery+of+divergent+avian+bornaviruses+from+cases+of+proventricular+dilatation+disease:+identification+of+a+candidate+etiologic+agent.">Recovery of divergent avian bornaviruses from cases of proventricular dilatation disease: identification of a candidate etiologic agent.</a> Virol J. 5, e25-e25 (2008).</li><li>Chiu, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+cardioviruses+related+to+Theiler's+murine+encephalomyelitis+virus+in+human+infections.">Identification of cardioviruses related to Theiler's murine encephalomyelitis virus in human infections.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 14124-14129 (2008).</li><li>Urisman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=E-Predict:+a+computational+strategy+for+species+identification+based+on+observed+DNA+microarray+hybridization+patterns.">E-Predict: a computational strategy for species identification based on observed DNA microarray hybridization patterns.</a> Genome Biol. 6, R78-R78 (2005).</li></ol>

Den Virochip protokoll som beskrivs här är komplex och kräver en noggrann och skicklig forskning tekniker. Korrekt reagens koncentrationer och villkor för PCR, märkning och hybridisering är kritiska. Den Virochip protokoll kan enkelt modifieras för att rymma en analys av sjuk vävnad med hjälp av en vävnad extraktion metod såsom TRIzol (Invitrogen) för nukleinsyra extraktion. Givare kan läggas till eller tas bort efter behov för att uppnå önskad spektrum och bredd täckning, till exempel, kan prober för detektion av nonviral mål såsom bakterier och svampar skall utformas och läggas &quot;on-the-fly&quot;. Några tillämpningar av Virochip analysen för närvarande under utveckling inbegriper ett brett spektrum virusdiagnostik i den kliniska laboratorium, utbrott utredning, renhet screening av läkemedel och vacciner, och nya virala patogener upptäckt.

<table border="1"><tbody><tr><th> Namn på reagens / material </th><th> Namn på reagens / material </th></tr><tr><td> Primera </td><td> 5&#39;-GTTTCCCAGTCACGATA-(N9) -3 &quot; </td></tr><tr><td> Primer B </td><td> 5&#39;-GTTTCCCAGTCACGATA-3 &quot; </td></tr><tr><td rowspan="5"> RT Master Mix (5 mikroliter) </td><td> 2 mikroliter 5X RT-buffert </td></tr><tr><td> 1 mikroliter 12,5 mm dNTP (Invitrogen) </td></tr><tr><td> 1 mikroliter vatten </td></tr><tr><td> 0,5 mikroliter 0,1 miljoner DTT </td></tr><tr><td> 0,5 mikroliter SSIII RT (Invitrogen) </td></tr><tr><td rowspan="3"> Sequenase Mix (5 mikroliter) </td><td> 1 mikroliter 5X Sequenase buffert </td></tr><tr><td> 3,8 mikroliter vatten </td></tr><tr><td> 0,15 mikroliter Sequenase (USB Corporation) </td></tr><tr><td rowspan="5"> Rd B PCR Master Mix (45 mikroliter) </td><td> 5 mikroliter 10X PCR-buffert </td></tr><tr><td> 1 mikroliter 12,5 mm dNTP (Invitrogen) </td></tr><tr><td> 1 mikroliter 100 pmol / mikroliter primer B </td></tr><tr><td> 1 mikroliter KlenTaq LA (Sigma) </td></tr><tr><td> 37 mikroliter vatten </td></tr><tr><td rowspan="5"> Rd C PCR Master Mix (45 mikroliter) </td><td> 5 uL 10X PCR-buffert </td></tr><tr><td> 1 mikroliter 12,5 mm dNTP (Invitrogen) </td></tr><tr><td> 1 mikroliter 100 pmol / mikroliter primer B </td></tr><tr><td> 1 mikroliter KlenTaq LA (Sigma) </td></tr><tr><td> 37 mikroliter vatten </td></tr><tr><td rowspan="4"> Hybridisering buffert (25 mikroliter) </td><td> 1 mikroliter 25X fragmentering buffert (Agilent) </td></tr><tr><td> 5 mikroliter 5X blockerande buffert (Agilent) </td></tr><tr><td> 9,5 mikroliter (eller belopp att normalisera) av Cy3 märkt prov </td></tr><tr><td> Tillsätt vatten till totala 25 mikroliter </td></tr><tr><td> Agilent Virochip microarray </td><td> licens i avvaktan på, tillgänglig från Chiu laboratorium, UCSF </td></tr></tbody></table>

using a pan-viral microarray assay (virochip) to screen clinical samples for viral pathogens

Diagnosen av viral orsaker till många infektionssjukdomar är svårt på grund av den inneboende sekvens mångfalden av virus samt den pågående framväxten av nya virala patogener, till exempel sars coronavirus och 2009 pandemiska H1N1 influensavirus, som inte upptäckas med traditionella metoder. För att möta dessa utmaningar har vi utvecklat tidigare och validerat ett pan-virus microarray plattform som kallas den Virochip med kapacitet att upptäcka alla kända virus och nya varianter på grundval av bevarade sekvenshomologi 1. Använda Virochip har vi identifierat hela spektrumet av virus i samband med luftvägsinfektioner, inklusive fall av oförklarlig kritiska sjukdom hos inlagda patienter som har en känslighet motsvarande eller bättre än konventionella kliniska tester 2-5. Den Virochip har också använts för att identifiera nya virus, inklusive sars coronavirus 6,7, en roman rhinovirus klad 5, XMRV (ett retrovirus kopplad till prostatacancer) 8, aviär bornavirus (orsaken till en wasting disease papegojor) 9, och en roman cardiovirus hos barn med lung-och diarrésjukdom 10. Den nuvarande versionen av Virochip finns till en Agilent microarray-plattform och består av ~ 36 tusen sonder härrör från mer än ~ 1500 virus i GenBank och med december 2009. Här kan vi visa de olika stegen i behandlingen en Virochip analys från början till slut (~ 24 timmars handläggningstid), inklusive prov nukleinsyra extraktion, PCR-amplifiering med slumpmässiga grundfärg, fluorescerande färg bolagsordningen och microarray-hybridisering, skanning och analys.

Watch this Scientific Journal Video about Using a Pan-Viral Microarray Assay Virochip to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens at JoVE.com

Using a Pan-Viral Microarray Assay Virochip to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

Den Virochip är en pan-virus microarray utformat för att samtidigt upptäcka alla kända virus och virus roman på grundval av bevarade sekvenshomologi. Här visar vi hur man driver ett Virochip analys för att analysera kliniska prover för förekomst av både kända och okända virus.

Med hjälp av en Pan-Viral microarray analys (Virochip) till skärm kliniska prover för virala patogener

The diagnosis of viral causes of many infectious diseases is difficult due to the inherent sequence diversity of viruses as well as the ongoing emergence ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Using a Pan-Viral Microarray Assay (Virochip) to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

Determining the Phagocytic Activity of Clinical Antibody Samples

Fastställande av fagocyterande förmåga för klinisk Antibody prover

Antibody-driven phagocytosis is induced via the engagement of Fc receptors on professional phagocytes, and can contribute to both clearance as well as ...

Enumeration of Major Peripheral Blood Leukocyte Populations for Multicenter Clinical Trials Using a Whole Blood Phenotyping Assay

Räkning av Stora perifera populationer blodleukocyt för kliniska multicenterstudier Använda en hel analys Blood Fenotypning

Cryopreservation of peripheral blood leukocytes is widely used to preserve cells for immune response evaluations in clinical trials and offers many ...

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

Att upprätta en flytande täckt kultur av polariserad Human luftvägsepitelceller Calu-3 celler för att studera svar värdcellen för luftvägspatogener<em&gt; In vitro</em

The  apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate  directional responses to pathogen exposure in  vivo. Thus, ideal in vitro ...

Using Click Chemistry to Measure the Effect of Viral Infection on Host-Cell RNA Synthesis

Använda klicka kemi för att mäta effekten av virusinfektion på Host-cell RNA-syntes

Many RNA viruses have evolved the ability to inhibit host cell transcription as a means to circumvent cellular defenses. For the study of these viruses, ...

Using Fluorescent Proteins to Monitor Glycosome Dynamics in the African Trypanosome

Använda fluorescerande proteiner till Monitor Glycosome Dynamics i den afrikanska trypanosom

Trypanosoma brucei is a kinetoplastid parasite that causes human African trypanosomiasis (HAT), or sleeping sickness, and a wasting disease, nagana, in ...

A Miniaturized Glycan Microarray Assay for Assessing Avidity and Specificity of Influenza A Virus Hemagglutinins

En miniatyriserad glykan microarray analys för bedömning Aviditet och specificitet av influensa A-virus Hemagglutinins

Influenza A virus (IAV) hemagglutinins recognize sialic acids on the cell surface as functional receptors to gain entry into cells. Wild waterfowl are the ...

A Rapid Strategy for the Isolation of New Faustoviruses from Environmental Samples Using Vermamoeba vermiformis

A Rapid Strategy for the Isolation of New Faustoviruses from Environmental Samples Using Vermamoeba vermiformis

En snabb strategi för isolering av nya Faustoviruses från miljöprover Använda<em&gt; Vermamoeba vermiformis</em

The isolation of giant viruses is of great interest in this new era of virology, especially since these giant viruses are related to protists. Giant ...

Developing a Salivary Antibody Multiplex Immunoassay to Measure Human Exposure to Environmental Pathogens

Utveckla en spott Antibody Multiplex immun att mäta människors exponering för miljö Pathogens

The etiology and impacts of human exposure to environmental pathogens are of major concern worldwide and, thus, the ability to assess exposure and ...

Measuring Influenza Neuraminidase Inhibition Antibody Titers by Enzyme-linked Lectin Assay

Mätning influensaneuraminidas Inhibition Antikroppstitrar genom enzymkopplad lektin analys

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional ...

Utilization of Capsules for Negative Staining of Viral Samples within Biocontainment

Användning av kapslar för negativ färgning av virala prov inom biokonstruktion

Transmission electron microscopy (TEM) is used to observe the ultrastructure of viruses and other microbial pathogens with nanometer resolution. Most ...