Name: high throughput microrna profiling: optimized multiplex qrt-pcr at nanoliter scale on the fluidigm dynamic arraytm ifcs
Uploaded: 2011-08-03T12:00:00
Duration: 7 min 27 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about High Throughput MicroRNA Profiling: Optimized Multiplex qRT-PCR at Nanoliter Scale on the Fluidigm Dynamic ArrayTM IFCs at JoVE.com

ברצוננו להודות מעבדה Blelloch עבור להעיר על הטקסט. עבודה זו נתמכה על ידי קרנות RB מ-NIH (K08 NS48118 ו R01 NS057221), קליפורניה המכון לרפואה הרגנרציה (CIRM) (Seed גרנט RS1-00161, פרס הפקולטה חדש RN2-00906) ואת האמון Pew Charitable ו-FM מן Wissenschaftlich Urologische Gesellschaft eV.

<ol>
	<li>Mitchell, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+microRNAs+as+stable+blood-based+markers+for+cancer+detection.">Circulating microRNAs as stable blood-based markers for cancer detection.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 10513-10518 (2008).</li><li>Tang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=220-plex+microRNA+expression+profile+of+a+single+cell.">220-plex microRNA expression profile of a single cell.</a> Nat Protoc. 1, 1154-1159 (2006).</li><li>Gertsenstein, M., Vintersten, K., Behringer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual. 3, 644-645 (2003).</li><li>Suh, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+function+is+globally+suppressed+in+mouse+oocytes+and+early+embryos.">MicroRNA function is globally suppressed in mouse oocytes and early embryos.</a> Curr Biol. 20, 271-277 (2010).</li><li>Babiarz, J. E., Ruby, J. G., Wang, Y., Bartel, D. P., Blelloch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+ES+cells+express+endogenous+shRNAs,+siRNAs,+and+other+Microprocessor-independent,+Dicer-dependent+small+RNAs.">Mouse ES cells express endogenous shRNAs, siRNAs, and other Microprocessor-independent, Dicer-dependent small RNAs.</a> Genes Dev. 22, 2773-2785 (2008).</li><li>Babiarz, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+RNAs:+their+biogenesis,+regulation+and+function+in+embryonic+stem+cells.">Small RNAs: their biogenesis, regulation and function in embryonic stem cells.</a> StemBook. , (2009).</li><li>Friedman, R. C., Farh, K. K., Burge, C. B., Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Most+mammalian+mRNAs+are+conserved+targets+of+microRNAs.">Most mammalian mRNAs are conserved targets of microRNAs.</a> Genome Res. 19, 92-105 (2008).</li><li>Wang, Y., Medvid, R., Melton, C., Jaenisch, R., Blelloch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DGCR8+is+essential+for+microRNA+biogenesis+and+silencing+of+embryonic+stem+cell+self-renewal.">DGCR8 is essential for microRNA biogenesis and silencing of embryonic stem cell self-renewal.</a> Nat Genet. 39, 380-385 (2007).</li><li>Kanellopoulou, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dicer-deficient+mouse+embryonic+stem+cells+are+defective+in+differentiation+and+centromeric+silencing.">Dicer-deficient mouse embryonic stem cells are defective in differentiation and centromeric silencing.</a> Genes Dev. 19, 489-501 (2005).</li><li>Thomson, J. M., Parker, J., Perou, C. M., Hammond, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+custom+microarray+platform+for+analysis+of+microRNA+gene+expression.">A custom microarray platform for analysis of microRNA gene expression.</a> Nat Methods. 1, 47-53 (2004).</li><li>Moltzahn, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+based+multiplex+qRT-PCR+identifies+diagnostic+and+prognostic+microRNA+signatures+in+sera+of+prostate+cancer+patients.">Microfluidic based multiplex qRT-PCR identifies diagnostic and prognostic microRNA signatures in sera of prostate cancer patients.</a> Cancer Res. 71, 550-560 (2011).</li><li>Mestdagh, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+and+universal+method+for+microRNA+RT-qPCR+data+normalization.">A novel and universal method for microRNA RT-qPCR data normalization.</a> Genome Biol. 10, R64-R64 (2009).</li></ol>

אלן מיר הוא עובד של התאגיד Fluidigm. אחרת, אין לנו אינטרסים כלכליים לחשוף.

miRNAs קצרים (18-24 נוקלאוטידים), ללא קידוד RNAs, אשר מסדירים ביטוי גנים שלאחר transcriptionally ידי שני RNAs שליח מערער (mRNA) ותרגום עיכוב שלהם. 6 העובדה כי לפחות שליש גנים אנושיים מכילים נשמרת מירנה מחייב-אתרים 3&#39;UTR שלהם ואת האינטראקציות ניכר של miRNAs עם גנים שגשוג, אפופטוזיס pluripotency ומציע תרומה קריטית גורל החלטות התא, הומאוסטזיס רקמות מחלות כגון סרטן. 6,7 מדויק לכן הביטוי פרופילים microRNA הן רחבות עניין. כדי לבדוק את multiplex שפורסם qRT-PCR ביטוי מירנה פרופיל פרוטוקול 2 השתמשנו קטן המסקלין RNA לקוי כפקדי שלילית. DGCR8 - / - תאים חסרים כל רנ&quot;א הקנוני, בעוד דייסר - / -. תאים חוסר micoRNAs הן הקנוני והלא canoncial 8,9 השוואת רמות סוג בר MES ל DGCR8 - / - תאים, חשפנו חוסר דיוק כמו כמה הביעו 10 רנ&quot;א לא התגלו בטבע מסוג תאים 11. חלקם אפילו הראו רמות ביטוי נמוכות יחסית לתאים בנוקאאוט (איור 3a). החוקרים שיערו כי חוסר דיוק עלול להיגרם על ידי פריימר המאסיבית לשאת מעל שני צעדים רצופים זמנית (RT ו - Pre-PCR) לפני כימות-RT singleplex. עם זאת, זמנית מראש הגברה יש צורך לשפר את עוצמת האות, במיוחד כאשר ריכוז התחלתי של RNA הוא מוגבל. על ידי טיהור הרחק מראש PCR מוצרים primers על ידי בחירת גודל על ג&#39;לים polyacrylamide יליד (איור 2), נוכל להדגים שיפור ניכר דיוק ידי גילוי רנ&quot;א יותר הפסד של אותות חיובי כוזב הן Dgcr8 - / - ו דייסר - / - רקע (איורים 3 א ו 3 ב) בנוסף, שונה qRT-PCR גישה מותר הסיווג הנכון של נדיר Dgcr8 RNAs עצמאי / דייסר קטן התלוי (איור 3 ב) 11. לכן צעד נוסף כדי לטהר primers מוגזמת הרחק מוצר טרום PCR יש יתרון ברור, במיוחד כאשר באמצעות פריימר זמנית גדול ערכות לדגימה. מספר אופטימלי של טרום ההגברה מחזורים נקבעת על ידי ריכוז RNA קלט. האיזון כדי לא מתחת או overamplify צריך להיות מונחה על ידי הפרטים של הניסוי הספציפי. עם יותר מאלף רנ&quot;א ידוע, שימוש רגיל 384 גם הצלחות לא יכול להיות אופטימלי עבור פרופיל microRNA נרחב, בייחוד כאשר משווים דגימות מרובות. IFC Fluidigm מערך דינמי מאפשר, עם ירידה משמעותית של צעדים pipetting וכימיה הצורך, בדיקה עד 96 דגימות בודדות כנגד 96 רנ&quot;א שונים בניסוי יחיד (9216 תגובות) בקנה מידה nanoliter (6.7 NL). בשביל להריץ כל תוכנה מספקת ניתוח עקומות הגברה, מפות בצבעים חום סף מחזור ערכים (CT). פרופיל סימולטני בקנה מידה גדול מפחית סטיות ניסיוני מאפשר נורמליזציה הערך הממוצע הביטוי, אשר מחוץ מבצע אסטרטגיות נורמליזציה אחרים העושים שימוש קטן שולטת RNA. 12 לעומת 384 פלטפורמות זמין מסחרית היטב מראש מוקצה בדיקות TaqMan, השילוב של פלטפורמת תפוקה גבוהה עם פרופיל מחוייט קובע פריימר מציעה גמישות גבוהה ניסיוני. זמנית אופטימיזציה qRT-PCR גישה בשילוב עם פלטפורמת מערך דינמי מותר בהצלחה לנו בו זמנית במסך 48 סרטן הערמונית סרה המטופל לשינויים ברמות של מירנה 384 (איור 4) ו לנרמל את הנתונים ללא עלייה שולטת (כלומר סינתטי רנ&quot;א). 11 למרות הגידול של צעדים מן הכנה דוגמאות לתוצאות פרופיל, הגישה המתוארת היא זמן וחסכונית שיטת תפוקה גבוהה לפרופיל קבוצות מדגם גדול של רמות ביטוי מירנה, אפילו עם חומר המוצא מוגבל.

high throughput microrna profiling: optimized multiplex qrt-pcr at nanoliter scale on the fluidigm dynamic arraytm ifcs

מעורבות רחבה של miRNAs בתהליכים קריטיים הבסיסית, התפתחות רקמת homoeostasis ומחלות הוביל עניין הגואה בקרב במחקר קהילות התרופות. כדי ללמוד miRNAs, חיוני כי כימות של רמות microRNA מדויק ויציב. על ידי השוואת wild-type ל-RNA קטנים לקוי עכבר לתאי גזע עובריים (המסקלין), אנו גילה חוסר דיוק וחוסנם קודמות qRT-PCR טכניקות שפורסם זמנית. כאן אנו מתארים שיטת אופטימיזציה, כולל טיהור משם primers מוגזמת מן השלבים הקודמים זמנית לפני גילוי singleplex זמן אמת, אשר מגדיל באופן דרמטי את הדיוק ואת החוסן של הטכניקה. יתר על כן, נסביר כיצד לבצע את הטכניקה על שבב microfluidic בעוצמות nanoliter מפחית באופן משמעותי את עלויות מגיב והיתרים יעיל זמן מירנה גבוהה התפוקה פרופיל הביטוי.

Watch this Scientific Journal Video about High Throughput MicroRNA Profiling: Optimized Multiplex qRT-PCR at Nanoliter Scale on the Fluidigm Dynamic ArrayTM IFCs at JoVE.com

High Throughput MicroRNA Profiling: Optimized Multiplex qRT-PCR at Nanoliter Scale on the Fluidigm Dynamic ArrayTM IFCs

כאן אנו מתארים זמנית אופטימיזציה הפוך transcriptase PCR כמותי (qRT-PCR) פרוטוקול בשילוב עם פלטפורמת microfluidic ככלי העלות והזמן תפוקה גבוהה יעיל ההקרנה microRNA (מירנה) רמות הביטוי, במיוחד כאשר עובדים עם כמויות מוגבלות של המדגם.

תפוקה גבוהה פרופיל MicroRNA: Multiplex אופטימליים qRT-PCR בקנה מידה Nanoliter על IFCs דינמי Fluidigm ArrayTM

The broad involvement of miRNAs in critical processes underlying development, tissue homoeostasis and disease has led to a surging interest among the ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Cell-based Calcium Assay for Medium to High Throughput Screening of TRP Channel Functions using FlexStation 3

תא מבוססי סידן Assay עבור בינוני עד הקרנת תפוקה גבוהה של פונקציות TRP באמצעות ערוץ FlexStation 3

The Molecular Devices' FlexStation 3 is a benchtop multi-mode microplate reader capable of automated fluorescence measurement in multi-well plates.  It is ...

Candida albicans Biofilm Chip (CaBChip) for High-throughput Antifungal Drug Screening

Candida albicans Biofilm Chip CaBChip for High-throughput Antifungal Drug Screening

קנדידה אלביקנס biofilm צ&#39;יפ (ע&quot;א BChip) להקרנה תפוקה גבוהה תרופות נגד פטריות

Candida  albicans remains the main etiological agent of candidiasis, which  currently represents the fourth most common nosocomial bloodstream infection ...

High-throughput Protein Expression Generator Using a Microfluidic Platform

גנרטור ביטוי חלבון תפוקה גבוהה באמצעות פלטפורמת Microfluidic

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and ...

Synthetic Spider Silk Production on a Laboratory Scale

ייצור סינתטי קורי עכביש בקנה מידה מעבדה

As society progresses and resources become scarcer, it is becoming increasingly important to cultivate new technologies that engineer next generation ...

Cloning and Large-Scale Production of High-Capacity Adenoviral Vectors Based on the Human Adenovirus Type 5

ייצור שיבוט וקנה מידה גדולה של וקטורי adenoviral בקיבולת גבוהה המבוססים על סוג Adenovirus האדם 5

High-capacity adenoviral vectors (HCAdV) devoid of all viral coding sequences represent one of the most advanced gene delivery vectors due to their high ...

Describing a Transcription Factor Dependent Regulation of the MicroRNA Transcriptome

בתארו תקנה Dependent גורם שעתוק של transcriptome MicroRNA

While the transcription regulation of protein coding genes was extensively studied, little is known on how transcription factors are involved in ...

Easy and Accurate Mechano-profiling on Micropost Arrays

Mechano-פרופיל קל ומדויק על מערכי Micropost

Cell culture substrates with integrated flexible microposts enable a user to study the mechanical interactions between cells and their immediate ...

Using Tomoauto: A Protocol for High-throughput Automated Cryo-electron Tomography

באמצעות Tomoauto: פרוטוקול לתפוקה גבוהה אוטומטית קריו אלקטרון טומוגרפיה

Cryo-electron tomography (Cryo-ET) is a powerful three-dimensional (3-D) imaging technique for visualizing macromolecular complexes in their native ...

A High-throughput Cell Microarray Platform for Correlative Analysis of Cell Differentiation and Traction Forces

פלטפורמת Microarray Cell תפוקה גבוהה עבור ניתוח גומל של התמיינות תאי כוחות המתיחה

Microfabricated cellular microarrays, which consist of contact-printed combinations of biomolecules on an elastic hydrogel surface, provide a tightly ...

Power Input Measurements in Stirred Bioreactors at Laboratory Scale

מידות קלט כוח ריאקטורים מנוער בקנה מידה מעבדה

The power input in stirred bioreactors is an important scaling-up parameter and can be measured through the torque that acts on the impeller shaft during ...