Name: high throughput microrna profiling: optimized multiplex qrt-pcr at nanoliter scale on the fluidigm dynamic arraytm ifcs
Uploaded: 2011-08-03T12:00:00
Duration: 7 min 27 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about High Throughput MicroRNA Profiling: Optimized Multiplex qRT-PCR at Nanoliter Scale on the Fluidigm Dynamic ArrayTM IFCs at JoVE.com

Biz Blelloch laboratuar metin üzerinde yorum için teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma NIH (K08 NS48118 ve R01 NS057221), California Rejeneratif Tıp Enstitüsü (CIRM) (Tohum Hibe RS1-00161, Yeni Fakülte Ödülü RN2-00.906) ve Pew Charitable Trust RB fon ve FM desteklenmiştir. Wissenschaftlich Urologische Gesellschaft eV.

<ol>
	<li>Mitchell, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+microRNAs+as+stable+blood-based+markers+for+cancer+detection.">Circulating microRNAs as stable blood-based markers for cancer detection.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 10513-10518 (2008).</li><li>Tang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=220-plex+microRNA+expression+profile+of+a+single+cell.">220-plex microRNA expression profile of a single cell.</a> Nat Protoc. 1, 1154-1159 (2006).</li><li>Gertsenstein, M., Vintersten, K., Behringer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual. 3, 644-645 (2003).</li><li>Suh, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+function+is+globally+suppressed+in+mouse+oocytes+and+early+embryos.">MicroRNA function is globally suppressed in mouse oocytes and early embryos.</a> Curr Biol. 20, 271-277 (2010).</li><li>Babiarz, J. E., Ruby, J. G., Wang, Y., Bartel, D. P., Blelloch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+ES+cells+express+endogenous+shRNAs,+siRNAs,+and+other+Microprocessor-independent,+Dicer-dependent+small+RNAs.">Mouse ES cells express endogenous shRNAs, siRNAs, and other Microprocessor-independent, Dicer-dependent small RNAs.</a> Genes Dev. 22, 2773-2785 (2008).</li><li>Babiarz, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+RNAs:+their+biogenesis,+regulation+and+function+in+embryonic+stem+cells.">Small RNAs: their biogenesis, regulation and function in embryonic stem cells.</a> StemBook. , (2009).</li><li>Friedman, R. C., Farh, K. K., Burge, C. B., Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Most+mammalian+mRNAs+are+conserved+targets+of+microRNAs.">Most mammalian mRNAs are conserved targets of microRNAs.</a> Genome Res. 19, 92-105 (2008).</li><li>Wang, Y., Medvid, R., Melton, C., Jaenisch, R., Blelloch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DGCR8+is+essential+for+microRNA+biogenesis+and+silencing+of+embryonic+stem+cell+self-renewal.">DGCR8 is essential for microRNA biogenesis and silencing of embryonic stem cell self-renewal.</a> Nat Genet. 39, 380-385 (2007).</li><li>Kanellopoulou, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dicer-deficient+mouse+embryonic+stem+cells+are+defective+in+differentiation+and+centromeric+silencing.">Dicer-deficient mouse embryonic stem cells are defective in differentiation and centromeric silencing.</a> Genes Dev. 19, 489-501 (2005).</li><li>Thomson, J. M., Parker, J., Perou, C. M., Hammond, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+custom+microarray+platform+for+analysis+of+microRNA+gene+expression.">A custom microarray platform for analysis of microRNA gene expression.</a> Nat Methods. 1, 47-53 (2004).</li><li>Moltzahn, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+based+multiplex+qRT-PCR+identifies+diagnostic+and+prognostic+microRNA+signatures+in+sera+of+prostate+cancer+patients.">Microfluidic based multiplex qRT-PCR identifies diagnostic and prognostic microRNA signatures in sera of prostate cancer patients.</a> Cancer Res. 71, 550-560 (2011).</li><li>Mestdagh, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+and+universal+method+for+microRNA+RT-qPCR+data+normalization.">A novel and universal method for microRNA RT-qPCR data normalization.</a> Genome Biol. 10, R64-R64 (2009).</li></ol>

Alan Mir Fluidigm Corporation&#39;ın bir çalışanı. Aksi halde, ifşa etmek için herhangi bir mali çıkarları var.

miRNA&#39;lar kısa (18-24 nükleotidler), non-coding RNA gen ekspresyonu düzenleyen istikrarsızlaştırıcı hem haberci RNA (mRNA) ve inhibe çeviri post-transkripsiyonel, 6 insan genlerinin en az üçte biri korunmuş içeren Aslında miRNA . kendi 3&#39;UTR bağlayıcı siteleri ve hücre kaderinin kararları, doku homeostazı ve kanser gibi hastalıkların önemli bir katkı pluripotency, proliferasyonu ve apoptozis genlerinin miRNA&#39;lar belirgin etkileşimler göstermektedir. 6,7 Dolayısıyla doğru microRNA ifade profilleri geniş bir ilgi. QRT-PCR miRNA ifade profil protokol 2 yayınlanan multipleks test etmek için, negatif kontrol olarak küçük RNA eksik Mesc kullanıldı . / - DGCR8 / - Dicer ise hücreler, tüm kanonik microRNA eksik. Hücreleri kanonik ve non-canoncial micoRNAs eksikliği 8,9 / - - DGCR8 MES-vahşi tip düzeyleri karşılaştırıldığında hücreler, birçok yabani tip hücrelerin 11 10 microRNA tespit edilmedi ifade doğruluk eksikliği ortaya çıkardı. Hatta bazıları nakavt hücreleri (Şekil 3a) göre daha düşük ekspresyon düzeyleri gösterdi. Biz, doğruluk eksikliği singleplex RT-kantifikasyon önce iki ardışık multipleks adımları büyük astar, carry-over (RT-PCR öncesi) neden olabileceğini varsaydık. Ancak, RNA başlangıç ​​konsantrasyonu sınırlıdır, özellikle multipleks öncesi amplifikasyon sinyal gücünü arttırmak için gereklidir. / - Yerli poliakrilamid jeller (Şekil 2) boyutu seçimi primerler pre-PCR ürünleri arındırarak, Dgcr8 hem daha microRNA ve yanlış pozitif sinyallerin kaybı tespit doğruluğu önemli bir gelişme gösteren ve Dicer - / Ayrıca arka planlar (Şekil 3a ve 3b) nadir Dgcr8 Independent / Dicer bağımlı küçük RNA&#39;lar (Şekil 3b) 11 doğru kategorizasyonu için izin değiştirilmiş QRT-PCR yaklaşım. Bu nedenle pre-PCR ürününün uzak aşırı primerler arındırmak için ek bir adım büyük multipleks astar kullanılarak örnek başına ayarlar, özellikle de açıkça avantajlıdır. Preamplifikatörde döngülerinin optimal sayıda giriş RNA konsantrasyonları belirlenir. Belirli bir denemenin hususlar değil altında veya denge overamplify yönlendirilmelidir. Binden fazla bilinen microRNA ile, standart 384-iyi, özellikle birden çok örnekleri karşılaştırarak tabak, geniş microRNA profili için en uygun olmayabilir. Fluidigm Dinamik Dizi IFC nanoliter ölçek (6.7 nL) tek bir deney (9216 reaksiyonlar) 96 farklı microRNA karşı 96 kadar bireysel örnekleri test pipetleme adımları ve gerekli kimya önemli bir azalma sağlar. Her çalışma için analiz yazılımı amplifikasyon eğrileri, renk kodlu ısı haritaları ve çevrim eşik değerleri (Ct) sağlar. Eş zamanlı geniş çaplı bir profil deneysel sapmaların azaltır ve küçük RNA denetimleri kullanan diğer normalleşme stratejileri performans anlamına ifade değer normalleştirme, sağlar . 12 Önceden atanmış TaqMan problar ile piyasada bulunan 384 platformları ile karşılaştırıldığında, ısmarlama primer setleri ile yüksek verim profil platformu kombinasyonu yüksek deneysel esneklik sunar. Dinamik Dizi platformu ile birlikte optimize edilmiş multipleks QRT-PCR yaklaşımı başarıyla bize aynı anda 384 miRNA (Şekil 4) düzeylerindeki değişiklikler için 48 prostat kanserli hasta serumlarının ekrana ve kontrollerde başak olmadan (yani sentetik microRNA) veri normalleştirmek için izin verdi. 11 Numunelerin hazırlanması profil sonuçları adımları artışa rağmen, açıklanan yaklaşım, hatta sınırlı başlangıç ​​materyali ile bir zaman ve maliyet-etkin miRNA ifade seviyeleri için büyük bir örneklem kümesi profil yüksek kapasiteli yöntemi.

high throughput microrna profiling: optimized multiplex qrt-pcr at nanoliter scale on the fluidigm dynamic arraytm ifcs

MiRNA&#39;lar, gelişme, doku homoeostasis ve hastalığın altında yatan kritik süreçlerin geniş katılımı, araştırma ve ilaç topluluklar arasında kabaran ilgi açmıştır. MiRNA&#39;lar çalışma için, microRNA düzeylerinin ölçülmesi, doğru ve sağlam olması gereklidir. Küçük RNA eksik fare embriyonik kök hücreleri (Mesc) yabani tip karşılaştırarak, biz daha önce yayınlanmış multipleks QRT-PCR teknikleri doğruluk ve sağlamlık eksikliği saptandı. Burada, tekniğin doğruluk ve sağlamlık önemli ölçüde artırır singleplex gerçek zamanlı algılama, önce önceki multipleks adımları aşırı primerler uzak arıtma da dahil olmak üzere optimize edilmiş bir yöntem açıklanmaktadır. Ayrıca, mikroakışkan nanoliter hacimlerinde bir çip üzerinde tekniği performans nasıl biz açıklamak reaktif maliyetlerini önemli ölçüde azaltır ve zaman etkili yüksek kapasiteli miRNA ifade profil izin verir.

Watch this Scientific Journal Video about High Throughput MicroRNA Profiling: Optimized Multiplex qRT-PCR at Nanoliter Scale on the Fluidigm Dynamic ArrayTM IFCs at JoVE.com

High Throughput MicroRNA Profiling: Optimized Multiplex qRT-PCR at Nanoliter Scale on the Fluidigm Dynamic ArrayTM IFCs

Burada örnek sınırlı miktarda çalışma, özellikle microRNA (miRNA) ekspresyon düzeyleri için bir maliyet ve zaman etkili yüksek verimli bir tarama aracı olarak mikroakışkan platformu ile birlikte optimize edilmiş bir multiplex ters transkriptaz kantitatif PCR (QRT PCR) protokolü açıklamak.

Yüksek Verimli MicroRNA Profil: Optimize edilmiş, Multiplex QRT-PCR Fluidigm Dinamik ArrayTM IFCS Nanoliter Ölçeğinde

The broad involvement of miRNAs in critical processes underlying development, tissue homoeostasis and disease has led to a surging interest among the ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Cell-based Calcium Assay for Medium to High Throughput Screening of TRP Channel Functions using FlexStation 3

FlexStation kullanarak 3 TRP Kanal İşlevleri Yüksek Verimli Tarama Orta Hücre tabanlı Kalsiyum Testi

The Molecular Devices' FlexStation 3 is a benchtop multi-mode microplate reader capable of automated fluorescence measurement in multi-well plates.  It is ...

Candida albicans Biofilm Chip (CaBChip) for High-throughput Antifungal Drug Screening

Candida albicans Biofilm Chip CaBChip for High-throughput Antifungal Drug Screening

Yüksek verim Antifungal İlaç Tarama Candida albicans Biyofilm Chip (Ca BChip)

Candida  albicans remains the main etiological agent of candidiasis, which  currently represents the fourth most common nosocomial bloodstream infection ...

High-throughput Protein Expression Generator Using a Microfluidic Platform

Bir mikroakışkan Platform kullanarak Yüksek throughput Protein Ekspresyonu Jeneratör

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and ...

Synthetic Spider Silk Production on a Laboratory Scale

Bir Laboratuvar Ölçekli Sentetik Örümcek İpek Üretimi

As society progresses and resources become scarcer, it is becoming increasingly important to cultivate new technologies that engineer next generation ...

Cloning and Large-Scale Production of High-Capacity Adenoviral Vectors Based on the Human Adenovirus Type 5

İnsan Adenovirüs Tip 5 dayanarak Yüksek Kapasiteli Adenoviral Vektörler klonlanması ve Büyük Ölçekli Üretim

High-capacity adenoviral vectors (HCAdV) devoid of all viral coding sequences represent one of the most advanced gene delivery vectors due to their high ...

Describing a Transcription Factor Dependent Regulation of the MicroRNA Transcriptome

MikroRNA transcriptome bir transkripsiyon faktörü bağımlı regülasyonu açıklayan

While the transcription regulation of protein coding genes was extensively studied, little is known on how transcription factors are involved in ...

Easy and Accurate Mechano-profiling on Micropost Arrays

Micropost Diziler Kolay ve Doğru Mekanik-profil

Cell culture substrates with integrated flexible microposts enable a user to study the mechanical interactions between cells and their immediate ...

Using Tomoauto: A Protocol for High-throughput Automated Cryo-electron Tomography

Tomoauto kullanma: Bir Protokol Yüksek verim Otomatik Cryo-elektron Tomografi için

Cryo-electron tomography (Cryo-ET) is a powerful three-dimensional (3-D) imaging technique for visualizing macromolecular complexes in their native ...

A High-throughput Cell Microarray Platform for Correlative Analysis of Cell Differentiation and Traction Forces

Hücre farklılaşması ve Çekiş Kuvvetleri Korelatif Analizi için Yüksek verim Hücre Mikroarray Platformu

Microfabricated cellular microarrays, which consist of contact-printed combinations of biomolecules on an elastic hydrogel surface, provide a tightly ...

Power Input Measurements in Stirred Bioreactors at Laboratory Scale

Laboratuvar ölçekte karıştırılmış Biyoreaktörler güç giriş ölçümlerde

The power input in stirred bioreactors is an important scaling-up parameter and can be measured through the torque that acts on the impeller shaft during ...