Name: isolation and culture of cells from the nephrogenic zone of the embryonic mouse kidney
Uploaded: 2011-04-22T11:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Culture of Cells from the Nephrogenic Zone of the Embryonic Mouse Kidney at JoVE.com

Ce travail a été soutenu par R01 DK078161 du NIDDK (LO), bourses de recherche postdoctorale de l&#39;American Heart Association (AB), les Fondations Wenner-Gren de la Suède et Kungliga Fysiografiska Sällskapet, Lund, Suède (UB). Un soutien additionnel a été fourni par le Maine Medical Center Research installations essentielles Institut pour l&#39;histopathologie, la bioinformatique et FACS (soutenu par 2P20RR18789-06) et l&#39;animalerie MMCRI.

1. La préparation de réactifs pour la digestion rein <ol><li> 1,5 ml de collagénase 0,25% A (p / v) et 1% Pancréatine digérer (w / v) sera nécessaire pour l&#39;extraction des cellules de zone néphrogénique (NZCS) à partir de 8 E17.5 reins. Parce Pancréatine dure environ 2 heures pour dissoudre à la température ambiante, assez condensé solution pour le plus grand nombre de reins embryonnaires attendus doivent être réalisés avant l&#39;expérience. Préparer digérer solution en ajoutant d&#39;abord 25 ...

<ol>
	<li>Blank, U., Brown, A., Adams, D. C., Karolak, M. J., Oxburgh, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BMP7+promotes+proliferation+of+nephron+progenitor+cells+via+a+JNK-dependent+mechanism.">BMP7 promotes proliferation of nephron progenitor cells via a JNK-dependent mechanism.</a> Development. 136, 3557-3566 (2009).</li><li>Brunskill, E. W., Aronow, B. J., Georgas, K., Rumballe, B., Valerius, M. T., Aronow, J., Kaimal, V., Jegga, A. G., Grimmond, S., McMahon, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atlas+of+gene+expression+in+the+developing+kidney+at+microanatomic+resolution.">Atlas of gene expression in the developing kidney at microanatomic resolution.</a> Developmental Cell. 15, 781-791 (2008).</li><li>Godin, R. E., Takaesu, N. T., Robertson, E. J., Dudley, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+BMP7+expression+during+kidney+development.">Regulation of BMP7 expression during kidney development.</a> Development. 125, 3473-3482 (1998).</li><li>Grobstein, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inductive+epitheliomesenchymal+interaction+in+cultured+organ+rudiments+of+the+mouse.">Inductive epitheliomesenchymal interaction in cultured organ rudiments of the mouse.</a> Science. 118, 52-55 (1953).</li><li>Grobstein, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphogenetic+interaction+between+embryonic+mouse+tissues+separated+by+a+membrane+filter.">Morphogenetic interaction between embryonic mouse tissues separated by a membrane filter.</a> Nature. 172, 869-870 (1953).</li><li>Hatini, V., Huh, S. O., Herzlinger, D., Soares, V. C., Lai, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Essential+role+of+stromal+mesenchyme+in+kidney+morphogenesis+revealed+by+targeted+disruption+of+Winged+Helix+transcription+factor+BF-2.">Essential role of stromal mesenchyme in kidney morphogenesis revealed by targeted disruption of Winged Helix transcription factor BF-2.</a> Genes and Development. 10, 1467-1478 (1996).</li><li>Oxburgh, L., Chu, G. C., Michael, S. K., Robertson, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGFb+superfamily+signals+are+required+for+morphogenesis+of+the+kidney+mesenchyme+progenitor+population.">TGFb superfamily signals are required for morphogenesis of the kidney mesenchyme progenitor population.</a> Development. 131, 4593-4605 (2004).</li><li>Srinivas, S., Watanabe, T., Lin, C. S., William, C. M., Tanabe, Y., Jessell, T. M., Costantini, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cre+reporter+strains+produced+by+targeted+insertion+of+EYFP+and+ECFP+into+the+ROSA26+locus.">Cre reporter strains produced by targeted insertion of EYFP and ECFP into the ROSA26 locus.</a> BMC Developmental Biology. 1, 4-4 (2001).</li><li>Yu, J., Carroll, T. J., McMahon, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sonic+hedgehog+regulates+proliferation+and+differentiation+of+mesenchymal+cells+in+the+mouse+metanephric+kidney.">Sonic hedgehog regulates proliferation and differentiation of mesenchymal cells in the mouse metanephric kidney.</a> Development. 129, 5301-5312 (2002).</li></ol>

Dans ce protocole, nous décrivons une méthode pour isoler et cultiver les cellules de la zone néphrogénique du rein embryonnaire. Il est le développement d&#39;une méthode initialement publié dans le cadre d&#39;une étude sur les effets des traitements sur les cellules BMP7 de la zone néphrogénique (Blank et al., 2009). Dans l&#39;étude initiale, une série d&#39;expériences visant à caractériser les types de cellules représentées au sein de la population NZC ont été menées. Brièvement, la p...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Watchmaker&#x2019;s forceps #5</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roboz</td>
<td>RS-4905</td>
<td>2 pairs required</td>
</tr>
<tr>
<td>Collagenase A</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche</td>
<td>10 103 578 001</td>
<td>Wear mask</td>
</tr>
<tr>
<td>Porcine Pancreatin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P8096</td>
<td>Wear mask</td>
</tr>
<tr>
<td>DPBS w/ Ca, Mg</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Lonza</td>
<td>17-513F</td>
<td>With Mg &amp; Ca</td>
</tr>
<tr>
<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BioWhittaker</td>
<td>14-901E</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>HBSS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>14175</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>KSFM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>10724-011</td>
<td>without added growth factors</td>
</tr>
<tr>
<td>L-Glutamine 200mM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>G7513</td>
<td>Use @ 1% v/v</td>
</tr>
<tr>
<td>PenStrep 10,000 U penicillin / ml 10 mg streptomycin / ml</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P4333</td>
<td>Use @ 1% v/v</td>
</tr>
<tr>
<td>Fibronectin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Biosciences</td>
<td>356008</td>
<td>Supplied as powder</td>
</tr>
<tr>
<td>24 well culture plate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Scientific </td>
<td>142485</td>
<td>Nunclon</td>
</tr>
<tr>
<td>DPBS w/o Mg &amp; Ca</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Lonza</td>
<td>17-512F</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>5mL polystyrene tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Biosciences</td>
<td>352235</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DNase (1 U/&mu;l)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>18068-015</td>
<td>4 &mu;l per 1.5 ml</td>
</tr>
<tr>
<td>40 micron cell-strainer </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Biosciences</td>
<td>352235</td>
<td>w/cap and tube</td>
</tr>
<tr>
<td>Paraformaldehyde</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P6148</td>
<td>Use @ 4 % w/v</td>
</tr>
<tr>
<td>Triton X100</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>VW3929-2</td>
<td>Use @ 0.3 % v/v</td>
</tr>
<tr>
<td>PBS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P3813</td>
<td>Supplied as powder</td>
</tr>
<tr>
<td>Donkey serum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Jackson ImmunoResearch</td>
<td>017-000-121</td>
<td> Use @ 5 % v/v</td>
</tr>
<tr>
<td>Rabbit anti-PAX2 </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>71-6000</td>
<td>Dilute 1:100</td>
</tr>
<tr>
<td>Rabbit anti-&beta;-gal</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MP Biomedicals</td>
<td>559762</td>
<td>Dilute 1:200</td>
</tr>
<tr>
<td>Oregon Green 488 phalloidin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>O7466</td>
<td>Dilute 1:200</td>
</tr>
<tr>
<td>Donkey anti-rabbit Alexa Fluor 568</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>A10042</td>
<td>Dilute 1:200</td>
</tr>
<tr>
<td>DAPI</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>D1306</td>
<td>Dilute 1:5000</td>
</tr>
<tr>
<td>Vectashield</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Vector Laboratories</td>
<td>H-1000</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glycerol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>EMD</td>
<td>GX0185-6</td>
<td>Mix 50 % with H2O</td>
</tr>
<tr>
<td>RNeasy Micro Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Qiagen</td>
<td>74004</td>
<td>Use "DNase on column" protocol</td>
</tr>
<tr>
<td>Transfer pipettes, 3ml</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Falcon</td>
<td>357575</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

isolation and culture of cells from the nephrogenic zone of the embryonic mouse kidney

Le développement embryonnaire du rein a été largement étudié à la fois comme un modèle pour l&#39;interaction épithélio-mésenchymateuse dans l&#39;organogénèse et d&#39;acquérir la compréhension des origines de la maladie rénale congénitale. Plus récemment, la possibilité de piloter naïve cellules souches embryonnaires vers des destins néphrogénique a été explorée dans le domaine émergent de la médecine régénérative. Des études génétiques chez la souris ont identifié plusieurs voies nécessaires pour le développement du rein, et un catalogue global de la transcription du gène dans l&#39;organe a été récemment générées <a href="http://www.gudmap.org/">http://www.gudmap.org/</a> , offrant de nombreux régulateurs candidat des fonctions essentielles de développement. L&#39;organogenèse du rein chez les rongeurs peuvent être étudiés en culture d&#39;organe, et de nombreux rapports ont utilisé cette approche pour analyser les résultats des deux protéines appliquant candidat ou faire tomber l&#39;expression de gènes candidats en utilisant siRNA ou morpholinos. Cependant, l&#39;applicabilité de la culture d&#39;organes pour l&#39;étude de la signalisation qui régule la tige / différenciation de cellules progénitrices de renouvellement par rapport au niveau du rein en développement est limité en tant qu&#39;organes de culture contenant une diffusion matrice compacte limitant extracellulaire des macromolécules et des particules virales. Pour étudier la signalisation cellulaire des événements qui influencent la tige / niche de cellules progénitrices dans les reins, nous avons développé un système de cellules primaires qui établit la zone néphrogénique ou une niche de cellules progénitrices de l&#39;ex vivo du rein en développement dans l&#39;isolement de l&#39;inducteur de la différenciation épithéliale. En utilisant la digestion enzymatique limitée, les cellules de zone néphrogénique peut être sélectivement libérée de développer reins à E17.5. Après filtration, ces cellules peuvent être cultivées comme une monocouche irrégulière en utilisant des conditions optimisées. L&#39;analyse du gène marqueur démontre que ces cultures contiennent une distribution des types cellulaires caractéristiques de la zone néphrogénique in vivo, et qu&#39;ils maintiennent l&#39;expression du gène marqueur approprié pendant la période de culture. Ces cellules sont très accessibles à de petites molécules et le traitement de protéines recombinantes, et surtout aussi à la transduction virale, ce qui facilite grandement l&#39;étude de la candidate souches / progéniteurs effets régulateur de la cellule. Paramètres biologiques de base cellulaires comme la prolifération et mort cellulaire ainsi que des changements dans l&#39;expression des marqueurs moléculaires caractéristiques de néphrons cellules souches / progénitrices in vivo peuvent être utilisés avec succès comme les résultats expérimentaux. Les travaux en cours dans notre laboratoire en utilisant cette technique de cellules primaires roman vise à découvrir les mécanismes de base régissant la réglementation de l&#39;auto-renouvellement versus différenciation dans les néphrons cellules souches / progénitrices.

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Isolation and Culture of Cells from the Nephrogenic Zone of the Embryonic Mouse Kidney (Video) | JoVE

Dans ce rapport, nous décrivons une méthode pour l&#39;isolement et la culture de la niche de cellules progénitrices du rein d&#39;embryon de souris qui peuvent être utilisées pour étudier les voies de signalisation réglementant cellules souches / progénitrices du rein en développement. Ces cellules cultivées sont très accessibles à de petites molécules et le traitement de protéines recombinantes, et surtout aussi à la transduction virale, ce qui permet une manipulation efficace des voies candidat.

Isolement et culture de cellules de la zone néphrogénique du rein d&#39;embryon de souris

Embryonic development of the kidney has been extensively studied both as a model for epithelial-mesenchymal interaction in organogenesis and  to gain ...

Research

JoVE Journal

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Isolation and Culture of Cells from the Nephrogenic Zone of the Embryonic Mouse Kidney

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Mid-gestation stage mouse embryos were cultured utilizing a serum-free culture medium prepared from commercially available stem cell media supplements in ...

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Western blot analysis is a commonly employed technique for detecting and quantifying protein levels. However, for small tissue samples, this analysis ...

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Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells (Video) | JoVE

L&#39;isolement et la culture primaire de cellules endothéliales aortiques de souris

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Simultaneous Isolation and Culture of Atrial Myocytes, Ventricular Myocytes, and Non-Myocytes from an Adult Mouse Heart

Simultaneous Isolation and Culture of Atrial Myocytes, Ventricular Myocytes, and Non-Myocytes from an Adult Mouse Heart (Video) | JoVE

Isolement et culture simultanés des myocytes auriculaires, des myocytes ventriculaires et des non-myocytes provenant d’un cœur de souris adulte

The isolation and culturing of cardiac myocytes from mice has been essential for furthering the understanding of cardiac physiology and pathophysiology. ...