Name: high throughput microrna profiling: optimized multiplex qrt-pcr at nanoliter scale on the fluidigm dynamic arraytm ifcs
Uploaded: 2011-08-03T12:00:00
Duration: 7 min 27 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about High Throughput MicroRNA Profiling: Optimized Multiplex qRT-PCR at Nanoliter Scale on the Fluidigm Dynamic ArrayTM IFCs at JoVE.com

Vi vill tacka Blelloch lab för kommentera texten. Detta arbete stöddes av medel till RB från NIH (K08 NS48118 och R01 NS057221), California Institute of regenerativ medicin (CIRM) (Seed Grant RS1-00161, Nya fakulteten Award RN2-00.906) och Pew Charitable Trust och på FM från Wissenschaftlich Urologische Gesellschaft eV.

<ol>
	<li>Mitchell, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+microRNAs+as+stable+blood-based+markers+for+cancer+detection.">Circulating microRNAs as stable blood-based markers for cancer detection.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 10513-10518 (2008).</li><li>Tang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=220-plex+microRNA+expression+profile+of+a+single+cell.">220-plex microRNA expression profile of a single cell.</a> Nat Protoc. 1, 1154-1159 (2006).</li><li>Gertsenstein, M., Vintersten, K., Behringer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual. 3, 644-645 (2003).</li><li>Suh, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+function+is+globally+suppressed+in+mouse+oocytes+and+early+embryos.">MicroRNA function is globally suppressed in mouse oocytes and early embryos.</a> Curr Biol. 20, 271-277 (2010).</li><li>Babiarz, J. E., Ruby, J. G., Wang, Y., Bartel, D. P., Blelloch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+ES+cells+express+endogenous+shRNAs,+siRNAs,+and+other+Microprocessor-independent,+Dicer-dependent+small+RNAs.">Mouse ES cells express endogenous shRNAs, siRNAs, and other Microprocessor-independent, Dicer-dependent small RNAs.</a> Genes Dev. 22, 2773-2785 (2008).</li><li>Babiarz, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+RNAs:+their+biogenesis,+regulation+and+function+in+embryonic+stem+cells.">Small RNAs: their biogenesis, regulation and function in embryonic stem cells.</a> StemBook. , (2009).</li><li>Friedman, R. C., Farh, K. K., Burge, C. B., Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Most+mammalian+mRNAs+are+conserved+targets+of+microRNAs.">Most mammalian mRNAs are conserved targets of microRNAs.</a> Genome Res. 19, 92-105 (2008).</li><li>Wang, Y., Medvid, R., Melton, C., Jaenisch, R., Blelloch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DGCR8+is+essential+for+microRNA+biogenesis+and+silencing+of+embryonic+stem+cell+self-renewal.">DGCR8 is essential for microRNA biogenesis and silencing of embryonic stem cell self-renewal.</a> Nat Genet. 39, 380-385 (2007).</li><li>Kanellopoulou, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dicer-deficient+mouse+embryonic+stem+cells+are+defective+in+differentiation+and+centromeric+silencing.">Dicer-deficient mouse embryonic stem cells are defective in differentiation and centromeric silencing.</a> Genes Dev. 19, 489-501 (2005).</li><li>Thomson, J. M., Parker, J., Perou, C. M., Hammond, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+custom+microarray+platform+for+analysis+of+microRNA+gene+expression.">A custom microarray platform for analysis of microRNA gene expression.</a> Nat Methods. 1, 47-53 (2004).</li><li>Moltzahn, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+based+multiplex+qRT-PCR+identifies+diagnostic+and+prognostic+microRNA+signatures+in+sera+of+prostate+cancer+patients.">Microfluidic based multiplex qRT-PCR identifies diagnostic and prognostic microRNA signatures in sera of prostate cancer patients.</a> Cancer Res. 71, 550-560 (2011).</li><li>Mestdagh, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+and+universal+method+for+microRNA+RT-qPCR+data+normalization.">A novel and universal method for microRNA RT-qPCR data normalization.</a> Genome Biol. 10, R64-R64 (2009).</li></ol>

Alan Mir är anställd av Fluidigm Corporation. Annars har vi inga ekonomiska intressen att lämna ut.

miRNA är korta (18-24 nukleotider), icke-kodande RNA, som reglerar genuttryck efter transkriptionellt av både destabiliserande budbärar-RNA (mRNA) och som försvårar deras översättning. 6 Det faktum att minst en tredjedel av mänskliga gener innehåller bevaras miRNA bindande-platser i sina 3&#39;UTR och den uppenbara interaktioner miRNA med gener för pluripotens, spridning och apoptos föreslår ett avgörande bidrag i beslut cell öde, vävnad homeostas och sjukdomar som cancer. 6,7 därför noggrann mikroRNA uttryck profiler är av bred intresse. För att testa de publicerade multiplex QRT-PCR miRNA expression profiling protokoll 2 använde vi små RNA bristfällig Mesc som negativa kontroller. DGCR8 - / - celler är brist på alla kanoniska mikroRNA, medan Dicer - / -. Celler som saknar både kanoniska och icke-canoncial micoRNAs 8,9 Jämföra nivåer i vild typ MES-to DGCR8 - / - celler, upptäckte vi en brist på precision som flera uttryckte 10 mikroRNA inte registreras i den vildtyp celler 11. Vissa visade ännu lägre uttryck nivåer i förhållande till knockout celler (Figur 3a). Vi antar att bristen på exakthet kan orsakas av den massiva primer föra över de två på varandra följande multiplex steg (RT och Pre-PCR) innan singleplex RT-kvantifiering. Dock är multiplex pre-amplifiering nödvändigt att förstärka signalstyrka, speciellt när man startar koncentrationen av RNA är begränsad. Genom att rena bort pre-PCR-produkter från primers efter storlek urval på inhemska polyakrylamidgeler (figur 2), kunde vi påvisa en väsentlig förbättring av exakthet genom att upptäcka mer mikroRNA och en förlust av falskt positiva signaler i både Dgcr8 - / - och Dicer - / - bakgrunder (figur 3a och 3b) Förutom den modifierade QRT-PCR-metoden tillåts för korrekt kategorisering av sällsynta Dgcr8 oberoende / Dicer beroende små RNA (Figur 3b) 11. Därför är ytterligare ett steg för att rena stora grundfärger bort från pre-PCR-produkten är naturligtvis positivt, speciellt när man använder stora multiplex primer set per prov. Det optimala antalet pre-amplifiering cykler bestäms av indata RNA koncentrationer. Balansen att inte under-eller overamplify bör vägledas av uppgifter om den specifika experimentet. Med mer än tusen kända mikroRNA, användning av standardkomponenter 384-brunnars plattor kanske inte optimalt för omfattande mikroRNA profilering, speciellt när man jämför flera prover. Den Fluidigm Dynamic Array IFC ger, med en betydande minskning av pipetteringssteg och behövde kemi, testning upp till 96 individuella prov mot 96 olika mikroRNA i ett enda experiment (9216 reaktioner) på metod i nanoliter skala (6,7 NL). För varje körning analys programvara ger förstärkning kurvor, färgkodade kartor värme och cykel gränsvärden (Ct). Den samtidiga stora profilering minskar experimentell varianser och tillåter betyder uttryck värde normaliseringsprocess som utklassar andra normalisering strategier som använder sig av små RNA kontroller. 12 Jämfört med kommersiellt tillgängliga 384 och plattformar med i förväg utsedda TaqMan-prober, erbjuder en kombination av en hög genomströmning profilering plattform med skräddarsydda primer ställer höga experimentella flexibilitet. Den optimerade multiplex QRT-PCR metod i kombination med Dynamic Array-plattformen får framgång för oss att samtidigt skärm 48 prostata sera cancerpatient för förändringar i nivåer av 384 miRNA (Figur 4) och för att normalisera data utan topp i kontroller (dvs. syntetiska mikroRNA). 11 Trots ökningen av steg från prover förberedelse till profilering resultat är den beskrivna metoden en tids-och kostnadseffektivt med hög genomströmning metod för att profilera stora urval satser för nivåer miRNA uttryck, även med begränsad utgångsmaterial.

high throughput microrna profiling: optimized multiplex qrt-pcr at nanoliter scale on the fluidigm dynamic arraytm ifcs

Ett brett deltagande av miRNA i kritiska processer som ligger bakom utvecklingen, mjukpapper homeostas och sjukdom har lett till en svallande intresse bland forskning och läkemedelsutveckling samhällen. Att studera miRNA, är det viktigt att kvantifiering av mikroRNA nivåer är exakt och slitstark. Genom att jämföra vildtyp till små RNA bristfälliga musen embryonala stamceller (Mesc) visade vi en brist på noggrannhet och robusthet i tidigare publicerade multiplex QRT-PCR-tekniker. Här beskriver vi en optimerad metod, inklusive rena bort alltför primer från tidigare multiplex steg innan singleplex realtid upptäckt, vilket dramatiskt ökar noggrannheten och robusthet av tekniken. Vidare förklarar vi hur du utför tekniken på ett mikroflödessystem chip på metod i nanoliter volymer minskar reagens kostnader och möjliggör mycket effektiv med hög genomströmning profilering miRNA uttryck.

Watch this Scientific Journal Video about High Throughput MicroRNA Profiling: Optimized Multiplex qRT-PCR at Nanoliter Scale on the Fluidigm Dynamic ArrayTM IFCs at JoVE.com

High Throughput MicroRNA Profiling: Optimized Multiplex qRT-PCR at Nanoliter Scale on the Fluidigm Dynamic ArrayTM IFCs

Här beskriver vi ett optimerat multiplex omvänt transkriptas kvantitativ PCR (QRT-PCR) protokollet i kombination med en mikroflödessystem plattform som ett kostnadseffektivt och tidsbesparande high-throughput screening verktyg för mikro-RNA (miRNA) uttryck nivå, särskilt när man arbetar med begränsade mängder av prov.

Hög genomströmning MikroRNA Profilering: Optimerad Multiplex QRT-PCR vid metod i nanoliter Skala på Fluidigm Dynamic ArrayTM IFCS

The broad involvement of miRNAs in critical processes underlying development, tissue homoeostasis and disease has led to a surging interest among the ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Cell-based Calcium Assay for Medium to High Throughput Screening of TRP Channel Functions using FlexStation 3

Cell-baserad Kalcium-analys för medelstora till stora throughput screening av TRP-kanaler funktioner med FlexStation 3

The Molecular Devices' FlexStation 3 is a benchtop multi-mode microplate reader capable of automated fluorescence measurement in multi-well plates.  It is ...

Candida albicans Biofilm Chip (CaBChip) for High-throughput Antifungal Drug Screening

Candida albicans Biofilm Chip CaBChip for High-throughput Antifungal Drug Screening

Candida albicans Biofilm Chip (Ca BChip) för hög genomströmning antimykotikum Screening

Candida  albicans remains the main etiological agent of candidiasis, which  currently represents the fourth most common nosocomial bloodstream infection ...

High-throughput Protein Expression Generator Using a Microfluidic Platform

Hög genomströmning Protein Expression Generator Med en mikroflödessystem plattform

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and ...

Synthetic Spider Silk Production on a Laboratory Scale

Syntetisk Spider Silk Production i laboratorieskala

As society progresses and resources become scarcer, it is becoming increasingly important to cultivate new technologies that engineer next generation ...

Cloning and Large-Scale Production of High-Capacity Adenoviral Vectors Based on the Human Adenovirus Type 5

Kloning och storskalig produktion av hög kapacitet Adenovirusvektorer Baserat på den mänskliga adenovirus typ 5

High-capacity adenoviral vectors (HCAdV) devoid of all viral coding sequences represent one of the most advanced gene delivery vectors due to their high ...

Describing a Transcription Factor Dependent Regulation of the MicroRNA Transcriptome

Beskriver en transkriptionsfaktor beroende reglering av MicroRNA transkriptom

While the transcription regulation of protein coding genes was extensively studied, little is known on how transcription factors are involved in ...

Easy and Accurate Mechano-profiling on Micropost Arrays

Enkelt och exakt Mechano-profilering på Micropost Arrays

Cell culture substrates with integrated flexible microposts enable a user to study the mechanical interactions between cells and their immediate ...

Using Tomoauto: A Protocol for High-throughput Automated Cryo-electron Tomography

Använda Tomoauto: Ett protokoll för hög kapacitet Automatiserad Cryo-elektron Tomography

Cryo-electron tomography (Cryo-ET) is a powerful three-dimensional (3-D) imaging technique for visualizing macromolecular complexes in their native ...

A High-throughput Cell Microarray Platform for Correlative Analysis of Cell Differentiation and Traction Forces

En hög kapacitet Cell microarray plattform för Korrelat analys av celldifferentiering och dragkrafter

Microfabricated cellular microarrays, which consist of contact-printed combinations of biomolecules on an elastic hydrogel surface, provide a tightly ...

Power Input Measurements in Stirred Bioreactors at Laboratory Scale

Power Input mätningar i rörs bioreaktorer på laboratorieskala

The power input in stirred bioreactors is an important scaling-up parameter and can be measured through the torque that acts on the impeller shaft during ...