Name: high throughput microrna profiling: optimized multiplex qrt-pcr at nanoliter scale on the fluidigm dynamic arraytm ifcs
Uploaded: 2011-08-03T12:00:00
Duration: 7 min 27 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about High Throughput MicroRNA Profiling: Optimized Multiplex qRT-PCR at Nanoliter Scale on the Fluidigm Dynamic ArrayTM IFCs at JoVE.com

हम Blelloch प्रयोगशाला पाठ पर टिप्पणी करने के लिए धन्यवाद देना चाहूंगा. इस काम (NS48118 K08 और NS057221 R01) एनआईएच, पुनर्योजी चिकित्सा के कैलिफोर्निया इंस्टीट्यूट (सीआईआरएम) (बीज RS1 00,161 अनुदान, नई संकाय पुरस्कार RN2 - 00,906) और बेंच चैरिटेबल ट्रस्ट से आरबी के लिए धन और एफएम से समर्थित किया गया Wissenschaftlich Urologische Gesellschaft eV.

<ol>
	<li>Mitchell, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+microRNAs+as+stable+blood-based+markers+for+cancer+detection.">Circulating microRNAs as stable blood-based markers for cancer detection.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 10513-10518 (2008).</li><li>Tang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=220-plex+microRNA+expression+profile+of+a+single+cell.">220-plex microRNA expression profile of a single cell.</a> Nat Protoc. 1, 1154-1159 (2006).</li><li>Gertsenstein, M., Vintersten, K., Behringer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual. 3, 644-645 (2003).</li><li>Suh, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+function+is+globally+suppressed+in+mouse+oocytes+and+early+embryos.">MicroRNA function is globally suppressed in mouse oocytes and early embryos.</a> Curr Biol. 20, 271-277 (2010).</li><li>Babiarz, J. E., Ruby, J. G., Wang, Y., Bartel, D. P., Blelloch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+ES+cells+express+endogenous+shRNAs,+siRNAs,+and+other+Microprocessor-independent,+Dicer-dependent+small+RNAs.">Mouse ES cells express endogenous shRNAs, siRNAs, and other Microprocessor-independent, Dicer-dependent small RNAs.</a> Genes Dev. 22, 2773-2785 (2008).</li><li>Babiarz, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+RNAs:+their+biogenesis,+regulation+and+function+in+embryonic+stem+cells.">Small RNAs: their biogenesis, regulation and function in embryonic stem cells.</a> StemBook. , (2009).</li><li>Friedman, R. C., Farh, K. K., Burge, C. B., Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Most+mammalian+mRNAs+are+conserved+targets+of+microRNAs.">Most mammalian mRNAs are conserved targets of microRNAs.</a> Genome Res. 19, 92-105 (2008).</li><li>Wang, Y., Medvid, R., Melton, C., Jaenisch, R., Blelloch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DGCR8+is+essential+for+microRNA+biogenesis+and+silencing+of+embryonic+stem+cell+self-renewal.">DGCR8 is essential for microRNA biogenesis and silencing of embryonic stem cell self-renewal.</a> Nat Genet. 39, 380-385 (2007).</li><li>Kanellopoulou, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dicer-deficient+mouse+embryonic+stem+cells+are+defective+in+differentiation+and+centromeric+silencing.">Dicer-deficient mouse embryonic stem cells are defective in differentiation and centromeric silencing.</a> Genes Dev. 19, 489-501 (2005).</li><li>Thomson, J. M., Parker, J., Perou, C. M., Hammond, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+custom+microarray+platform+for+analysis+of+microRNA+gene+expression.">A custom microarray platform for analysis of microRNA gene expression.</a> Nat Methods. 1, 47-53 (2004).</li><li>Moltzahn, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+based+multiplex+qRT-PCR+identifies+diagnostic+and+prognostic+microRNA+signatures+in+sera+of+prostate+cancer+patients.">Microfluidic based multiplex qRT-PCR identifies diagnostic and prognostic microRNA signatures in sera of prostate cancer patients.</a> Cancer Res. 71, 550-560 (2011).</li><li>Mestdagh, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+and+universal+method+for+microRNA+RT-qPCR+data+normalization.">A novel and universal method for microRNA RT-qPCR data normalization.</a> Genome Biol. 10, R64-R64 (2009).</li></ol>

एलन मीर Fluidigm निगम के एक कर्मचारी है. अन्यथा, हम खुलासा करने के लिए कोई वित्तीय हितों है.

miRNAs कम कर रहे हैं (18-24 न्यूक्लीओटाइड्स), गैर कोडन RNAs, जो दोनों को अस्थिर दूत (mRNA) RNAs और बाधा उनके अनुवाद के द्वारा जीन अभिव्यक्ति के बाद transcriptionally विनियमित 6. तथ्य यह है कि कम से कम मानव जीन की एक तिहाई संरक्षित होते miRNA उनके 3&#39;UTR में बाध्यकारी साइटों और स्पष्ट बातचीत pluripotency, प्रसार, और apoptosis के लिए जीन के साथ miRNAs की सेल भाग्य का निर्णय, ऊतक homeostasis और कैंसर जैसे रोगों में एक महत्वपूर्ण योगदान पता चलता है 6,7 इसलिए सटीक microRNA अभिव्यक्ति प्रोफाइल व्यापक हैं ब्याज. प्रकाशित QRT-पीसीआर miRNA अभिव्यक्ति की रूपरेखा 2 प्रोटोकॉल मल्टीप्लेक्स का परीक्षण करने के लिए हम नकारात्मक नियंत्रण के रूप में छोटे आरएनए कमी mESC इस्तेमाल किया. DGCR8 - / - कोशिकाओं विहित सभी microRNAs की कमी कर रहे हैं, जबकि पासा खेलनेवाला - / - कोशिकाओं दोनों विहित और गैर canoncial micoRNAs कमी 8,9 / - - DGCR8 संदेश जंगली प्रकार में स्तर की तुलना कोशिकाओं, हम के रूप में कई व्यक्त 10 microRNAs जंगली प्रकार 11 कोशिकाओं में नहीं पाया गया सटीकता की कमी खुला. कुछ भी कम अभिव्यक्ति के स्तर को पीटकर कोशिकाओं (चित्र 3a) के सापेक्ष दिखाया. हम धारणा है कि सटीकता की कमी लगातार दो मल्टीप्लेक्स कदम के बड़े पैमाने पर ले singleplex आरटी - मात्रा का ठहराव पहले प्राइमर (आरटी और प्री - पीसीआर) की वजह से हो सकता है. हालांकि, मल्टीप्लेक्स प्रवर्धन पूर्व सिग्नल की शक्ति को बढ़ाने के लिए आवश्यक है, खासकर जब शाही सेना के शुरू एकाग्रता सीमित है. / - - दूर देशी polyacrylamide जैल (चित्रा 2) पर आकार चयन द्वारा प्राइमरों से पूर्व पीसीआर उत्पादों को शुद्ध करके, हम अधिक microRNAs और Dgcr8 दोनों में झूठी सकारात्मक संकेतों का एक नुकसान का पता लगाने के द्वारा सटीकता में पर्याप्त सुधार का प्रदर्शन कर सकता और पासा खेलनेवाला / - इसके अलावा पृष्ठभूमि (आंकड़े 3a और 3b) संशोधित QRT-पीसीआर दुर्लभ Dgcr8 स्वतंत्र / पासा खेलनेवाला निर्भर छोटे (चित्रा 3b) RNAs 11 की उचित वर्गीकरण के लिए अनुमति दी दृष्टिकोण. इसलिए एक अतिरिक्त कदम अत्यधिक प्राइमरों शुद्ध पूर्व पीसीआर उत्पाद से दूर स्पष्ट रूप से फायदेमंद है, खासकर जब बड़े मल्टीप्लेक्स प्राइमर का उपयोग नमूना प्रति सेट. पूर्व प्रवर्धन चक्र के इष्टतम संख्या इनपुट शाही सेना सांद्रता के द्वारा निर्धारित किया जाता है. नहीं अंतर्गत या संतुलन overamplify विशिष्ट प्रयोग के विवरण के द्वारा निर्देशित किया जाना चाहिए. एक हजार से अधिक जाना जाता microRNAs के साथ, मानक के उपयोग 384 अच्छी तरह प्लेटें व्यापक microRNA रूपरेखा के लिए इष्टतम नहीं हो सकता है, खासकर जब कई नमूने की तुलना कर सकते हैं. Fluidigm गतिशील ऐरे आईएफसी pipetting कदम और जरूरत रसायन शास्त्र की एक महत्वपूर्ण कमी के साथ सक्षम बनाता है, nanoliter पैमाने (6.7 NL) पर एक ही प्रयोग (9216 प्रतिक्रियाओं) में 96 विभिन्न microRNAs के खिलाफ 96 व्यक्ति नमूने के परीक्षण है. प्रत्येक रन के लिए विश्लेषण सॉफ्टवेयर प्रवर्धन घटता, रंग कोडित नक्शे गर्मी चक्र और दहलीज मूल्यों (सीटी) प्रदान करता है. एक साथ बड़े पैमाने पर की रूपरेखा प्रयोगात्मक प्रसरण कम कर देता है और मतलब अभिव्यक्ति मूल्य सामान्य है, जो अन्य सामान्य रणनीति है कि छोटे आरएनए नियंत्रण का उपयोग कर बाहर प्रदर्शन के लिए अनुमति देता है 12. व्यावसायिक रूप से उपलब्ध पूर्व सौंपा TaqMan जांच के साथ 384 अच्छी तरह प्लेटफार्मों की तुलना में, कस्टम बनाया प्राइमर सेट के साथ एक उच्च throughput रूपरेखा मंच के संयोजन उच्च प्रयोगात्मक लचीलापन प्रदान करता है. गतिशील ऐरे प्लेटफार्म के साथ अनुकूलित QRT-पीसीआर मल्टीप्लेक्स संयोजन में दृष्टिकोण सफलतापूर्वक हमें परिवर्तन के लिए एक साथ 384 miRNA (चित्रा 4) के स्तर में 48 प्रोस्टेट कैंसर के रोगी सीरा और स्क्रीन नियंत्रण में स्पाइक (यानी कृत्रिम microRNAs) के बिना डेटा को सामान्य करने की अनुमति दी. 11 नमूने की तैयारी से रूपरेखा परिणाम के लिए कदम की वृद्धि के बावजूद, वर्णित दृष्टिकोण एक समय और लागत प्रभावी उच्च throughput विधि miRNA अभिव्यक्ति के स्तर के लिए बड़े नमूना सेट प्रोफ़ाइल सीमित शुरू सामग्री के साथ भी है.

high throughput microrna profiling: optimized multiplex qrt-pcr at nanoliter scale on the fluidigm dynamic arraytm ifcs

महत्वपूर्ण विकास, ऊतक homoeostasis और रोग के अंतर्निहित प्रक्रियाओं में miRNAs की व्यापक भागीदारी अनुसंधान और दवा समुदायों के बीच बढ़ती ब्याज के लिए नेतृत्व किया गया है. MiRNAs अध्ययन करने के लिए, यह आवश्यक है कि microRNA स्तर की मात्रा का ठहराव सटीक और मजबूत है. छोटे आरएनए की कमी माउस भ्रूणीय स्टेम कोशिकाओं (mESC) को जंगली प्रकार की तुलना करके, हम सटीकता और पिछले प्रकाशित मल्टीप्लेक्स QRT-पीसीआर तकनीकों में मजबूती की कमी का पता चला. यहाँ, हम दूर singleplex वास्तविक समय का पता लगाने, जो नाटकीय रूप से सटीकता और तकनीक की मजबूती बढ़ जाती है पहले पिछले मल्टीप्लेक्स कदम से अत्यधिक प्राइमरों सफ़ाई सहित एक अनुकूलित विधि का वर्णन करता है. इसके अलावा, हम समझाने की कैसे nanoliter मात्रा में एक चिप पर microfluidic तकनीक का प्रदर्शन काफी अभिकर्मक लागत कम कर देता है और समय प्रभावी उच्च throughput miRNA अभिव्यक्ति की रूपरेखा परमिट है.

Watch this Scientific Journal Video about High Throughput MicroRNA Profiling: Optimized Multiplex qRT-PCR at Nanoliter Scale on the Fluidigm Dynamic ArrayTM IFCs at JoVE.com

High Throughput MicroRNA Profiling: Optimized Multiplex qRT-PCR at Nanoliter Scale on the Fluidigm Dynamic ArrayTM IFCs

यहाँ हम एक समय और लागत प्रभावी उच्च throughput (miRNA) microRNA अभिव्यक्ति के स्तर के लिए स्क्रीनिंग उपकरण के रूप में एक microfluidic मंच के साथ एक अनुकूलित मल्टीप्लेक्स रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस मात्रात्मक पीसीआर (QRT पीसीआर) संयोजन में प्रोटोकॉल का वर्णन है, खासकर जब नमूना की सीमित मात्रा में के साथ काम कर रहा है.

उच्च Throughput MicroRNA रूपरेखा: अनुकूलित मल्टीप्लेक्स nanoliter स्केल पर Fluidigm गतिशील ArrayTM IFCs पर QRT - पीसीआर

The broad involvement of miRNAs in critical processes underlying development, tissue homoeostasis and disease has led to a surging interest among the ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Cell-based Calcium Assay for Medium to High Throughput Screening of TRP Channel Functions using FlexStation 3

मध्यम के लिए सेल आधारित कैल्शियम टीआरपी चैनल कार्य की उच्च Throughput स्क्रीनिंग 3 FlexStation का उपयोग करने के लिए परख

The Molecular Devices' FlexStation 3 is a benchtop multi-mode microplate reader capable of automated fluorescence measurement in multi-well plates.  It is ...

Candida albicans Biofilm Chip (CaBChip) for High-throughput Antifungal Drug Screening

Candida albicans Biofilm Chip CaBChip for High-throughput Antifungal Drug Screening

उच्च throughput रोधी दवा स्क्रीनिंग के लिए candida albicans के Biofilm चिप (सीए BChip,)

Candida  albicans remains the main etiological agent of candidiasis, which  currently represents the fourth most common nosocomial bloodstream infection ...

High-throughput Protein Expression Generator Using a Microfluidic Platform

उच्च throughput प्रोटीन अभिव्यक्ति मंच microfluidic नहीं एक जनरेटर का उपयोग

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and ...

Synthetic Spider Silk Production on a Laboratory Scale

एक प्रयोगशाला पैमाने पर सिंथेटिक स्पाइडर सिल्क उत्पादन

As society progresses and resources become scarcer, it is becoming increasingly important to cultivate new technologies that engineer next generation ...

Cloning and Large-Scale Production of High-Capacity Adenoviral Vectors Based on the Human Adenovirus Type 5

मानव Adenovirus प्रकार 5 पर आधारित उच्च क्षमता adenoviral वैक्टर की क्लोनिंग और बड़े पैमाने पर उत्पादन

High-capacity adenoviral vectors (HCAdV) devoid of all viral coding sequences represent one of the most advanced gene delivery vectors due to their high ...

Describing a Transcription Factor Dependent Regulation of the MicroRNA Transcriptome

MicroRNA Transcriptome की एक प्रतिलेखन कारक निर्भर नियमन का वर्णन

While the transcription regulation of protein coding genes was extensively studied, little is known on how transcription factors are involved in ...

Easy and Accurate Mechano-profiling on Micropost Arrays

Micropost सारणियों पर आसान और सटीक Mechano-प्रोफाइलिंग

Cell culture substrates with integrated flexible microposts enable a user to study the mechanical interactions between cells and their immediate ...

Using Tomoauto: A Protocol for High-throughput Automated Cryo-electron Tomography

Tomoauto का प्रयोग: एक प्रोटोकॉल उच्च throughput स्वचालित क्रायो इलेक्ट्रॉन टोमोग्राफी के लिए

Cryo-electron tomography (Cryo-ET) is a powerful three-dimensional (3-D) imaging technique for visualizing macromolecular complexes in their native ...

A High-throughput Cell Microarray Platform for Correlative Analysis of Cell Differentiation and Traction Forces

सेल भेदभाव और ट्रैक्शन बलों के correlative विश्लेषण के लिए एक उच्च throughput सेल माइक्रोएरे प्लेटफार्म

Microfabricated cellular microarrays, which consist of contact-printed combinations of biomolecules on an elastic hydrogel surface, provide a tightly ...

Power Input Measurements in Stirred Bioreactors at Laboratory Scale

प्रयोगशाला पैमाने पर हड़कंप मच प्रतिक्रिया में पावर इनपुट माप

The power input in stirred bioreactors is an important scaling-up parameter and can be measured through the torque that acts on the impeller shaft during ...