Name: intravital microscopy of the inguinal lymph node
Uploaded: 2011-04-04T11:00:00
Duration: 7 min 34 s
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Este trabalho é financiado pelos Institutos Canadenses de Pesquisa em Saúde, Fundação Canadense para Inovação, University of British Columbia Centre for Research Blood and University of Northern BC.

1. Preparação do Reagente <ol><li> Reagentes para ser usado durante todo o experimento deve ser preparado antes de iniciar o protocolo cirúrgico. Note-se que todas as soluções foram feitas utilizando técnica estéril. </li><li> Solução salina fisiológica (PSS) é o melhor preparado em dois componentes: solução de sal básica e solução de bicarbonato de sódio. Prepare as duas soluções em 20X de concentração e armazenar a 4 ° C. Bicarbonato de sódio a 20X é 360.0mM NaHCO 3 (84.01g/mol) e solução de sal básica em 20X concentração é 2638.0mM NaCl (58.44g/mol), 94.0mM KCl (74.56g/mol), 40.0mM CaCl 2 • 2H 2 O (147.02g/mol), e 23,4 mm MgSO 4 • 7H 2 O (246.48g/mol). As soluções devem ser preparadas de dH 2 O e produtos químicos devem ser adicionados um de cada vez e agitado até que a solução é clara antes de adicionar o produto químico próxima </li><li> Prepare 2L de PSS diluindo volumes iguais de bicarbonato de sódio e solução de sal básica e diluir para 1X concentração (por duas 2L de PSS diluir 100mL de cada solução de bicarbonato de sódio e sal básico em dH 2 O </li><li> Lugar balão volumétrico de 2L contendo PSS e PSS em 37 ° C banho-maria. Equilibrar a solução com 5% de CO 2 / gás nitrogênio equilíbrio para 1hr antes do início do procedimento cirúrgico. </li><li> Produtos químicos vasoativas (ex. fenilefrina, acetilcolina, nitroprussiato de sódio) são mais bem preparados na concentração de 1M em dH2O e armazenados em 100μl alíquotas a -20 ° C. </li></ol> 2. Preparação dos animais <ol><li> Determinar o peso do mouse e administrar a dose inicial de pentobarbital sódico a 90mg/kg por via intraperitoneal. Durante todo o processo o mouse é continuamente monitorado para avião anestesia via pinch dedo do pé e um exame cuidadoso da freqüência respiratória. Injeções adicionais de pentobarbital sódico deve ser administrado conforme a necessidade de 20mg/kg de manter plano de anestesia. O plano cirúrgico de anestesia é mantida de acordo com os regulamentos federais e institucionais, conforme descrito no protocolo de atendimento de animais aprovado pelo Comitê Animal Care e Use (ACUC) da Universidade do Norte do BC. </li><li> Remover os pêlos da região abdominal e flanco / hip pela máquina de barbear. Remover restantes cabelo solto por gaze com álcool e acariciando a área com fita adesiva. Isto é suficiente como este procedimento experimental é terminal. </li><li> Posicione o mouse em uma placa clara cirúrgica em posição supina e anexe o mouse para a placa gravando cada pata para o conselho. Temperatura corporal é mantida através de uma lâmpada de calor externo e monitorados via termômetro retal para garantir que a hipotermia não ocorre como resultado de anestésico. </li></ol> 3. Procedimento Cirúrgico <ol><li> Durante todo o procedimento cirúrgico garantir tecido exposto é sempre mantido superfused com solução equilibrada PSS aquecido. Também é importante nunca fazer o contato com a vasculatura de interesse com instrumentos cirúrgicos ou ferir os vasos, colocando a força muito sobre eles através da manipulação de tecido adiposo e tecido conjuntivo em torno deles. </li><li> Posicione o mouse no âmbito de dissecação. Faça uma incisão na linha média ao longo da superfície ventral da cavidade abdominal e retrair a pele para a coluna vertebral do rato. </li><li> Quando a pele é retirada para que a LN é facilmente visível, o pino da pele em um pedestal de Sylgard transparente 184. </li><li> Remover a fina camada de tecido conjuntivo sobrepondo a área ao redor do LN </li><li> Clara a sobreposição de tecido adiposo e cercam o nó de linfa até o leito microvascular está exposto. O principal segmento arterial estabelece adjacente ao LN e é comumente sobrepostos pela vênula. Toda a cirurgia demora cerca de 30 minutos. </li></ol> 4. Análise de imagem e navio <ol><li> Uma vez que o segmento de interesse navio está exposta no âmbito de dissecação, assegurar a preparação no microscópio intravital. Note-se que animal permanece no conselho claro cirúrgica, enquanto no microscópio intravital durante toda a duração do experimento. A temperatura corporal é mantida através de lâmpada de calor e medido através de termômetro retal, conforme descrito durante a seção cirúrgica. O avião anestesia também é monitorada durante todo o experimento como descrito na seção 2.1. </li><li> Configure o superfusão e linhas de sucção. Superfusão do PSS ocorre por alimentação por gravidade a partir de um reservatório, no reservatório jaqueta de água aquecida (a jaqueta de água é distribuída e aquecida pelo banho de água circulante) de perfundidos por 5% de nitrogênio CO 2 equilibrado, e para baixo uma linha de gotejamento a uma taxa de 10ml / min. A linha de sucção deve ser usado para continuar a puxar PSS superfused longe da preparação. Note-se que antes do experimento as linhas de sucção e uma jaqueta de água são cuidadosamente limpos e armazenados após cada experimento. Isso garante a esterilidade antes do próximo experimento. </li><li> Verifique a temperatura do PSS superfusing. Ajustar a temperatura docirculando banho de água e / ou a taxa de superfusão PSS para atingir uma temperatura de ~ 37 ° C em toda a preparação. </li><li> Permitir a vasculatura para equilibrar com PSS para pelo menos 60 minutos e quantificar o diâmetro do vaso usando o paquímetro de vídeo. Tipicamente, o diâmetro dos vasos deve ser determinada em vários pontos (por exemplo, em 40, 50 e 60 minutos) para garantir que o navio tenha estabilizado. </li><li> Avaliar a saúde do navio usando um agonista do músculo liso específica (ex. Fenilefrina, PE) e um agonista endotélio específico (ex. acetilcolina, ACh). Concentração de agonista deve ser ajustada dependendo do agonista, mas para PE e Ach o navio deve ser avaliado em cada concentração pela adição cumulativa (10-5M a 10-9M) para o superfusate. Cada aplicação agonista devem ser separados por uma fase de lavagem (normalmente 30 minutos) usando PSS, até o navio retorna ao diâmetro de descanso. </li><li> Após a avaliação da saúde dos vasos, após uso de drogas vasoativas, rotulagem fluorescentes e rastreamento de células experimentos podem ser realizados. </li><li> Após o final do experimento o animal recebe uma overdose de pentobarbital sódico. O animal é então monitorado para garantir que não há resposta para beliscar dedo do pé e falta de movimento respiratório ou batimentos cardíacos. Nesse momento esse é seguido por deslocamento cervical. </li></ol> 5. Resultados representativos: Após o período de equilíbrio a preparação deve resultar em uma imagem clara que permite a identificação de ambos os arteríola e vênula que abastece o nó de linfa inguinal. Deve haver células adiposas mínima em torno dos vasos para permitir paredes da arteríola e vênula ser claramente observado para as pinças de vídeo para ser sobreposta para calcular o diâmetro dos vasos. O ponto de integrante de uma preparação bem sucedida é a arteríola tem um rico suprimento de sangue em movimento através da luz e que há um grau significativo de tom vascular (isto é, a arteríola tem a capacidade de vasoconstrição e dilatam de músculo liso e endoteliais agonistas específicos, respectivamente) . <img src="/files/ftp_upload/2551/2551fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1. Imagem de microscopia intravital de linfonodo inguinal alimentar arteríola (seta vermelha) alimentando o linfonodo equilibrada com solução salina fisiológica e correr ao lado do principal vênula (seta verde). <img src="/files/ftp_upload/2551/2551fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2. Vasoativas resposta normal à fenilefrina superfused (PE) pela adição cumulativa de soro fisiológico a partir das concentrações 10 M -9 a 10 -5 M. A presença de uma vasoconstrição robusta é sugestivo de função muscular normal liso presente na arteríola. <img src="/files/ftp_upload/2551/2551fig3.jpg" alt="Figura 3"/> Figura 3. Vasoativas resposta normal à acetilcolina superfused (ACh) pela adição cumulativa de soro fisiológico das concentrações de 10 M -9 a 10 -5 M. A presença de uma vasodilatação robusta é sugestiva de apresentar função normal endotelial na arteríola.

<ol>
	<li>Bearden, S. E., Payne, G. W., Chisty, A., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arteriolar+network+architecture+and+vasomotor+function+with+ageing+in+mouse+gluteus+maximus+muscle.">Arteriolar network architecture and vasomotor function with ageing in mouse gluteus maximus muscle.</a> J Physiol. 561, 535-545 (2004).</li><li>Looft-Wilson, R. C., Payne, G. W., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connexin+expression+and+conducted+vasodilation+along+arteriolar+endothelium+in+mouse+skeletal+muscle.">Connexin expression and conducted vasodilation along arteriolar endothelium in mouse skeletal muscle.</a> J Appl Physiol. 97, 1152-1158 (2004).</li><li>Payne, G. W., Madri, J. A., Sessa, W. C., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histamine+inhibits+conducted+vasodilation+through+endothelium-derived+NO+production+in+arterioles+of+mouse+skeletal+muscle.">Histamine inhibits conducted vasodilation through endothelium-derived NO production in arterioles of mouse skeletal muscle.</a> Faseb J. 18, 280-286 (2004).</li><li>Smeda, J. S., Payne, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alterations+in+autoregulatory+and+myogenic+function+in+the+cerebrovasculature+of+Dahl+salt-sensitive+rats.">Alterations in autoregulatory and myogenic function in the cerebrovasculature of Dahl salt-sensitive rats.</a> Stroke. 34, 1484-1490 (2003).</li><li>de With, M. C., de Vries, A. M., Kroese, A. B., van der Heijden, E. P., Bleys, R. L., Segal, S. S., Kon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+anatomy+of+the+hamster+retractor+muscle+with+regard+to+its+microvascular+transfer.">Vascular anatomy of the hamster retractor muscle with regard to its microvascular transfer.</a> Eur Surg Res. 42, 97-105 (2009).</li><li>Domeier, T. L., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electromechanical+and+pharmacomechanical+signalling+pathways+for+conducted+vasodilatation+along+endothelium+of+hamster+feed+arteries.">Electromechanical and pharmacomechanical signalling pathways for conducted vasodilatation along endothelium of hamster feed arteries.</a> J Physiol. 579, 175-186 (2007).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Microscopia intravital do linfonodo inguinal apresentado aqui fornece a capacidade de microvasculatura imagem do linfonodo in-vivo. Assim, facilita um meio de direta, a observação em tempo real. Imagem da microvasculatura LN é um site exclusivo que permite estudar a interface entre a resposta imune e da vasculatura. Usando essa preparação, o foco pode ser direcionado especificamente a resposta imune, alteração da vasculatura, ou a interação entre os dois. Tal como acontece com todas as abordagens experimentais, microscopia intravital padrão tem vantagens e limitações. IVM padrão, tais como a preparação descrito aqui, pode ser facilmente modificado, e tem sido demonstrado anteriormente pelos autores para permitir que a microscopia de epifluorescência através da introdução de corantes traçador fluorescente ou populações de células marcadas. Embora IVM norma não dá a possibilidade de três dimensional imagem e rastreamento, como seria dada por dois fótons de microscopia ou angiografia, rastreamento de celular ainda é realizado em duas dimensões permitindo célula a célula e interação célula-vasculatura a ser observados e quantificados e em conjunto com in-vivo administração e posterior coloração com anticorpos fluorescentes podem ser usados ​​para dar dados sobre proteína / marcador de expressão em tempo real. Nomeadamente, técnicas de imagem alternativas exigem um ambiente de estática para imagens; fixação da área cirúrgica ou a adição de uma lamela em um flat de preparação é frequentemente necessário. Isso limita, se não elimina, a capacidade de ativamente perfundir mediadores vascular ou outros sobre a preparação para avaliar a integridade vascular e fisiologia etc, ou o uso de outras técnicas, tais como vasodilatação experimentos realizados no preparo IVM. Além disso, o padrão IVM não exige uma preparação totalmente plana e não é afetado pelo movimento, como o gerado pela respiração do animal. Isto permite IVM padrão a ser usado em mais áreas cirúrgicas com maior reprodutibilidade. Isto é exemplificado pela preparação de linfonodo inguinal descrita aqui. Dado o tamanho ea forma do nó de linfa, a preparação não pode ser feita plana sem ferir o tecido ea localização do nó dá origem ao movimento significativo devido à respiração animal. Questões como seria difícil de superar por outros métodos, mas são facilmente tratada com a preparação IVM padrão descrito. Em resumo, a preparação detalhada acima podem ser combinadas com qualquer número de outras bioquímicas, vasculares e / ou técnicas imunológicas, tais como transferência de subconjuntos de ativado ou células marcadas, a indução de hipóxia, e sobre-expressão do esgotamento de mediadores vasculares. No entanto, as aplicações adicionais são dependentes da saúde da preparação inicial. Portanto, é vital para sempre testar a saúde da vasculatura sendo fotografada e avaliada. Pontos chave para conseguir uma preparação de saúde estão garantindo a preparação é constante perfundidos com PSS equilibrada a temperatura corporal e minimizando o contato e estresse colocado na área cirúrgica durante a cirurgia.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome do reagente </th><th> Companhia </th></tr><tr><td> Bicarbonato de sódio </td><td> Sigma Aldrich </td></tr><tr><td> Cloreto de sódio </td><td> Sigma Aldrich </td></tr><tr><td> Cloreto de Potássio </td><td> Sigma Aldrich </td></tr><tr><td> Cloreto de cálcio dihidratado </td><td> Sigma Aldrich </td></tr><tr><td> Nitroprussiato de sódio </td><td> Sigma Aldrich </td></tr><tr><td> Fenilefrina </td><td> Sigma Aldrich </td></tr><tr><td> Acetilcolina </td><td> Sigma Aldrich </td></tr><tr><td> Cloreto de magnésio hepta-hidratado </td><td> Sigma Aldrich </td></tr><tr><td> Sódio Pentobarbitol </td><td></td></tr></tbody></table>

intravital microscopy of the inguinal lymph node

Linfonodos (LN é), localizados em todo o corpo, são um componente integral do sistema imunológico. Eles servem como um local para indução de resposta imune adaptativa e, portanto, o desenvolvimento de células efetoras. Como tal, linfonodos são fundamentais para combater patógenos invasores e manter a saúde. A escolha do LN para estudar é ditada pela acessibilidade e o modelo desejado; o linfonodo inguinal é bem localizada e de fácil apóia estudos de modelos biologicamente relevantes de pele e infecção da mucosa genital. A LN inguinal, como todos os linfonodos, tem uma rede microvascular extensa fornecê-lo com sangue. Em geral, esta rede microvascular inclui a arteríola alimentação principal da LN que, posteriormente, ramos e alimenta alta vênulas endoteliais (VEH). VHE são especializados para facilitar o tráfico de células imunes para o LN durante tanto homeostase e infecção. Como HEVs regulam o tráfico no LN em ambas as circunstâncias é uma área de intensa exploração. A LN alimentar arteríola, tem influência direta sobre o montante HEVs e é a principal fonte de nutrientes e sangue rico em células do LN. Além disso, as mudanças na arteríola alimentar estão implicados no sentido de facilitar a indução da resposta imune adaptativa. A microvasculatura LN tem uma importância óbvia para manter um suprimento de sangue ótima para o LN e regular fluxo de células imunes para o LN, que são elementos cruciais na função LN adequada e resposta imune posteriormente. A capacidade de estudo da microvasculatura LN in vivo é a chave para elucidar como o sistema imunológico e da microvasculatura interagem e influenciam-se mutuamente dentro da LN. Aqui, apresentamos um método in vivo para a imagem do linfonodo inguinal. Nós nos concentramos em imagens da microvasculatura da LN, prestando particular atenção aos métodos que garantem o estudo dos vasos saudáveis, a capacidade de manter imagens de vasos viáveis ​​ao longo de um número de horas, e quantificação da magnitude do vaso. Métodos para a perfusão da microvasculatura com drogas vasoativas, bem como o potencial para rastrear e quantificar o tráfego celular também são apresentados. Microscopia intravital da LN inguinal permite avaliação direta da funcionalidade microvascular e em tempo real da interface direta entre células do sistema imunológico, o LN, e da microcirculação. Esta técnica potencial para ser combinada com técnicas imunológicas muitos e rotulagem de células fluorescentes, bem como manipulado para estudar vasculatura de linfonodos outros.

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Intravital Microscopy of the Inguinal Lymph Node

Uma técnica para a realização de microscopia intravital do linfonodo inguinal (LN) é descrito. Tal técnica permite em tempo real,<em&gt; In vivo</em&gt; Estudo da microvasculatura linfonodo e estrutura, tanto durante a homeostase e infecção. Esta técnica pode ser adaptada para estudos de células e tráfico para sites outro nó de linfa.

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