Name: high throughput microrna profiling: optimized multiplex qrt-pcr at nanoliter scale on the fluidigm dynamic arraytm ifcs
Uploaded: 2011-08-03T12:00:00
Duration: 7 min 27 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about High Throughput MicroRNA Profiling: Optimized Multiplex qRT-PCR at Nanoliter Scale on the Fluidigm Dynamic ArrayTM IFCs at JoVE.com

Мы хотели бы поблагодарить Blelloch лабораторию для комментируя текст. Работа выполнена при поддержке за счет средств, чтобы РБ от НИЗ (K08 NS48118 и R01 NS057221), Калифорнийский Институт регенеративной медицины (CIRM) (Семени Грант RS1-00161, Нью-премии факультета RN2-00906) и Благотворительный фонд Пью и FM с Wissenschaftlich Urologische Gesellschaft эВ.

<ol>
	<li>Mitchell, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+microRNAs+as+stable+blood-based+markers+for+cancer+detection.">Circulating microRNAs as stable blood-based markers for cancer detection.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 10513-10518 (2008).</li><li>Tang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=220-plex+microRNA+expression+profile+of+a+single+cell.">220-plex microRNA expression profile of a single cell.</a> Nat Protoc. 1, 1154-1159 (2006).</li><li>Gertsenstein, M., Vintersten, K., Behringer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual. 3, 644-645 (2003).</li><li>Suh, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+function+is+globally+suppressed+in+mouse+oocytes+and+early+embryos.">MicroRNA function is globally suppressed in mouse oocytes and early embryos.</a> Curr Biol. 20, 271-277 (2010).</li><li>Babiarz, J. E., Ruby, J. G., Wang, Y., Bartel, D. P., Blelloch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+ES+cells+express+endogenous+shRNAs,+siRNAs,+and+other+Microprocessor-independent,+Dicer-dependent+small+RNAs.">Mouse ES cells express endogenous shRNAs, siRNAs, and other Microprocessor-independent, Dicer-dependent small RNAs.</a> Genes Dev. 22, 2773-2785 (2008).</li><li>Babiarz, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+RNAs:+their+biogenesis,+regulation+and+function+in+embryonic+stem+cells.">Small RNAs: their biogenesis, regulation and function in embryonic stem cells.</a> StemBook. , (2009).</li><li>Friedman, R. C., Farh, K. K., Burge, C. B., Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Most+mammalian+mRNAs+are+conserved+targets+of+microRNAs.">Most mammalian mRNAs are conserved targets of microRNAs.</a> Genome Res. 19, 92-105 (2008).</li><li>Wang, Y., Medvid, R., Melton, C., Jaenisch, R., Blelloch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DGCR8+is+essential+for+microRNA+biogenesis+and+silencing+of+embryonic+stem+cell+self-renewal.">DGCR8 is essential for microRNA biogenesis and silencing of embryonic stem cell self-renewal.</a> Nat Genet. 39, 380-385 (2007).</li><li>Kanellopoulou, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dicer-deficient+mouse+embryonic+stem+cells+are+defective+in+differentiation+and+centromeric+silencing.">Dicer-deficient mouse embryonic stem cells are defective in differentiation and centromeric silencing.</a> Genes Dev. 19, 489-501 (2005).</li><li>Thomson, J. M., Parker, J., Perou, C. M., Hammond, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+custom+microarray+platform+for+analysis+of+microRNA+gene+expression.">A custom microarray platform for analysis of microRNA gene expression.</a> Nat Methods. 1, 47-53 (2004).</li><li>Moltzahn, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+based+multiplex+qRT-PCR+identifies+diagnostic+and+prognostic+microRNA+signatures+in+sera+of+prostate+cancer+patients.">Microfluidic based multiplex qRT-PCR identifies diagnostic and prognostic microRNA signatures in sera of prostate cancer patients.</a> Cancer Res. 71, 550-560 (2011).</li><li>Mestdagh, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+and+universal+method+for+microRNA+RT-qPCR+data+normalization.">A novel and universal method for microRNA RT-qPCR data normalization.</a> Genome Biol. 10, R64-R64 (2009).</li></ol>

Алан Мир является сотрудником корпорации Fluidigm. В противном случае, у нас нет никаких финансовых интересов раскрывать.

микроРНК короткие (18-24 нуклеотидов), некодирующих РНК, которые регулируют экспрессию генов после транскрипционно как дестабилизирующий РНК посыльного (мРНК) и препятствует их перевод. 6 факт, что по крайней мере одна треть генов человека содержат сохраняется микроРНК обязательные-сайтов в их 3&#39;UTR и очевидно взаимодействия микро-РНК с генов плюрипотентности, пролиферации и апоптозе предполагает решающий вклад в ячейке судьбу решения, тканевого гомеостаза и такими болезнями, как рак. 6,7 Поэтому точные профили микроРНК выражение, имеют широкие интерес. Для тестирования опубликовал мультиплекс QRT-PCR микроРНК выражение профилирования протокол 2 мы использовали небольшие РНК недостаточно мЭСК качестве отрицательного контроля. Dgcr8 - / - клетки испытывают дефицит всех канонических микроРНК, в то время как Dicer - / -. Клеткам не хватает как канонические и не canoncial micoRNAs 8,9 Сравнение уровней в дикого типа MES-на Dgcr8 - / - клеток, мы обнаружили отсутствие точности, как несколько выразили 10 микроРНК не были обнаружены в дикого типа клетки 11. Некоторые даже имели более низкие уровни экспрессии по отношению к нокаутом клетки (рис. 3а). Мы предположили, что отсутствие точности может быть вызвано массивным грунтовки перенести из двух последовательных этапов мультиплексирования (RT и предварительного ПЦР), прежде чем singleplex RT-количественной оценке. Тем не менее, мультиплекс предварительного усиления необходимо повысить уровень сигнала, особенно при исходной концентрации РНК ограничено. По предварительной очистки от продуктов ПЦР-праймеров с размером отбора на родном гелях полиакриламида (рис. 2), мы могли бы продемонстрировать существенное повышение точности, обнаруживая более микроРНК и потери ложных положительных сигналов в обоих Dgcr8 - / - и Dicer - / - фон (рис. 3а и 3б) Кроме того изменение QRT-PCR подход позволил надлежащей классификации редких Dgcr8 независимые / Dicer зависимыми малых РНК (рис. 3б) 11. Поэтому дополнительный шаг, чтобы очистить чрезмерного грунтовки от предварительно ПЦР продукт имеет очевидные преимущества, особенно при использовании больших грунтовки мультиплекс комплектов в образце. Оптимальное число предварительного усиления циклов определяется входной концентрации РНК. Баланс, чтобы не недо-или overamplify должны руководствоваться особенностями конкретного эксперимента. Обладая более чем тысячи известных микроРНК, использование стандартных 384-луночных может не быть оптимальным для широкого профиля микроРНК, особенно при сравнении нескольких образцов. Fluidigm динамического массива IFC дает возможность, с существенным снижением пипетирования шаги и необходимые химии, тестирование до 96 отдельных образцов против 96 различных микроРНК в одном эксперименте (9216 реакций) на nanoliter масштаба (6,7 нл). Для каждого запуска программного обеспечения для анализа обеспечивает усиление кривые, цветные карты тепла и цикл пороговые значения (СТ). Одновременных крупномасштабных профилирования снижает экспериментальной дисперсии и позволяет означает нормализацию значение выражения, которое из-осуществляет иные стратегии нормализации, которые используют небольшие контроля РНК. 12 По сравнению с коммерчески доступными и 384 платформ с заданными зондов TaqMan, сочетание высокой пропускной профилирования платформы с изготовленными на заказ наборов грунтовки обеспечивает высокую гибкость экспериментальной. Оптимизированный мультиплекс QRT-PCR подход в сочетании с динамической платформе Массив успешно позволило нам одновременно экрана 48 рака простаты сывороток пациентов для изменений в уровнях 384 микроРНК (рис. 4) и нормализовать данные без всплеска управления (т.е. синтетические микроРНК). 11 Несмотря на увеличение шагах от подготовки образцов для профилирования результаты, описанный подход является временной и экономически эффективным методом высокой пропускной способностью профиля больших наборов образцов для уровней микроРНК выражения, даже при ограниченном исходном материале.

high throughput microrna profiling: optimized multiplex qrt-pcr at nanoliter scale on the fluidigm dynamic arraytm ifcs

Широкое участие микроРНК в критических процессов, лежащих развитие, гомеостаз тканей и болезни привели к растущие интерес среди исследовательских и фармацевтических сообществ. Для изучения микроРНК, важно, что количественная оценка уровней микроРНК, является точной и надежной. Сравнивая дикого типа малых РНК недостаточно мышиных эмбриональных стволовых клеток (мЭСК), мы обнаружили отсутствие точности и надежности в ранее опубликованные мультиплекс QRT-PCR методов. Здесь мы описываем оптимизированный метод, в том числе очистка от чрезмерного грунтовки от предыдущих этапов, прежде чем мультиплекс singleplex реального времени обнаружения, что резко повышает точность и надежность техники. Кроме того, мы объясняем, как выполнять технику на микрожидкостных чипов на nanoliter объемы значительно снижает затраты и реагента позволяет время эффективным высокой пропускной способности микроРНК выражение профилирования.

Watch this Scientific Journal Video about High Throughput MicroRNA Profiling: Optimized Multiplex qRT-PCR at Nanoliter Scale on the Fluidigm Dynamic ArrayTM IFCs at JoVE.com

High Throughput MicroRNA Profiling: Optimized Multiplex qRT-PCR at Nanoliter Scale on the Fluidigm Dynamic ArrayTM IFCs

Здесь мы опишем оптимизированы мультиплекс обратной транскриптазы количественный ПЦР (QRT-PCR) протокол в сочетании с микрожидкостных платформе, стоимость и время, эффективная высокопроизводительного скрининга инструмент для микроРНК (миРНК) уровни экспрессии, особенно при работе с ограниченным количеством образцов.

Высокая профилирования микроРНК Производительность: Оптимизированная Мультиплекс QRT-PCR на шкале Nanoliter на Fluidigm Динамический МФХБ ArrayTM

The broad involvement of miRNAs in critical processes underlying development, tissue homoeostasis and disease has led to a surging interest among the ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Cell-based Calcium Assay for Medium to High Throughput Screening of TRP Channel Functions using FlexStation 3

Клеточная Кальций Пробирной для средних и высокопроизводительного скрининга из ГТО Функции канала с помощью FlexStation 3

The Molecular Devices' FlexStation 3 is a benchtop multi-mode microplate reader capable of automated fluorescence measurement in multi-well plates.  It is ...

Candida albicans Biofilm Chip (CaBChip) for High-throughput Antifungal Drug Screening

Candida albicans Biofilm Chip CaBChip for High-throughput Antifungal Drug Screening

Candida Albicans биопленки Chip (Ca BChip) для высокой пропускной Противогрибковые Скрининг наркотиков

Candida  albicans remains the main etiological agent of candidiasis, which  currently represents the fourth most common nosocomial bloodstream infection ...

High-throughput Protein Expression Generator Using a Microfluidic Platform

Высокая пропускная способность экспрессии белков генератора с использованием платформы Микрофлюидных

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and ...

Synthetic Spider Silk Production on a Laboratory Scale

Искусственный шелк паука производство в лабораторных масштабах

As society progresses and resources become scarcer, it is becoming increasingly important to cultivate new technologies that engineer next generation ...

Cloning and Large-Scale Production of High-Capacity Adenoviral Vectors Based on the Human Adenovirus Type 5

Клонирование и крупномасштабное производство высокопроизводительного аденовирусные векторы на основе типа аденовируса человека 5

High-capacity adenoviral vectors (HCAdV) devoid of all viral coding sequences represent one of the most advanced gene delivery vectors due to their high ...

Describing a Transcription Factor Dependent Regulation of the MicroRNA Transcriptome

Описание фактора транскрипции зависимая регуляция микроРНК Транскриптом

While the transcription regulation of protein coding genes was extensively studied, little is known on how transcription factors are involved in ...

Easy and Accurate Mechano-profiling on Micropost Arrays

Легкая и точная механотерапии профилирование на Micropost массивов

Cell culture substrates with integrated flexible microposts enable a user to study the mechanical interactions between cells and their immediate ...

Using Tomoauto: A Protocol for High-throughput Automated Cryo-electron Tomography

Использование Tomoauto: протокол для высокой пропускной автоматизированной Cryo-электронной томографии

Cryo-electron tomography (Cryo-ET) is a powerful three-dimensional (3-D) imaging technique for visualizing macromolecular complexes in their native ...

A High-throughput Cell Microarray Platform for Correlative Analysis of Cell Differentiation and Traction Forces

Высокая пропускная способность сотовых микрочипов платформы для корреляционного анализа клеточной дифференциации и тяговых усилий

Microfabricated cellular microarrays, which consist of contact-printed combinations of biomolecules on an elastic hydrogel surface, provide a tightly ...

Power Input Measurements in Stirred Bioreactors at Laboratory Scale

Мощность входных измерения в перемешиваемой биореакторов лабораторного масштаба

The power input in stirred bioreactors is an important scaling-up parameter and can be measured through the torque that acts on the impeller shaft during ...