Name: expansion, purification, and functional assessment of human peripheral blood nk cells
Uploaded: 2011-02-02T17:30:00
Duration: 10 min 44 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Expansion, Purification, and Functional Assessment of Human Peripheral Blood NK Cells at JoVE.com

המחברים מבקשים להודות לורנס קופר, Harjeet סינג, ואת לנקה Hurton עבור עבודתם ביצירת הראשונית K562 aAPC ו mIL21 וקטורים היתוך. מימון עבור עבודה זו סופק על ידי תוכנית MD Anderson UT רופא המדען, קרן Baldrick סנט, ואת אגדות Friendswood.

1. בידוד של PBMCs מן באפי Coat כדוריות דם היקפיים mononuclear (PBMC) מתקבלים על ידי צנטריפוגה צפיפות קליל על Ficoll-Paque מן בריא התורם באפי דגימות מעיל שהפיק leukapheresis. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה Ficoll-Paque נעשה כפרוטוקול יצרן לכל עם שינויים קלים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף PBS לתורם נורמלי הדם הבנק מעיל באפי לנפח סופי של 140 מ&quot;ל (אופייני נפח באפי המעיל הוא 40-70 מ&quot;ל). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שכבה 35 מ&quot;ל של המדגם מעיל באפי על 15 מ&quot;ל של Ficoll-Paque (4 צינורות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב 400 במשך 20 דקות ללא בלם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שחזור PBMCs מן Ficoll-Paque: ממשק פלזמה, אין להשליך את RBCs בתחתית Ficoll-Paque. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף PBMCs שלוש פעמים עם PBS, centrifuging כל פעם 400 גרם במשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> PBMCs ניתן להשתמש ישירות להרחבת התא NK בשלב זה או תאים NK יכול להיות מבודד על ידי RosetteSep (סעיף 4) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> PBMCs נותרת יכול להיות קפוא FBS DMSO המכיל 10% חנקן נוזלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב Ficoll לאסוף את RBCs מן שלב 5 לשני שפופרת 50 מ&quot;ל צנטריפוגות, לשטוף שלוש פעמים עם PBS (להוסיף 50 מ&quot;ל סימן), בכל פעם לשאוב ברפרוף supernatant העליון של שכבת RBC להסיר גרנולוציטים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> RBCs ניתן להשתמש מיד לטיהור  RosetteSep בתאי NK (ראה סעיף 4) או לאחסן נפח שווה של הפתרון של Alsever ב 4 ° C לשימוש מאוחר יותר (RBCs ניתן לאחסן לכל היותר 4 שבועות). </li></ol> 2. NK הרחבת Cell הרחבת התא NK יכול להיות יזם באמצעות PBMCs או מטוהרים בתאי NK. כמות PBMCs המשמש להרחבת יכולים להיות מגוונים בהתאם לכמות התאים נ&quot;ח הרצוי בסוף הרחבה שלוש בשבוע, עיין בסעיף נציג תוצאות לקבלת פרטים. (ראה הערה 1) גירוי 1 יום 0 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור כל 6 PBMCs 5x10 יורחב, לספור מקרינים 10x10 6 K562 Cl9 mIL21 באמצעות irradiator גמא ב -100 Gy. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקרנה פוסט, לשטוף את התאים עם PBS ו resuspend בהרחבת NK תא התקשורת (NKEM). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 5x10 Seed 6 PBMCs 10x10 עם 6 מוקרן K562 Cl9 mIL21 (יחס 01:02) ב 40 מ&quot;ל של NKEM בבקבוק T75 ולמקם אותו זקוף באינקובטור ב 37 ° C ו 5% CO 2. </li></ol> ימים 3 ו 5 <ol start="4" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שחזור תאים על ידי צנטריפוגה ב 400 דקות 5 ולהחליף חצי התקשורת עם NKEM טרי (הוספת IL2 טרי נפח התקשורת כולו) ולהמשיך תרבות. </li></ol> גירוי 2 יום 7 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת התאים בתרבית בסוף שבוע אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים בצד 5x10 5 תאים phenotyping ידי cytometry זרימה (ראו הערה 2) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור כל 6 תאים 5x10 להיות restimulated, לספור מקרינים 5x10 6 K562 Cl9 mIL21 באמצעות irradiator גמא ב -100 Gy. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף מספר שווה של מוקרן K562 Cl9 mIL21 (1:1 יחס) ו resuspend ב NKEM ב 2.5x10 5 תאים בסך הכל / מ&quot;ל (ראו הערה 3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרעים תאים T75 צלוחיות (מקסימום 50 מ&quot;ל לכל בקבוק). </li></ol> יום 10 ו -12 <ol start="6" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שנה שלמה התקשורת עם NKEM טרי המבוססים על המספרים תא (ראה הערה 3). </li></ol> יום 14 <ol start="8" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתום שבועיים של הרחבה לספור את מספר התאים בתרבית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים בצד 5x10 5 תאים phenotyping ידי cytometry זרימה (ראו הערה 2) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם ההרחבה הייתה החל מ PBMCs התאים נ&quot;ח יכול להיות מטוהרים בשלב זה של התרחבות באמצעות פרוטוקול טיהור RosetteSep (עיין סעיף IV). אם הרחבה החלה מטוהרים מן התאים נ&quot;ח להמשיך גירוי 3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר טיהור להפריש 5x10 5 תאים phenotyping ידי cytometry זרימה לאמת טוהר של תאים נ&quot;ח (כמו שלב 8). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך גירוי 3 באמצעות כל התאים מטוהרים NK (ראה הערה 4). </li></ol> גירוי 3 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend נ&quot;ח תאים עם מוקרן K562 Cl9 mIL21 (1:1 יחס) ב NKEM מבוסס על מספרים סלולריים (ראו הערה 3). </li></ol> 17 ימים ו - 19 <ol start="2" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שינוי בתקשורת עם NKEM טרי המבוססים על המספרים תא (ראה הערה 3). </li></ol> יום 21 <ol start="4" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתום שלושה שבועות של הרחבה לספור את מספר התאים בתרבית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שחזור 1x10 6 תאים לניתוח cytometry זרימה מלאה עבור פאנל NK phenotyping תא נוגדן (ראו טבלה 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקפאת תאים FBS המכילה DMSO 10% בצפיפות מירבית של 5x10 7 תאים לכל בקבוקון לשימוש עתידי. </li></ol> 3. Cytotoxicity NK Cell Assay <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפשירי בקבוקון של תאים NK ואת הזרע NKEM, יום אחד לפני performing assay cytotoxicity כדי לאפשר התאוששות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור כל assay cytotoxicity NK לתא המטרה באמצעות תא יחיד קו, 6x10 5 תאים NK ו 3x10 5 תאים היעד נדרשים (ראו הערה 5). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן CAM-Media ידי דילול Calcein-AM (מניות 1 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​ב DMSO) ב NKEM (ראה הערה 6). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend 10 6 תאים היעד של 1 מ&quot;ל CAM מדיה (ראה הערה 7). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה עבור h 1 ב 37 ° C, עם רועד מדי פעם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend בתאי NK ב 1x10 6 תאים / mL ולהוסיף 200uL ההשעיה תא NK לכל אחד 3 הבארות של bottom-U-96 גם צלחת to10 המתאים: 1 E: היחס T שמוצג באיור 1. (ראה הערה 8) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 100uL של מדיה מלאה על כל בארות הנותרים מלבד &quot;מקסימום&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 100uL של 2% Triton X-100 של &quot;מקסימום&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביצוע דילולים סדרתי של תאים NK עבור ה 5 הבאים: יחסי T על ידי העברת 100uL של תאים בכל פעם, ומערבבים היטב. בטל 100uL מבארות האחרון (ה &#39;: יחס של 0.3125:1 T). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי שעה 1 של טעינה calcein, לשטוף את התאים היעד NKEM פעמיים, centrifuging במשך 5 דקות ב 1200 סל&quot;ד. (ראה הערה 9) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לספור מחדש את התאים היעד resuspend ב 1x10 5 תאים / מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 100 μL של תאים היעד היטב כל (1x10 4 / טוב). צנטריפוגה 1 דקות ב 100 גרם ליזום קשר עם התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדגור על 37 ° C ו 5% CO 2 למשך 4 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים בעדינות את התרבות על ידי pipetting עם pipetter 100 μL מנת אחיד להשעות את calcein שוחררו, התפנית כלפי מטה על צלחת 100 גרם במשך 5 דקות עד גלולה התאים והעברת 100 μL של supernatant כדי בצלחת חדש בטיפול, כדי למנוע בועות. פופ כל בועות כי עלול להיווצר באמצעות מחט דקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קרא את הצלחת באמצעות קורא צלחת ניאון (מסנן עירור 485 ננומטר, פליטת לסנן 530 ננומטר). מומלץ לקרוא התחתונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חישוב תמוגה אחוז מסוים לפי הנוסחה [(שחרור-ספונטנית מבחן שחרור) / (שחרור מרבי - שחרור ספונטני)] x 100. </li></ol> 4. NK טיהור Cell ידי RosetteSep <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח 100 של פי עודף של RBCs לזה של PBMCs או תאים מורחבת, לתוך שפופרת 50 מ&quot;ל (100:1 RBC: PBMC). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם RBCs טריים באמצעות להמשיך ישירות לשלב הבא או אם RBCs אוחסנו פתרון של Alsever, לספור את מספר RBCs ולשטוף המתאים (100 עודף לקפל) כמות RBCs עם PBS בתוספת 2% FBS שלוש פעמים, centrifuging בסל&quot;ד 1200 במשך 10 דקות בכל פעם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שלב RBCs עם PBMCs משלב 1.7 או תאים מורחבת משלב 2.10 ב PBS + 2% FBS לנפח סופי של 1 מ&quot;ל לכל 5x10 7 של PBMCs או תאים מורחבת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1μL של RosetteSep  האדם העשרה NK תא קוקטייל לכל 1x10 6 של PBMCs או תאים מורחבת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים היטב דגירה בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות עם ערבוב עדין כל 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים נפח שווה של תערובת PBS FBS + 2% בעדינות שכבה על גבי Ficoll-Paque. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על השלבים של צנטריפוגה Ficoll-Paque תיאר לבידוד PBMC (סעיף I). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת התאים נ&quot;ח התאושש לאחר טיהור להפריש 5x105 תאים phenotpying ידי cytometry זרימה על טוהר תא NK (שלב 8). </li></ol> 5. הערות הערה 1. בתאי NK ניתן להרחיב ישירות PBMCs, או RosetteSep  תאים מטוהרים NK. רשמנו לפנינו את יעילות הרחבה דומה, אך תורמים כמה יכול להיות נמוך מאוד מספרים תא NK וכתוצאה מכך טיהור קושי על ידי RosetteSep לפני התרחבות. הערה 2. אנו משתמשים באופן שגרתי CD56-FITC, CD16-PE, ו-PE-CD3 Cy5 עבור phenotyping במהלך התרחבות, מונה תאים NK לאלה אשר CD3-שלילי CD16-CD56 או חיובי. הערה 3. כל שינוי התקשורת או גירוי, תאים resuspend ב 2.5 x מ&quot;ל 10 / 5 לשמור PBMC / NK מספרים התא או מתחת 2 מיליון דולר מ&quot;ל בשלבי השיא של התרחבות. זה ימנע דלדול של חומרים מזינים לסייע בהשגת הרחבה הישרדות מירבית. הערה 4. שיעור ההתרחבות NK הוא התורם תלויה בסופו של גירויים 1 או 2 חלק מהתאים אפשר להקפיא חלק התרחב עוד יותר, בהתאם לצורך הניסוי. יש לנו הצלחה טובה באמצעות תאים קפואים הרחבות במועד מאוחר יותר. הערה 5. על מנת לאפשר מקום לטעויות אנו ממליצים להשתמש מינימום של 7x10 5 תאים NK resuspended ב 700 ULS של NKEM ו 5 4x10 Calcein-AM מוכתם היעד תאים resuspended ב 4 מ&quot;ל של NKEM עבור הקמת assay cytotoxicity. אם באמצעות פיפטה רב עבור זריעת התאים היעד כמויות גבוהות יותר של תאים (עד 6x10 5 מ&quot;ל 6) עשויים להידרש מבוסס על גודל מדיה אגן בשימוש. גם המספרים מומלץ תא NK הם במיוחד עבור E: יחסי T להראות בפרוטוקול, לשימוש E גבוה: יחסי T להגדילהתא NK מספרים לכל מ&quot;ל בהתאם (למשל עבור דואר 40:1: השימוש T יחס 4x10 6 תאים / מ&quot;ל) הערה 6. אנו ממליצים לבצע טיטרציה ראשונית Calcein-AM טעינת לקו היעד תא של בחירה, באמצעות דילולים הבאות של 1:500, 1:400. 1:300, 1:200 ו - 1:100 להשיג אופטימלי ההבדל בין שחרור מקסימלי ספונטנית. הערה 7. כשמשתמשים קו תא חסיד כמטרה, תחילה להכין ההשעיה תא בודד באמצעות אי - האנזימטית חיץ ניתוק התא. אם ביצוע ADCC, להכין צינור כפולות של תאים היעד CAM מדיה. הערה 8 אם ביצוע ADCC, להוסיף לתאי NK אותו 3 בארות המתאים E 10:01:. T עבור ADCC. חזור לתורמים נוספים. חזור עבור תאים יעד נוספים. הערה 9. אם ביצוע ניסוי ADCC, לאחר 45 דקות של טעינה calcein, להוסיף 10ug של נוגדנים ספציפיים עבור גרימת ADCC נגד התאים היעד. לאחר 15 דקות, לשטוף תאים היעד בינוני מלא פעמיים, centrifuging 5 דקות ב 1200 סל&quot;ד. תאים Resuspend ב 5 תאים 1x10 / mL ולהמשיך לשלב הבא בפרוטוקול. 6. נציג תוצאות <img src="/files/ftp_upload/2540/2540fig2.jpg" alt="איור 2" /> איור 2. כאשר הרחבת מבוצע לפי התוכנית שתוארה לעיל, באמצעות 5x106 PBMCs כחומר מוצא, אופייני התא NK התשואות נעות בין 1x10 אוקטובר 09-10 תאים (השתנות התורם תלויה). האיור מציג הרחבת התא NK לקפל (n = 19) בהשוואה לתאי NK נוכח המוצר המקורי (חציון + / - ברבעון). <img src="/files/ftp_upload/2540/2540fig3.jpg" alt="איור 3" /> איור 3. התאים מורחבת NK מבטאים שונים קולטני התא NK כי הם דומים לתאי NK מורחבת ראשוני עם כמה יוצאים מן הכלל (CD11b, CD160 ו CD244). <img src="/files/ftp_upload/2540/2540fig4.jpg" alt="איור 4" /> איור 4. ההתאוששות PBMCs מן באפי המעיל הוא התורם תלויה יכול לנוע בין 6 ל 300x10 800x10 6. התאים עשויים NK מהווים 2% - 18% PBMCs. עבור טיהור RosetteSep של תאים מורחבת, התאוששות של תאים NK טהור ביום 14 נע בין 40-70%. על ידי ביצוע הפרוטוקול המומלץ של התרחבות וטיהור, טוהר תא NK של 99% ניתן לצפות. <img src="/files/ftp_upload/2540/2540fig5.jpg" alt="איור 5" /> איור 5. בתאי NK מורחבת הוכיחו cytotoxicity נגד מגוון של שורות תאים סרטניים ובהם נוירובלסטומה, AML, אוסטאוסרקומה ומלנומה (רצח נציג AML כפי שמוצג תמוגה אחוז מסוים).

<ol>
	<li>McKenna, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Good+manufacturing+practices+production+of+natural+killer+cells+for+immunotherapy:+a+six-year+single-institution+experience.">Good manufacturing practices production of natural killer cells for immunotherapy: a six-year single-institution experience.</a> Transfusion. 47, 520-520 (2007).</li><li>Koehl, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ex+vivo+expansion+of+highly+purified+NK+cells+for+immunotherapy+after+haploidentical+stem+cell+transplantation+in+children.">ex vivo expansion of highly purified NK cells for immunotherapy after haploidentical stem cell transplantation in children.</a> Klinische Padiatrie. 217, 345-345 (2005).</li><li>Klingemann, H. G., Martinson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ex+vivo+expansion+of+natural+killer+cells+for+clinical+applications.">ex vivo expansion of natural killer cells for clinical applications.</a> Cytotherapy. 6, 15-15 (2004).</li><li>Ayello, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+cord+blood+natural+killer+and+lymphokine+activated+killer+lymphocytes+following+ex+vivo+cellular+engineering.">Characterization of cord blood natural killer and lymphokine activated killer lymphocytes following ex vivo cellular engineering.</a> Biol Blood Marrow Transplant. 12, 608-608 (2006).</li><li>Carlens, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+method+for+in+vitro+expansion+of+cytotoxic+human+CD3-CD56++natural+killer+cells.">A new method for in vitro expansion of cytotoxic human CD3-CD56+ natural killer cells.</a> Hum Immunol. 62, 1092-1092 (2001).</li><li>Boissel, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Umbilical+cord+mesenchymal+stem+cells+increase+expansion+of+cord+blood+natural+killer+cells.">Umbilical cord mesenchymal stem cells increase expansion of cord blood natural killer cells.</a> Biol Blood Marrow Transplant. 14, 1031-1031 (2008).</li><li>North, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-primed+human+natural+killer+cells+lyse+NK-resistant+tumor+targets:+evidence+of+a+two-stage+process+in+resting+NK+cell+activation.">Tumor-primed human natural killer cells lyse NK-resistant tumor targets: evidence of a two-stage process in resting NK cell activation.</a> J Immunol. 178, 85-85 (2007).</li><li>Berg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical-grade+ex+vivo-expanded+human+natural+killer+cells+up-regulate+activating+receptors+and+death+receptor+ligands+and+have+enhanced+cytolytic+activity+against+tumor+cells.">Clinical-grade ex vivo-expanded human natural killer cells up-regulate activating receptors and death receptor ligands and have enhanced cytolytic activity against tumor cells.</a> Cytotherapy. 11, 341-341 (2009).</li><li>Fujisaki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+of+highly+cytotoxic+human+natural+killer+cells+for+cancer+cell+therapy.">Expansion of highly cytotoxic human natural killer cells for cancer cell therapy.</a> Cancer Res. 69, 4010-4010 (2009).</li><li>Fujisaki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replicative+potential+of+human+natural+killer+cells.">Replicative potential of human natural killer cells.</a> Br J Haematol. 145, 606-606 (2009).</li><li>Gong, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+expansion+of+natural+killer+cells+with+high+cytotoxicity+by+K562+cells+modified+to+co-express+major+histocompatibility+complex+class+I+chain-related+protein+A,+4-1BB+ligand,+and+interleukin-15.">Ex vivo expansion of natural killer cells with high cytotoxicity by K562 cells modified to co-express major histocompatibility complex class I chain-related protein A, 4-1BB ligand, and interleukin-15.</a> Tissue Antigens. 76, 467-467 (2010).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

NK הרחבת התא ומדיה הפעלה (NKEM) <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 90% RPMI 1640 (Cellgro) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 10% עוברית שור סרום (Gibco) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1x פניצילין / סטרפטומיצין (Cellgro) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1x-L-גלוטמין (Gibco) <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סנן לעקר מדיה לפני השימוש. </li></ul></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 50 U / mL IL2 (Proleukin, חיסונים נוברטיס אבחון, Inc) <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> - מדולל ממלאי IU / μl 200. הוסף IL2 לכמות הרצויה של התקשורת רק לפני השימוש בכל פעם. </li></ul></li></ul> PBMC ו NK תא בידוד <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Ficoll-Paque (GE Healthcare) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Alsever של פתרון (Sigma) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> RosetteSep האדם העשרה NK תא קוקטייל (Stemcell טכנולוגיות) </li></ul> Cytotoxicity NK Cell Assay <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Calcein-AM (Invitrogen) <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפתרון הוא במלאי בחנות, 1 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​קפוא 50 aliquots μL. ממיסים בתקשורת NKEM להשיג דילול הרצוי עבור צביעת התא. </li></ul></li></ul> נוגדנים הרשימה של נוגדנים המשמשים phenotyping תא NK המפורטות בטבלה להלן; <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td></td><td> נוגדן </td><td> נפח לכל מבחן </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td></tr><tr><td> Tube 1 </td><td valign="top"> אלוטיפ FITC אלוטיפ FITC אלוטיפ FITC אלוטיפ FITC FACS הצפת סך נפח </td><td valign="top"> 5 5 5 5 80 100 </td><td valign="top"> BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen </td><td valign="top"> 555748 555749 557224 340442 </td></tr><tr><td> Tube 2 </td><td valign="top"> CD56 FITC NKp30 PE NKp44 PE NKp46 PE CD3 PE-Cy5 CD16 אלכסה 647 FACS הצפת סך נפח </td><td valign="top"> 5 5 5 5 5 5 70 100 </td><td valign="top"> BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen </td><td valign="top"> 340410 558407 558563 557991 555341 557710 </td></tr><tr><td> Tube 3 </td><td valign="top"> CD56 FITC KIR2DL1 PE KIR2DL2 / 3 PE KIR3DL1 PE CD3 PE-Cy5 NKG2D APC FACS הצפת סך נפח </td><td valign="top"> 5 5 5 5 5 5 70 100 </td><td valign="top"> BD Pharmingen R &amp; D מערכות Miltenyi BIOTEC R &amp; D מערכות BD Pharmingen BD Pharmingen </td><td valign="top"> 340410 FAB1844P 130-092-618 FAB12251P 555341 558071 </td></tr><tr><td> Tube 4 </td><td valign="top"> CD56 FITC CD11b PE CD3 PE-Cy5 CD27 APC FACS הצפת סך נפח </td><td valign="top"> 5 5 5 5 80 100 </td><td valign="top"> BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen </td><td valign="top"> 340410 555388 555341 558664 </td></tr><tr><td> Tube 5 </td><td valign="top"> CD56 FITC CD266 (DNAM-1) PE CD3 PE-Cy5 CD160 Alexa647 FACS הצפת סך נפח </td><td valign="top"> 5 5 5 5 80 100 </td><td valign="top"> BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen eBiosciences </td><td valign="top"> 340410 559789 555341 51-1609-42 </td></tr><tr><td> Tube 6 </td><td valign="top"> CD56 FITC CD244 (2B4) PE CD3 PE-Cy5 CD197 (CCR7) APC FACS הצפת סך נפח </td><td valign="top"> 5 5 5 5 80 100 </td><td valign="top"> BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen eBiosciences </td><td valign="top"> 340410 550816 555341 17-1979-42 </td></tr></tbody></table>

expansion, purification, and functional assessment of human peripheral blood nk cells

טבעיים (NK) תאים הרוצח לשחק תפקיד חשוב במעקב החיסונית כנגד מגוון רחב של מיקרואורגניזמים גידולים זיהומיות. זמינות מוגבלת של תאים NK ואת היכולת להרחיב את במבחנה הגביל התפתחות של תא חיסוני NK. כאן אנו מתארים שיטה יעילה להרחיב את כמויות עצומות של תפקודי vivo לשעבר בתאי NK באמצעות K562 תאים להביע קרום הנכנס IL21, כתא אנטיגן הצגת מלאכותי (aAPC). טיפולים NK תא המאמצת עד כה נוצלו מוצר תא מתקבל על ידי leukapheresis היציב של התורם ואחריו דלדול בתאי T או סלקציה חיובית של תאים NK. המוצר מופעל בדרך כלל IL-2 לילה ומנוהלים אז למחרת 1. בשל שכיחות נמוכה של תאים NK בדם ההיקפי, מספר קטן יחסית של תאים NK הועברו בניסויים קליניים. חוסר היכולת להפיץ בתאי NK במבחנה כבר את הגורם המגביל להפקת מספרים תא מספקת תוצאה קלינית אופטימלית. יש הרחבה של תאים נ&quot;ח (פי 5-10 על 1-2 שבועות) יש להיות מושגת באמצעות מינון גבוה של IL-2 בלבד 2. הפעלה של תאים T עצמיים יכולים לתווך הרחבת התא NK, ככל הנראה גם באמצעות שחרור ציטוקין המקומי 3. תמיכה עם stroma mesenchymal או תאים מלאכותיים הצגת אנטיגן (aAPCs) יכול לתמוך את התפשטות תאים NK מדם הן פריפריה דם טבורי 4. NKp46 משולב והפעלה CD2 ידי נוגדן חרוזים מצופים משווק כיום להרחבת התא NK (Miltenyi BIOTEC, אובורן CA), וכתוצאה מכך כ -100 הרחבה של פי 21 ימים. ניסויים קליניים תוך שימוש aAPC-מורחבת או המופעל בתאי NK נמצאים בעיצומם, אחד באמצעות שורת תאים leukemic CTV-1 אל התאים הממשלה להפעיל NK 5 ללא הרחבה משמעותית. במשפטו השני מנצל EBV-LCL להרחבת התא NK, השגת הרחבה 490 פי פירוש ב 21 ימים 6. השלישי מנצל aAPC K562 מבוססי transduced עם 4-1BBL (CD137L) ואת קרום הנכנס IL-15 (MIL-15) 7, אשר השיגה הרחבה נ&quot;ק ממוצע 277 של פי 21 ימים. אמנם, התאים נ&quot;ח הרחיבה באמצעות K562-41BBL-mIL15 aAPC הם ציטוטוקסיים מאוד במבחנה in vivo בהשוואה לתאי NK מורחבת, ולהשתתף ADCC, התרבות שלהם מוגבל על ידי ההזדקנות המיוחסת התקצרות הטלומרים 8. לאחרונה התרחבות של פי 350 של תאים NK נמסר באמצעות K562 מיקה להביע, 4-1BBL ו IL15 9. השיטה שלנו הרחבת התא NK המתוארים כאן מייצר התפשטות מהירה של תאים NK ללא הזדקנות השגת הרחבה 21,000 פי חציון 21 ימים.

Watch this Scientific Journal Video about Expansion, Purification, and Functional Assessment of Human Peripheral Blood NK Cells at JoVE.com

Expansion, Purification, and Functional Assessment of Human Peripheral Blood NK Cells

כאן אנו מתארים שיטה יעילה להרחיב ולטהר מספר גדול של תאים NK האדם להעריך את תפקידם.

הרחבה, טיהור, והערכה תפקודית של האדם תאים דם היקפיים NK

Natural killer (NK) cells play an important role in immune surveillance against a variety of infectious microorganisms and tumors. Limited availability of ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)

Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting FACS

טיהור אוכלוסייה תאים ספציפיים על ידי מיון פלואורסצנטי תא פעיל (FACS)

Experimental and clinical studies often require highly purified cell populations.  FACS is a technique of choice to purify cell populations of known ...

Expansion of Human Peripheral Blood  &gamma;&delta; T Cells using Zoledronate

Expansion of Human Peripheral Blood  ÃƒÅ½Ã‚Â³ÃƒÅ½Ã‚Â´ T Cells using Zoledronate

הרחבת דם היקפיים האדם γδ T תאים באמצעות Zoledronate

Human &gamma;&delta; T cells can recognize and respond to a wide variety of stress-induced antigens, thereby developing innate broad anti-tumor and ...

Antigens Protected Functional Red Blood Cells By The Membrane Grafting Of Compact Hyperbranched Polyglycerols

אנטיגנים מוגנים תאי דם אדומים פונקציונליים על ידי ההשתלה של ממברנה Polyglycerols Hyperbranched הקומפקטי

Red blood cell (RBC) transfusion is vital for the treatment of a number of acute and chronic medical problems such as thalassemia major and sickle cell ...

Detecting Glycogen in Peripheral Blood Mononuclear Cells with Periodic Acid Schiff Staining

גילוי גליקוגן בתאי הדם היקפי mononuclear עם תקופתי חומצה שיף מכתים

Periodic acid Schiff (PAS) staining is an immunohistochemical technique used on muscle biopsies and as a diagnostic tool for blood samples. ...

Generation of Human Alloantigen-specific T Cells from Peripheral Blood

דור של תאי T האנושי Alloantigen ספציפיים מהדם היקפי

The study of human T lymphocyte biology often involves examination of responses to activating ligands. T cells recognize and respond to processed peptide ...

Dextran Enhances the Lentiviral Transduction Efficiency of Murine and Human Primary NK Cells

לתוספי משפר את היעילות התמרה חושית Lentiviral של תאי NK העיקרי מאתר ואנושי

The efficient transduction of specific genes into natural killer (NK) cells has been a major challenge. Successful transductions are critical to defining ...

A Flow Cytometry-Based Cytotoxicity Assay for the Assessment of Human NK Cell Activity

וזמינותו Cytotoxicity מבוססי Cytometry זרימה להערכה של פעילות תאי NK אנושי

Within the innate immune system, effector lymphocytes known as natural killer (NK) cells play an essential role in host defense against aberrant cells, ...

Assessment of the Synaptic Interface of Primary Human T Cells from Peripheral Blood and Lymphoid Tissue

הערכה של הממשק סינפטית של תאי T האנושי העיקרי של דם היקפיים ורקמות הלימפה

The current understanding of the dynamics and structural features of T-cell synaptic interfaces has been largely determined through the use of ...

Generation of Knock-out Primary and Expanded Human NK Cells Using Cas9 Ribonucleoproteins

דור של תאים מעלף העיקרי ומורחבת NK האנושי באמצעות Cas9 Ribonucleoproteins

CRISPR/Cas9 technology is accelerating genome engineering in many cell types, but so far, gene delivery and stable gene modification have been challenging ...

Flotation-Based T Cell Isolation, Activation, and Expansion from Human Peripheral Blood Mononuclear Cell Samples Using Microbubbles

בידוד, הפעלה והרחבה של תאי T מבוססי ציפה מדגימות תאי דם חד-גרעיניים היקפיים אנושיים באמצעות מיקרו-בועות

The process of isolating T cells from peripheral blood mononuclear&#160;cells (PBMCs) to establish ex vivo cultures is crucial for research, clinical ...