Name: high throughput microrna profiling: optimized multiplex qrt-pcr at nanoliter scale on the fluidigm dynamic arraytm ifcs
Uploaded: 2011-08-03T12:00:00
Duration: 7 min 27 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about High Throughput MicroRNA Profiling: Optimized Multiplex qRT-PCR at Nanoliter Scale on the Fluidigm Dynamic ArrayTM IFCs at JoVE.com

نود أن نشكر مختبر Blelloch عن التعليق على النص. وأيد هذا العمل من جانب صناديق لRB من المعاهد الوطنية للصحة (K08 NS48118 وNS057221 R01) ، معهد كاليفورنيا للطب التجديدي (CIRM) (المنحة البذور RS1 - 00161 ، ونيو جائزة كلية RN2 - 00906) ، وصندوق بيو الخيرية وزير الخارجية من Wissenschaftlich Urologische غزلشافت فولت.

<ol>
	<li>Mitchell, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+microRNAs+as+stable+blood-based+markers+for+cancer+detection.">Circulating microRNAs as stable blood-based markers for cancer detection.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 10513-10518 (2008).</li><li>Tang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=220-plex+microRNA+expression+profile+of+a+single+cell.">220-plex microRNA expression profile of a single cell.</a> Nat Protoc. 1, 1154-1159 (2006).</li><li>Gertsenstein, M., Vintersten, K., Behringer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual. 3, 644-645 (2003).</li><li>Suh, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+function+is+globally+suppressed+in+mouse+oocytes+and+early+embryos.">MicroRNA function is globally suppressed in mouse oocytes and early embryos.</a> Curr Biol. 20, 271-277 (2010).</li><li>Babiarz, J. E., Ruby, J. G., Wang, Y., Bartel, D. P., Blelloch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+ES+cells+express+endogenous+shRNAs,+siRNAs,+and+other+Microprocessor-independent,+Dicer-dependent+small+RNAs.">Mouse ES cells express endogenous shRNAs, siRNAs, and other Microprocessor-independent, Dicer-dependent small RNAs.</a> Genes Dev. 22, 2773-2785 (2008).</li><li>Babiarz, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+RNAs:+their+biogenesis,+regulation+and+function+in+embryonic+stem+cells.">Small RNAs: their biogenesis, regulation and function in embryonic stem cells.</a> StemBook. , (2009).</li><li>Friedman, R. C., Farh, K. K., Burge, C. B., Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Most+mammalian+mRNAs+are+conserved+targets+of+microRNAs.">Most mammalian mRNAs are conserved targets of microRNAs.</a> Genome Res. 19, 92-105 (2008).</li><li>Wang, Y., Medvid, R., Melton, C., Jaenisch, R., Blelloch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DGCR8+is+essential+for+microRNA+biogenesis+and+silencing+of+embryonic+stem+cell+self-renewal.">DGCR8 is essential for microRNA biogenesis and silencing of embryonic stem cell self-renewal.</a> Nat Genet. 39, 380-385 (2007).</li><li>Kanellopoulou, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dicer-deficient+mouse+embryonic+stem+cells+are+defective+in+differentiation+and+centromeric+silencing.">Dicer-deficient mouse embryonic stem cells are defective in differentiation and centromeric silencing.</a> Genes Dev. 19, 489-501 (2005).</li><li>Thomson, J. M., Parker, J., Perou, C. M., Hammond, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+custom+microarray+platform+for+analysis+of+microRNA+gene+expression.">A custom microarray platform for analysis of microRNA gene expression.</a> Nat Methods. 1, 47-53 (2004).</li><li>Moltzahn, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+based+multiplex+qRT-PCR+identifies+diagnostic+and+prognostic+microRNA+signatures+in+sera+of+prostate+cancer+patients.">Microfluidic based multiplex qRT-PCR identifies diagnostic and prognostic microRNA signatures in sera of prostate cancer patients.</a> Cancer Res. 71, 550-560 (2011).</li><li>Mestdagh, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+and+universal+method+for+microRNA+RT-qPCR+data+normalization.">A novel and universal method for microRNA RT-qPCR data normalization.</a> Genome Biol. 10, R64-R64 (2009).</li></ol>

آلان مير هو موظف في شركة Fluidigm. خلاف ذلك ، ليست لدينا مصالح مالية في الكشف عنها.

miRNAs قصيرة (18-24 النيوكليوتيدات) ، غير الترميز RNAs وميرنا ، التي تنظم التعبير الجيني في مرحلة ما بعد transcriptionally من قبل كل من الرنا الرسول زعزعة الاستقرار (مرنا) ، وتحول دون ترجمتها. 6 وحقيقة أن ما لا يقل عن ثلث الجينات البشرية تحتوي على الحفظ ملزمة مواقع في 3&#39;UTR والتفاعل واضحا من miRNAs مع الجينات للانتشار ، وموت الخلايا المبرمج تعدد القدرات تقترح مساهمة حاسمة في اتخاذ القرارات مصير الخلية ، الأنسجة والتوازن أمراض مثل السرطان. microRNA التعبير 6،7 دقيقة لذلك هي الملامح العريضة الفائدة. لاختبار متعددة نشرت qRT - PCR التنميط التعبير بروتوكول ميرنا 2 استخدمنا الصغيرة RNA MESC أنها مقصرة ضوابط السلبية. DGCR8 -- / -- تعاني من نقص خلايا جميع microRNAs الكنسي ، في حين أن المقامر -- / -- نقص خلايا micoRNAs الكنسي على حد سواء وعدم canoncial - 8،9 مقارنة مستويات في نوع البرية MES إلى DGCR8 -- / -- الخلايا ، وكشف لنا عدم وجود دقة وأعرب عن عدة لم يتم اكتشاف 10 microRNAs في الخلايا البرية من نوع 11. وأظهرت بعض حتى انخفاض مستويات التعبير النسبي للخلايا خروج المغلوب (الشكل 3A). افترضنا أنه قد يكون السبب في عدم مراعاة الدقة من قبل التمهيدي ضخمة تحمل أكثر من خطوتين متتاليتين متعددة (RT PCR وتمهيدي) قبل الكمي - RT singleplex. ومع ذلك ، متعددة قبل التضخيم ضروري لتحسين قوة الإشارة ، وخصوصا عندما يقتصر تركيز بدءا من الحمض النووي الريبي. بعيدا عن طريق تنقية قبل PCR المنتجات من الاشعال عن طريق الانتقاء في حجم المواد الهلامية بولي أكريلاميد الأصلي (الشكل 2) ، فإننا يمكن أن يبرهن على وجود تحسن كبير في الدقة عن طريق الكشف عن مزيد من microRNAs وفقدان اشارات ايجابية كاذبة في كل Dgcr8 -- / -- والمقامر -- / -- خلفيات (أرقام 3a و 3B) بالإضافة إلى تعديل qRT - PCR النهج سمح لتصنيف المناسبة النادرة Dgcr8 الرناوات المستقل / المقامر صغيرة تعتمد على (الشكل 3B) 11. بالتالي خطوة إضافية لتنقية الاشعال المفرط بعيدا عن المنتج قبل PCR هو مفيد بشكل واضح ، خاصة عند استخدام مجموعات كبيرة التمهيدي متعددة لكل عينة. يتم تحديد العدد الأمثل للدورات السابقة للتضخيم وفقا لتركيزات الحمض النووي الريبي الإدخال. وينبغي أن يسترشد على التوازن الذي لا يخضع لأو overamplify بواسطة تفاصيل تجربة محددة. مع أكثر من ألف microRNAs المعروفة ، واستخدام معيار 384 لوحات جيدا قد لا تكون الأمثل لالتنميط microRNA واسعة النطاق ، وخصوصا عندما تقارن عينات متعددة. Fluidigm مؤسسة التمويل الدولية في صفيف حيوية تمكن ، مع انخفاض كبير في عدد الخطوات اللازمة pipetting والكيمياء ، واختبار ما يصل الى 96 عينات الفرد من 96 microRNAs مختلفة في تجربة واحدة (9216 ردود فعل) على نطاق واسع نانولتر (6.7 NL). لكل تشغيل البرنامج يوفر تحليل المنحنيات التضخيم ، وخرائط الحرارة مرمزة والقيم عتبة دورة (CT). في وقت واحد على نطاق واسع التنميط يقلل الفروق التجريبية ، ويتيح التعبير يعني التطبيع قيمة ، والذي ينفذ خارج استراتيجيات التطبيع الأخرى التي تجعل من استخدام الضوابط RNA الصغيرة (12). بالمقارنة مع 384 منصات متوفرة تجاريا جيدا مع تحقيقات TaqMan قبل تعيينه ، فإن الجمع بين منصة عالية الإنتاجية التنميط مع مجموعات التمهيدي مصنوعة خصيصا يوفر مرونة عالية التجريبية. والأمثل متعددة qRT - PCR النهج في تركيبة مع منصة صفيف الحيوي يسمح بنجاح الشاشة في وقت واحد منا أن 48 مريض السرطان الأمصال البروستاتا لإحداث تغييرات في مستويات من 384 ميرنا (الشكل 4) وتطبيع البيانات دون زيادة كبيرة في التحكم (أي الاصطناعية microRNAs). 11 على الرغم من الزيادة من الخطوات من العينات تمهيدا لنتائج التنميط ، والنهج صفها هو الوقت والتكلفة الفعالة أسلوب إنتاجية عالية إلى ملف مجموعات عينة كبيرة لمستويات التعبير ميرنا ، حتى مع محدودية المواد البداية.

high throughput microrna profiling: optimized multiplex qrt-pcr at nanoliter scale on the fluidigm dynamic arraytm ifcs

وقد أدى تدخل واسع من العمليات الحرجة في miRNAs الكامنة التنمية ، والأنسجة homoeostasis المرض إلى اهتمام المتزايد بين المجتمعات والبحوث الدوائية. لدراسة miRNAs ، فمن الضروري أن القياس الكمي لمستويات microRNA دقيقة وقوية. بمقارنة البرية من نوع خلايا الحمض النووي الريبي للمشاريع الصغيرة الجذعية الجنينية ناقصة (مسك) ، وكشف لنا عدم وجود دقة ومتانة في السابق نشر تقنيات متعددة qRT - PCR. هنا ، نحن تصف أسلوب الأمثل ، بما في ذلك تنقية بعيدا الاشعال المفرط من الخطوات السابقة قبل الكشف المتعدد singleplex الوقت الحقيقي ، مما يزيد بشكل كبير من دقة ومتانة الأسلوب. علاوة على ذلك ، يمكننا أن نفسر كيف يؤدون هذه التقنية على رقاقة ميكروفلويديك في أحجام نانولتر يقلل كثيرا من تكاليف كاشف وسمح الوقت فعالة ميرنا إنتاجية عالية التنميط التعبير.

Watch this Scientific Journal Video about High Throughput MicroRNA Profiling: Optimized Multiplex qRT-PCR at Nanoliter Scale on the Fluidigm Dynamic ArrayTM IFCs at JoVE.com

High Throughput MicroRNA Profiling: Optimized Multiplex qRT-PCR at Nanoliter Scale on the Fluidigm Dynamic ArrayTM IFCs

نحن هنا تصف عكس متعددة الأمثل المنتسخة PCR الكمي (qRT - PCR) بروتوكول بالاشتراك مع منصة ميكروفلويديك من حيث التكلفة والوقت أداة فعالة الفرز الفائق الإنتاجية للmicroRNA (ميرنا) مستويات التعبير ، وخاصة عند العمل مع كميات محدودة من العينة.

ارتفاع جانبي MicroRNA المناولة : ملتيبليكس محسن qRT - PCR على مقياس نانولتر في المحفل Fluidigm ArrayTM الحيوي

The broad involvement of miRNAs in critical processes underlying development, tissue homoeostasis and disease has led to a surging interest among the ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Cell-based Calcium Assay for Medium to High Throughput Screening of TRP Channel Functions using FlexStation 3

الخلية المستندة إلى الفحص الكالسيوم لمتوسطة إلى فحص وظائف إنتاجية عالية باستخدام قناة الحزب FlexStation 3

The Molecular Devices' FlexStation 3 is a benchtop multi-mode microplate reader capable of automated fluorescence measurement in multi-well plates.  It is ...

Candida albicans Biofilm Chip (CaBChip) for High-throughput Antifungal Drug Screening

Candida albicans Biofilm Chip CaBChip for High-throughput Antifungal Drug Screening

المبيضات البيض بيوفيلم رقاقة (كاليفورنيا BChip) لالفرز الفائق الإنتاجية مضاد للمخدرات

Candida  albicans remains the main etiological agent of candidiasis, which  currently represents the fourth most common nosocomial bloodstream infection ...

High-throughput Protein Expression Generator Using a Microfluidic Platform

عالية الإنتاجية مولد بروتين تعبير باستخدام منصة ميكروفلويديك

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and ...

Synthetic Spider Silk Production on a Laboratory Scale

الاصطناعية إنتاج حرير العنكبوت على نطاق المختبر

As society progresses and resources become scarcer, it is becoming increasingly important to cultivate new technologies that engineer next generation ...

Cloning and Large-Scale Production of High-Capacity Adenoviral Vectors Based on the Human Adenovirus Type 5

الاستنساخ واسع النطاق إنتاج ذات قدرة عالية ناقلات الفيروسة الغدانية استنادا إلى نوع اتش 5 الإنسان

High-capacity adenoviral vectors (HCAdV) devoid of all viral coding sequences represent one of the most advanced gene delivery vectors due to their high ...

Describing a Transcription Factor Dependent Regulation of the MicroRNA Transcriptome

واصفا تنظيم النسخ عامل تابع للالرنا الميكروي Transcriptome على

While the transcription regulation of protein coding genes was extensively studied, little is known on how transcription factors are involved in ...

Easy and Accurate Mechano-profiling on Micropost Arrays

سهلة ودقيقة والميكانيكية التنميط على Micropost صالحة

Cell culture substrates with integrated flexible microposts enable a user to study the mechanical interactions between cells and their immediate ...

Using Tomoauto: A Protocol for High-throughput Automated Cryo-electron Tomography

باستخدام Tomoauto: بروتوكول لإنتاجية عالية الآلي البرد الإلكترون التصوير المقطعي

Cryo-electron tomography (Cryo-ET) is a powerful three-dimensional (3-D) imaging technique for visualizing macromolecular complexes in their native ...

A High-throughput Cell Microarray Platform for Correlative Analysis of Cell Differentiation and Traction Forces

وإنتاجية عالية منصة ميكروأري الخليوي لتحليل مترابط من تمايز الخلايا وقوات الجر

Microfabricated cellular microarrays, which consist of contact-printed combinations of biomolecules on an elastic hydrogel surface, provide a tightly ...

Power Input Measurements in Stirred Bioreactors at Laboratory Scale

قياسات الطاقة الإدخال في المفاعلات الحيوية المقلبة في المختبرات

The power input in stirred bioreactors is an important scaling-up parameter and can be measured through the torque that acts on the impeller shaft during ...