Name: high throughput microrna profiling: optimized multiplex qrt-pcr at nanoliter scale on the fluidigm dynamic arraytm ifcs
Uploaded: 2011-08-03T12:00:00
Duration: 7 min 27 s
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我々は、本文についてコメントするためBlellochラボに感謝します。この作品は、からNIH（K08 NS48118とR01 NS057221）からRB、再生医療（CIRM）カリフォルニア工科大学（シードグラントRS1 - 00161、新学部賞RN2 - 00906）とピュー慈善信託するとFMの資金によって支えられてWissenschaftlich UrologischeフラウeVの。

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アランミールはフリュー株式会社の従業員です。そうでなければ、我々は、開示する金融利害関係はありません。

miRNAが短い（18〜24ヌクレオチド）、非コーディングの両方不安定メッセンジャーRNA（mRNA）のと阻害の翻訳によって、転写後に遺伝子発現を調節するRNAを、6はヒトの遺伝子の少なくとも3分の1が保存されて含まれているという事実のmiRNAそれらの3&#39;UTRに結合部位および多分化能、増殖およびアポトーシスの遺伝子とmiRNAの明らかな相互作用は、細胞の運命決定、組織の恒常性や癌などの疾患で重要な貢献を示唆している。6,7したがって、正確なmicroRNAの発現プロファイルは広いのです関心。 公開されたマルチプレックス定量RT - PCR miRNA発現プロファイリングのためのプロトコル2をテストするために我々は、ネガティブコントロールとして、小さなRNA欠損MESCを使用していました。 DGCR8 - / - / - -ダイサーしながら細胞は、すべての標準的なマイクロRNAの欠乏している。細胞は正規と非canoncial両方micoRNAsを欠いている8,9 / - - DGCR8 MES - ​​に野生型のレベルを比較すると、細胞を、我々は、いくつかが10マイクロRNAが野生型細胞11で検出されなかった表現される精度の欠如を発見した。一部ではノックアウト細胞（図3a）に対して相対的な低発現レベルを示した。我々は、精度の不足がsingleplex RT -定量化する前の、2つの連続多重ステップの大規模なプライマーキャリーオーバー（RTとPre - PCR）によって引き起こされるかもしれないという仮説を立てた。しかし、多重プレ増幅は、RNAの初期濃度が限られている場合は特に、信号強度を高めることが必要である。ネイティブポリアクリルアミドゲル上でサイズの選択によりプライマーから事前にPCR産物を離れて精製することにより（図2）、我々はより多くのマイクロRNAとDgcr8両方の偽陽性シグナルの損失を検出することにより、精度の大幅な改善を示すことができる- / -とダイサーを - / -加えて、背景（図3a及び図3b）珍しいDgcr8独立/ ダイサー依存低分子RNA（図3b）11の適切な分類のために許可されて修正された定量RT - PCRのアプローチ。したがって、離れてプレPCR産物からの過剰なプライマーを浄化するために追加のステップは、サンプルあたりの大型マルチプレックスプライマーセットを使用する場合は特に、明らかに有利である。 プレ増幅の最適なサイクル数は、インプットRNA濃度によって決定されます。バランスのないアンダーまたはoveramplifyは、特定の実験の細目によって導かれるべきである。 複数のサンプルを比較する場合は特に1000以上の既知のマイクロRNA、標準を使用すると384ウェルプレートでは、大規模なマイクロRNAプロファイリングのための最適ではない可能性があります。フリュー動的配列IFCは、ナノリットルスケール（6.7 NL）で一回の実験（9216反応）にある97の異なるマイクロRNAに対して96個のサンプルをテストし、ピペッティング操作と必要な化学の大幅な減少と、有効になります。各実行のための解析ソフトウェアには、増幅曲線、色分けされたヒートマップと周期のしきい値（CT）を提供します。同時大規模なプロファイリングは、実験的な分散を低減し、小さなRNAのコントロールを利用する他の正規化戦略を立案、実行平均発現値の正規化、が可能になります。12 事前に割り当てられたTaqManプローブと市販の384ウェルのプラットフォームと比較して、カスタムメイドのプライマーセットを使用してハイスループットプロファイリングプラットフォームの組み合わせは高い実験的な柔軟性を提供しています。 動的配列のプラットフォームとの組み合わせで最適化されたマルチプレックス定量RT - PCRアプローチは成功で同時に384のmiRNA（図4）のレベルの変化で48前立腺癌患者の血清をスクリーニングするとコントロールのスパイク（すなわちsyntheticマイクロRNA）せずにデータを正規化することができました。 11 試料の準備からプロファイリング結果にステップの増加にもかかわらず、説明するアプローチでも限られた出発材料と、時間とmiRNAの発現レベルには大きなサンプルセットをプロファイリングするために費用対効果に優れた高スループット法である。

high throughput microrna profiling: optimized multiplex qrt-pcr at nanoliter scale on the fluidigm dynamic arraytm ifcs

開発、組織homoeostasisと疾患の基礎となる重要なプロセスにおけるmiRNAの広範な関与は、研究や医薬品のコミュニティの間で高騰の関心につながっている。 miRNAを研究するために、それは、miRNAレベルの定量化が正確かつ堅牢であることが不可欠です。小さなRNA欠損マウス胚性幹細胞（MESC）に野生型と比較することによって、我々は以前公開されたマルチプレックス定量RT - PCR技術の精度と堅牢性の欠如を明らかにした。ここで、我々は劇的に技術の精度と堅牢性を高めるsingleplexリアルタイム検出、前に前の多重ステップからの過剰なプライマーを離れて精製することを含めて最適化された方法を、説明します。ナノリットルボリュームでマイクロ流体チップ上のテクニックを実行する方法さらに、我々は説明大幅に試薬コストを削減し、時間の効果的なハイスループットなmiRNA発現プロファイリングを可能にする。

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High Throughput MicroRNA Profiling: Optimized Multiplex qRT-PCR at Nanoliter Scale on the Fluidigm Dynamic ArrayTM IFCs

ここでは、サンプルの限られた量を扱う場合は特に、マイクロRNA（miRNA）の発現レベルのコストと時間効果のハイスループットスクリーニングのツールと​​してのマイクロ流体プラットフォームとの組み合わせで最適化された多重逆転写定量PCR（定量RT - PCR）プロトコルについて説明します。

ハイスループットマイクロRNAプロファイリング：最適化されたマルチプレックスフリューダイナミックArrayTMのIFCSでナノリッタースケールでの定量RT - PCR

The broad involvement of miRNAs in critical processes underlying development, tissue homoeostasis and disease has led to a surging interest among the ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Cell-based Calcium Assay for Medium to High Throughput Screening of TRP Channel Functions using FlexStation 3

FlexStation 3を用いてTRPチャネルの機能のハイスループットスクリーニングへの媒体のためのセルベースカルシウムアッセイ

The Molecular Devices' FlexStation 3 is a benchtop multi-mode microplate reader capable of automated fluorescence measurement in multi-well plates.  It is ...

Candida albicans Biofilm Chip (CaBChip) for High-throughput Antifungal Drug Screening

Candida albicans Biofilm Chip CaBChip for High-throughput Antifungal Drug Screening

ハイスループット抗真菌薬スクリーニングのためのカンジダバイオチップ（ カルシウム BChip）

Candida  albicans remains the main etiological agent of candidiasis, which  currently represents the fourth most common nosocomial bloodstream infection ...

High-throughput Protein Expression Generator Using a Microfluidic Platform

マイクロ流体プラットフォームを使用した高スループットのタンパク質発現ジェネレータ

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and ...

Synthetic Spider Silk Production on a Laboratory Scale

実験室規模の合成クモの糸生産

As society progresses and resources become scarcer, it is becoming increasingly important to cultivate new technologies that engineer next generation ...

Cloning and Large-Scale Production of High-Capacity Adenoviral Vectors Based on the Human Adenovirus Type 5

ヒトアデノウイルス5型に基づく高容量アデノウイルスベクターのクローニングおよび大規模生産

High-capacity adenoviral vectors (HCAdV) devoid of all viral coding sequences represent one of the most advanced gene delivery vectors due to their high ...

Describing a Transcription Factor Dependent Regulation of the MicroRNA Transcriptome

マイクロRNAトランスクリプトームの転写因子依存性調節を記述する

While the transcription regulation of protein coding genes was extensively studied, little is known on how transcription factors are involved in ...

Easy and Accurate Mechano-profiling on Micropost Arrays

マイクロポストアレイ上の簡単かつ正確なメカノプロファイリング

Cell culture substrates with integrated flexible microposts enable a user to study the mechanical interactions between cells and their immediate ...

Using Tomoauto: A Protocol for High-throughput Automated Cryo-electron Tomography

Tomoautoの使用：ハイスループット自動クライオ電子断層撮影のためのプロトコル

Cryo-electron tomography (Cryo-ET) is a powerful three-dimensional (3-D) imaging technique for visualizing macromolecular complexes in their native ...

A High-throughput Cell Microarray Platform for Correlative Analysis of Cell Differentiation and Traction Forces

細胞の分化やトラクション軍の相関的分析のためのハイスループット細胞マイクロアレイプラットフォーム

Microfabricated cellular microarrays, which consist of contact-printed combinations of biomolecules on an elastic hydrogel surface, provide a tightly ...

Power Input Measurements in Stirred Bioreactors at Laboratory Scale

実験室規模で撹拌したバイオリアクターでのパワー入力測定

The power input in stirred bioreactors is an important scaling-up parameter and can be measured through the torque that acts on the impeller shaft during ...