Name: high throughput microrna profiling: optimized multiplex qrt-pcr at nanoliter scale on the fluidigm dynamic arraytm ifcs
Uploaded: 2011-08-03T12:00:00
Duration: 7 min 27 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about High Throughput MicroRNA Profiling: Optimized Multiplex qRT-PCR at Nanoliter Scale on the Fluidigm Dynamic ArrayTM IFCs at JoVE.com

We willen de Blelloch lab bedanken voor commentaar op de tekst. Dit werk werd ondersteund door fondsen aan RB van de NIH (K08 NS48118 en R01 NS057221), California Institute of Regeneratieve Geneeskunde (CIRM) (Seed Grant RS1-00161, New Faculty Award RN2-00.906) en de Pew Charitable Trust en FM uit de Wissenschaftlich Urologische Gesellschaft eV.

<ol>
	<li>Mitchell, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+microRNAs+as+stable+blood-based+markers+for+cancer+detection.">Circulating microRNAs as stable blood-based markers for cancer detection.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 10513-10518 (2008).</li><li>Tang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=220-plex+microRNA+expression+profile+of+a+single+cell.">220-plex microRNA expression profile of a single cell.</a> Nat Protoc. 1, 1154-1159 (2006).</li><li>Gertsenstein, M., Vintersten, K., Behringer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual. 3, 644-645 (2003).</li><li>Suh, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+function+is+globally+suppressed+in+mouse+oocytes+and+early+embryos.">MicroRNA function is globally suppressed in mouse oocytes and early embryos.</a> Curr Biol. 20, 271-277 (2010).</li><li>Babiarz, J. E., Ruby, J. G., Wang, Y., Bartel, D. P., Blelloch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+ES+cells+express+endogenous+shRNAs,+siRNAs,+and+other+Microprocessor-independent,+Dicer-dependent+small+RNAs.">Mouse ES cells express endogenous shRNAs, siRNAs, and other Microprocessor-independent, Dicer-dependent small RNAs.</a> Genes Dev. 22, 2773-2785 (2008).</li><li>Babiarz, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+RNAs:+their+biogenesis,+regulation+and+function+in+embryonic+stem+cells.">Small RNAs: their biogenesis, regulation and function in embryonic stem cells.</a> StemBook. , (2009).</li><li>Friedman, R. C., Farh, K. K., Burge, C. B., Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Most+mammalian+mRNAs+are+conserved+targets+of+microRNAs.">Most mammalian mRNAs are conserved targets of microRNAs.</a> Genome Res. 19, 92-105 (2008).</li><li>Wang, Y., Medvid, R., Melton, C., Jaenisch, R., Blelloch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DGCR8+is+essential+for+microRNA+biogenesis+and+silencing+of+embryonic+stem+cell+self-renewal.">DGCR8 is essential for microRNA biogenesis and silencing of embryonic stem cell self-renewal.</a> Nat Genet. 39, 380-385 (2007).</li><li>Kanellopoulou, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dicer-deficient+mouse+embryonic+stem+cells+are+defective+in+differentiation+and+centromeric+silencing.">Dicer-deficient mouse embryonic stem cells are defective in differentiation and centromeric silencing.</a> Genes Dev. 19, 489-501 (2005).</li><li>Thomson, J. M., Parker, J., Perou, C. M., Hammond, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+custom+microarray+platform+for+analysis+of+microRNA+gene+expression.">A custom microarray platform for analysis of microRNA gene expression.</a> Nat Methods. 1, 47-53 (2004).</li><li>Moltzahn, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+based+multiplex+qRT-PCR+identifies+diagnostic+and+prognostic+microRNA+signatures+in+sera+of+prostate+cancer+patients.">Microfluidic based multiplex qRT-PCR identifies diagnostic and prognostic microRNA signatures in sera of prostate cancer patients.</a> Cancer Res. 71, 550-560 (2011).</li><li>Mestdagh, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+and+universal+method+for+microRNA+RT-qPCR+data+normalization.">A novel and universal method for microRNA RT-qPCR data normalization.</a> Genome Biol. 10, R64-R64 (2009).</li></ol>

Alan Mir is een medewerker van Fluidigm Corporation. Anders hebben we geen financiële belangen openbaar te maken.

miRNAs zijn kort (18-24 nucleotiden), niet-coderende RNA&#39;s, die genexpressie reguleren post-transcriptie door zowel destabiliserende messenger RNA (mRNA) en het remmen van de vertaling. 6 Het feit dat ten minste een derde van de menselijke genen bevatten geconserveerd miRNA binding-sites in hun 3&#39;UTR en de duidelijke interacties van miRNAs met de genen voor pluripotentie, proliferatie en apoptose suggereert een belangrijke bijdrage in cel beslissingen over het lot, weefsel homeostase en ziekten zoals kanker. 6,7 daarom nauwkeurig microRNA expressie profielen van brede rente. Voor het testen van de gepubliceerde multiplex-PCR qRT miRNA expressie profilering protocol 2 gebruikten we kleine RNA tekort Mesc als negatieve controles. DGCR8 - / - cellen een tekort van alle canonieke microRNA&#39;s, terwijl de Dicer - / -. Cellen missen zowel canoniek en niet-canoncial micoRNAs 8,9 Het vergelijken van het niveau in wild-type MES-to DGCR8 - / - cellen, hebben we ontdekt een gebrek aan nauwkeurigheid als verschillende uitgedrukt 10 microRNA&#39;s werden niet gedetecteerd in het wild-type cellen 11. Sommigen toonden lagere expressie niveaus ten opzichte van de knockout cellen (figuur 3a). Onze hypothese was dat het gebrek aan nauwkeurigheid kan worden veroorzaakt door de massale primer overdracht van de twee opeenvolgende multiplex stappen (RT en Pre-PCR), voordat singleplex RT-kwantificering. Echter, multiplex voorversterking nodig is om de signaalsterkte te verbeteren, met name bij concentratie van het RNA is beperkt. Door het zuiveren van weg te pre-PCR-producten van de primers op grootte selecteren voor de inheemse polyacrylamidegels (figuur 2), konden we een aanzienlijke verbetering in nauwkeurigheid aan te tonen door het detecteren meer microRNA&#39;s en een verlies van vals-positieve signalen in zowel Dgcr8 - / - en Dicer - / - achtergronden (figuren 3a en 3b) Naast de gewijzigde qRT-PCR benadering toegestaan ​​voor de juiste indeling van zeldzame Dgcr8 onafhankelijke / Dicer afhankelijk van kleine RNA&#39;s (figuur 3b) 11. Daarom is een extra stap te veel primers te zuiveren uit de buurt van pre-PCR-product is duidelijk voordeel, vooral bij gebruik van grote multiplex primer sets per monster. Het optimale aantal voorversterking cycli wordt bepaald door de input RNA-concentraties. Het saldo aan niet onder-of overamplify moeten worden geleid door de bijzonderheden van de specifieke experiment. Met meer dan duizend bekende microRNA&#39;s, gebruik van standaard 384-well platen is mogelijk niet optimaal voor uitgebreide microRNA profileren, vooral bij het vergelijken van meerdere monsters. De Fluidigm Dynamic Array IFC mogelijk maakt, met een significante afname van het pipetteren stappen en benodigde chemie, testen tot en met 96 individuele monsters tegen 96 verschillende microRNA&#39;s in een enkel experiment (9216 reacties) op nanoliter schaal (6,7 nL). Bij elke rit moet de analyse-software biedt versterking curven, kleurgecodeerde heat maps en fietsen drempelwaarden (Ct). De gelijktijdige grootschalige profilering vermindert de experimentele afwijkingen en maakt het mogelijk voor de gemiddelde waarde van expressie normalisatie, die uit-voert andere normalisatie strategieën die gebruik maken van kleine RNA-controles te maken. 12 In vergelijking met commercieel verkrijgbare 384 goed platforms met vooraf toegewezen TaqMan probes, de combinatie van een high-throughput profilering platform met custom-made primer sets biedt een hoge experimentele flexibiliteit. De geoptimaliseerde multiplex-PCR qRT aanpak in combinatie met het Dynamic Array platform met succes konden we 48 prostaatkanker patiënt sera gelijktijdig screenen op veranderingen in de niveaus van 384 miRNA (figuur 4) en om gegevens te normaliseren zonder de piek in de controles (dat wil zeggen synthetische microRNA&#39;s). 11 Ondanks de toename van de stappen van monsters voorbereiding tot profilering resultaten, de beschreven aanpak is een tijd-en kosten-effectieve high throughput methode om grote sample sets profiel van miRNA expressie niveaus, zelfs met beperkte uitgangsmateriaal.

high throughput microrna profiling: optimized multiplex qrt-pcr at nanoliter scale on the fluidigm dynamic arraytm ifcs

De brede betrokkenheid van miRNAs in kritieke processen ten grondslag liggen aan de ontwikkeling, weefsel homoeostasis en ziekten heeft geleid tot een stijgende belangstelling onder de onderzoeks-en farmaceutische gemeenschappen. Voor het bestuderen van miRNAs, is het essentieel dat de kwantificering van microRNA niveaus is nauwkeurig en robuust. Door het vergelijken van wild-type tot kleine RNA-deficiënte muis embryonale stamcellen (Mesc), hebben we onthulde een gebrek aan nauwkeurigheid en robuustheid in de voorgaande gepubliceerd multiplex qRT-PCR technieken. We beschrijven hier een geoptimaliseerde methode, met inbegrip zuiveren weg overmatig primers van de vorige multiplex stappen voordat singleplex real-time detectie, die drastisch verhoogt de nauwkeurigheid en robuustheid van de techniek. Verder leggen we uit hoe het uitvoeren van de techniek op een microfluïdische chip op nanoliter volumes aanzienlijk vermindert reagens kosten en maakt het mogelijk de tijd effectief high throughput miRNA expressie profilering.

Watch this Scientific Journal Video about High Throughput MicroRNA Profiling: Optimized Multiplex qRT-PCR at Nanoliter Scale on the Fluidigm Dynamic ArrayTM IFCs at JoVE.com

High Throughput MicroRNA Profiling: Optimized Multiplex qRT-PCR at Nanoliter Scale on the Fluidigm Dynamic ArrayTM IFCs

Hier beschrijven we een geoptimaliseerde multiplex reverse transcriptase kwantitatieve PCR (qRT-PCR)-protocol in combinatie met een microfluïdisch platform als een kost en tijd efficiënte high-throughput screening tool voor microRNA (miRNA) expressie niveaus, in het bijzonder bij het werken met beperkte hoeveelheden van het monster.

High Throughput MicroRNA Profiling: Geoptimaliseerd Multiplex qRT-PCR op nanoliter Schaalverdeling op de Fluidigm Dynamic ArrayTM IFCS

The broad involvement of miRNAs in critical processes underlying development, tissue homoeostasis and disease has led to a surging interest among the ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Cell-based Calcium Assay for Medium to High Throughput Screening of TRP Channel Functions using FlexStation 3

Cel-gebaseerde Calcium Assay voor medium tot hoge throughput screening van TRP Channel functies met behulp van FlexStation 3

The Molecular Devices' FlexStation 3 is a benchtop multi-mode microplate reader capable of automated fluorescence measurement in multi-well plates.  It is ...

Candida albicans Biofilm Chip (CaBChip) for High-throughput Antifungal Drug Screening

Candida albicans Biofilm Chip CaBChip for High-throughput Antifungal Drug Screening

Candida albicans Biofilm Chip (Ca BChip) voor high-throughput antimycoticum Screening

Candida  albicans remains the main etiological agent of candidiasis, which  currently represents the fourth most common nosocomial bloodstream infection ...

High-throughput Protein Expression Generator Using a Microfluidic Platform

High-throughput eiwit expressie Generator Met behulp van een Microfluïdische Platform

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and ...

Synthetic Spider Silk Production on a Laboratory Scale

Synthetische Spider Silk Production op laboratoriumschaal

As society progresses and resources become scarcer, it is becoming increasingly important to cultivate new technologies that engineer next generation ...

Cloning and Large-Scale Production of High-Capacity Adenoviral Vectors Based on the Human Adenovirus Type 5

Klonen en grootschalige productie van hoge capaciteit adenovirale vectoren op basis van de menselijke adenovirus type 5

High-capacity adenoviral vectors (HCAdV) devoid of all viral coding sequences represent one of the most advanced gene delivery vectors due to their high ...

Describing a Transcription Factor Dependent Regulation of the MicroRNA Transcriptome

Het beschrijven van een transcriptiefactor Afhankelijk verordening van het MicroRNA Transcriptome

While the transcription regulation of protein coding genes was extensively studied, little is known on how transcription factors are involved in ...

Easy and Accurate Mechano-profiling on Micropost Arrays

Gemakkelijk en nauwkeurig voor mechanische profilering op MicroPOST Arrays

Cell culture substrates with integrated flexible microposts enable a user to study the mechanical interactions between cells and their immediate ...

Using Tomoauto: A Protocol for High-throughput Automated Cryo-electron Tomography

Met behulp van Tomoauto: Een protocol voor High-throughput Automated Cryo-electron tomography

Cryo-electron tomography (Cryo-ET) is a powerful three-dimensional (3-D) imaging technique for visualizing macromolecular complexes in their native ...

A High-throughput Cell Microarray Platform for Correlative Analysis of Cell Differentiation and Traction Forces

Een High-throughput Cell Microarray Platform voor Correlatieve Analyse van de Cel Differentiatie en trekkrachten

Microfabricated cellular microarrays, which consist of contact-printed combinations of biomolecules on an elastic hydrogel surface, provide a tightly ...

Power Input Measurements in Stirred Bioreactors at Laboratory Scale

De Input metingen van de macht in Stirred bioreactoren op laboratoriumschaal

The power input in stirred bioreactors is an important scaling-up parameter and can be measured through the torque that acts on the impeller shaft during ...