Name: isolation and culture of cells from the nephrogenic zone of the embryonic mouse kidney
Uploaded: 2011-04-22T11:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Culture of Cells from the Nephrogenic Zone of the Embryonic Mouse Kidney at JoVE.com

Diese Arbeit wurde von R01 DK078161 aus NIDDK (LO), Postdoc-Stipendien von der American Heart Association (AB), der Wenner-Gren-Stiftung von Schweden und Kungliga Fysiografiska Sällskapet, Lund, Schweden (UB) unterstützt. Zusätzliche Unterstützung wurde von Maine Medical Center Research Institute Core Facilities für Histopathologie, Bioinformatik und FACS (unterstützt durch 2P20RR18789-06) und die MMCRI Tierhaltung zur Verfügung gestellt.

1. Vorbereitung Reagenzien für die Nieren Verdauung <ol><li> 1,5 ml 0,25% Collagenase A (w / v) und 1% Pankreatin verdauen (w / v) Lösung zur Extraktion von nephrogenen Zone Zellen (NZCs) von 8 E17.5 Nieren notwendig sein. Da Pankreatin dauert ca. 2 Stunden bei Raumtemperatur zu lösen, genug zu verdauen Lösung für die größte Zahl von embryonalen Nieren erwarten sollte vor dem Versuch erfolgen. Bereiten Analysenlösung durch erste Zugabe von 25 mg Collagenase A bis 10 ml Dulbecco Phosphate Buffered Saline (DPBS)...

<ol>
	<li>Blank, U., Brown, A., Adams, D. C., Karolak, M. J., Oxburgh, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BMP7+promotes+proliferation+of+nephron+progenitor+cells+via+a+JNK-dependent+mechanism.">BMP7 promotes proliferation of nephron progenitor cells via a JNK-dependent mechanism.</a> Development. 136, 3557-3566 (2009).</li><li>Brunskill, E. W., Aronow, B. J., Georgas, K., Rumballe, B., Valerius, M. T., Aronow, J., Kaimal, V., Jegga, A. G., Grimmond, S., McMahon, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atlas+of+gene+expression+in+the+developing+kidney+at+microanatomic+resolution.">Atlas of gene expression in the developing kidney at microanatomic resolution.</a> Developmental Cell. 15, 781-791 (2008).</li><li>Godin, R. E., Takaesu, N. T., Robertson, E. J., Dudley, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+BMP7+expression+during+kidney+development.">Regulation of BMP7 expression during kidney development.</a> Development. 125, 3473-3482 (1998).</li><li>Grobstein, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inductive+epitheliomesenchymal+interaction+in+cultured+organ+rudiments+of+the+mouse.">Inductive epitheliomesenchymal interaction in cultured organ rudiments of the mouse.</a> Science. 118, 52-55 (1953).</li><li>Grobstein, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphogenetic+interaction+between+embryonic+mouse+tissues+separated+by+a+membrane+filter.">Morphogenetic interaction between embryonic mouse tissues separated by a membrane filter.</a> Nature. 172, 869-870 (1953).</li><li>Hatini, V., Huh, S. O., Herzlinger, D., Soares, V. C., Lai, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Essential+role+of+stromal+mesenchyme+in+kidney+morphogenesis+revealed+by+targeted+disruption+of+Winged+Helix+transcription+factor+BF-2.">Essential role of stromal mesenchyme in kidney morphogenesis revealed by targeted disruption of Winged Helix transcription factor BF-2.</a> Genes and Development. 10, 1467-1478 (1996).</li><li>Oxburgh, L., Chu, G. C., Michael, S. K., Robertson, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGFb+superfamily+signals+are+required+for+morphogenesis+of+the+kidney+mesenchyme+progenitor+population.">TGFb superfamily signals are required for morphogenesis of the kidney mesenchyme progenitor population.</a> Development. 131, 4593-4605 (2004).</li><li>Srinivas, S., Watanabe, T., Lin, C. S., William, C. M., Tanabe, Y., Jessell, T. M., Costantini, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cre+reporter+strains+produced+by+targeted+insertion+of+EYFP+and+ECFP+into+the+ROSA26+locus.">Cre reporter strains produced by targeted insertion of EYFP and ECFP into the ROSA26 locus.</a> BMC Developmental Biology. 1, 4-4 (2001).</li><li>Yu, J., Carroll, T. J., McMahon, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sonic+hedgehog+regulates+proliferation+and+differentiation+of+mesenchymal+cells+in+the+mouse+metanephric+kidney.">Sonic hedgehog regulates proliferation and differentiation of mesenchymal cells in the mouse metanephric kidney.</a> Development. 129, 5301-5312 (2002).</li></ol>

In diesem Protokoll beschreiben wir eine Methode zur Isolierung und Kultivierung von Zellen aus dem nephrogenen Zone der embryonalen Niere. Es ist die Entwicklung einer Methode zunächst als Teil einer Studie über die Auswirkungen der BMP7 Behandlung auf Zellen des nephrogenen Zone (Blank et al., 2009) veröffentlicht. In der ersten Studie wurden eine Reihe von Experimenten, die Zelltypen innerhalb der NZC Bevölkerung vertreten charakterisieren durchgeführt. Kurz gesagt, Reinigung von NZCs aus genetischen Re...

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Watchmaker&#x2019;s forceps #5</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roboz</td>
<td>RS-4905</td>
<td>2 pairs required</td>
</tr>
<tr>
<td>Collagenase A</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche</td>
<td>10 103 578 001</td>
<td>Wear mask</td>
</tr>
<tr>
<td>Porcine Pancreatin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P8096</td>
<td>Wear mask</td>
</tr>
<tr>
<td>DPBS w/ Ca, Mg</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Lonza</td>
<td>17-513F</td>
<td>With Mg &amp; Ca</td>
</tr>
<tr>
<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BioWhittaker</td>
<td>14-901E</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>HBSS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>14175</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>KSFM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>10724-011</td>
<td>without added growth factors</td>
</tr>
<tr>
<td>L-Glutamine 200mM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>G7513</td>
<td>Use @ 1% v/v</td>
</tr>
<tr>
<td>PenStrep 10,000 U penicillin / ml 10 mg streptomycin / ml</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P4333</td>
<td>Use @ 1% v/v</td>
</tr>
<tr>
<td>Fibronectin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Biosciences</td>
<td>356008</td>
<td>Supplied as powder</td>
</tr>
<tr>
<td>24 well culture plate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Scientific </td>
<td>142485</td>
<td>Nunclon</td>
</tr>
<tr>
<td>DPBS w/o Mg &amp; Ca</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Lonza</td>
<td>17-512F</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>5mL polystyrene tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Biosciences</td>
<td>352235</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DNase (1 U/&mu;l)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>18068-015</td>
<td>4 &mu;l per 1.5 ml</td>
</tr>
<tr>
<td>40 micron cell-strainer </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Biosciences</td>
<td>352235</td>
<td>w/cap and tube</td>
</tr>
<tr>
<td>Paraformaldehyde</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P6148</td>
<td>Use @ 4 % w/v</td>
</tr>
<tr>
<td>Triton X100</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>VW3929-2</td>
<td>Use @ 0.3 % v/v</td>
</tr>
<tr>
<td>PBS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P3813</td>
<td>Supplied as powder</td>
</tr>
<tr>
<td>Donkey serum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Jackson ImmunoResearch</td>
<td>017-000-121</td>
<td> Use @ 5 % v/v</td>
</tr>
<tr>
<td>Rabbit anti-PAX2 </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>71-6000</td>
<td>Dilute 1:100</td>
</tr>
<tr>
<td>Rabbit anti-&beta;-gal</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MP Biomedicals</td>
<td>559762</td>
<td>Dilute 1:200</td>
</tr>
<tr>
<td>Oregon Green 488 phalloidin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>O7466</td>
<td>Dilute 1:200</td>
</tr>
<tr>
<td>Donkey anti-rabbit Alexa Fluor 568</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>A10042</td>
<td>Dilute 1:200</td>
</tr>
<tr>
<td>DAPI</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>D1306</td>
<td>Dilute 1:5000</td>
</tr>
<tr>
<td>Vectashield</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Vector Laboratories</td>
<td>H-1000</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glycerol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>EMD</td>
<td>GX0185-6</td>
<td>Mix 50 % with H2O</td>
</tr>
<tr>
<td>RNeasy Micro Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Qiagen</td>
<td>74004</td>
<td>Use "DNase on column" protocol</td>
</tr>
<tr>
<td>Transfer pipettes, 3ml</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Falcon</td>
<td>357575</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

isolation and culture of cells from the nephrogenic zone of the embryonic mouse kidney

Embryonalentwicklung der Niere wurde ausgiebig sowohl als Modell für die epithelial-mesenchymale Interaktion in der Organentwicklung und das Verständnis für die Ursprünge der angeborenen Nierenerkrankungen zu gewinnen untersucht. In jüngerer Zeit hat die Möglichkeit der Steuerung naiv embryonalen Stammzellen in Richtung nephrogenen Schicksale in dem aufstrebenden Gebiet der regenerativen Medizin erforscht. Genetische Studien in der Maus haben mehrere Wege für Nieren-Entwicklung erforderlich identifiziert, und einen globalen Katalog der Gen-Transkription in die Orgel wurde vor kurzem generiert <a href="http://www.gudmap.org/">http://www.gudmap.org/</a> und bietet zahlreiche Kandidaten Regulatoren der wesentlichen Entwicklungs-Funktionen. Organogenesis der Nagetier-Niere kann in Organkultur untersucht werden, und viele Berichte haben diesen Ansatz verwendet, um die Ergebnisse der beiden Kandidaten die Anwendung Proteine ​​oder klopfen Sie den Ausdruck von Kandidatengenen mittels siRNA oder Morpholinos analysieren. Allerdings ist die Anwendbarkeit der Organkultur dem Studium der signalisiert, dass Stammzellen / Vorläuferzellen Zelldifferenzierung gegenüber Erneuerung regelt in den Entwicklungsländern Niere begrenzt, da kultivierten Organe einer kompakten extrazellulären Matrix Diffusionsgrenzstrom von Makromolekülen und Viruspartikel enthalten. Um die Zelle Signalwege, die den Stamm / Progenitorzellen Nische in der Niere haben wir eine primäre Zelle, das die nephrogenen Zone oder Progenitorzellen Nische der Entwicklung von Niere ex vivo isoliert von der epithelialen Induktor der Differenzierung schafft entwickelt haben Einfluss zu studieren. Mit begrenzten enzymatische Verdauung, können nephrogenen Zone Zellen selektiv befreit von sich entwickelnden Nieren bei E17.5. Nach der Filtration, können diese Zellen als eine unregelmäßige Monoschicht mit optimierten Bedingungen kultiviert werden. Marker-Gen-Analyse zeigt, dass diese Kulturen eine Verteilung von Zelltypen Merkmal der nephrogenen Zone in vivo enthalten, und dass sie unterhalten geeignete Marker-Gen-Expression während der Kulturzeit. Diese Zellen sind sehr zugänglich für kleine Molekül und rekombinante Protein Behandlung und allem auch auf virale Transduktion, die erleichtert das Studium der Kandidat Stamm / Progenitorzellen Regler Effekte. Grundlegende zellbiologische Parameter wie Proliferation und Zelltod sowie Veränderungen in der Expression von molekularen Markern Merkmal Nephron Stammzellen / Vorläuferzellen in vivo erfolgreich als experimentellen Ergebnissen verwendet werden. Laufende Arbeiten in unserem Labor mit Hilfe dieser neuartigen primären Zelle Technik zielt darauf ab, die grundlegenden Mechanismen für die Regulierung von Selbst-Erneuerung im Vergleich Differenzierung in Nephron Stammzellen / Vorläuferzellen aufzudecken.

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Isolation and Culture of Cells from the Nephrogenic Zone of the Embryonic Mouse Kidney

In diesem Bericht beschreiben wir eine Methode zur Isolierung und Kultivierung der Progenitorzellen Nische aus der embryonalen Maus-Niere, die verwendet werden, um Signalwege Regulierspindel / Vorläuferzellen des sich entwickelnden Nieren untersucht werden können. Diese kultivierten Zellen sind sehr zugänglich kleines Molekül und rekombinante Protein Behandlung und allem auch auf virale Transduktion, die einer effizienten Handhabung von Kandidaten Wege ermöglicht.

Isolierung und Kultivierung von Zellen aus dem Nephrogene Zone der embryonalen Maus Niere

Embryonic development of the kidney has been extensively studied both as a model for epithelial-mesenchymal interaction in organogenesis and  to gain ...

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation and Derivation of Mouse Embryonic Germinal Cells

Isolation und Ableitung von embryonalen Maus-Keimzellen

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental ...

Forschung

Biologie

Isolation and Culture of Avian Embryonic Valvular Progenitor Cells

Isolierung und Kultivierung von Avian Embryonale Valvular Progenitorzellen

Proper formation and function of embryonic heart valves is critical for developmental progression. The early embryonic heart is a U-shaped tube of ...

Isolation of Retinal Stem Cells from the Mouse Eye

Isolierung von Retinal Stammzellen aus der Maus Eye

The adult mouse retinal stem cell (RSC) is a rare quiescent cell found within the ciliary epithelium (CE) of the mammalian eye1,2,3. The CE is made up of ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

Generation der Mäuse aus induzierten pluripotenten Stammzellen

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

Mouse Embryonic Development in a Serum-free Whole Embryo Culture System

Maus embryonalen Entwicklung in einem Serum-freien Whole Embryo Culture-System

Mid-gestation stage mouse embryos were cultured utilizing a serum-free culture medium prepared from commercially available stem cell media supplements in ...

Isolation and Culture of Dental Epithelial Stem Cells from the Adult Mouse Incisor

Isolation und Kultur der Dental epithelialen Stammzellen aus dem erwachsenen Maus Schneidezahn

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse ...

Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

Isolierung von murinen Ventil Endothelzellen

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and ...

Protein Isolation from the Developing Embryonic Mouse Heart Valve Region

Proteinisolierung aus den Entwicklungs embryonalen Mäuseherzklappen Region

Western blot analysis is a commonly employed technique for detecting and quantifying protein levels. However, for small tissue samples, this analysis ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

Isolation und Primärkultur von Maus Aortic Endothelial Cells

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Simultaneous Isolation and Culture of Atrial Myocytes, Ventricular Myocytes, and Non-Myocytes from an Adult Mouse Heart

Gleichzeitige Isolierung und Kultur von Atrial Myozyten, ventrikulären Myozyten und Nicht-Myozyten aus einem erwachsenen Mausherz

The isolation and culturing of cardiac myocytes from mice has been essential for furthering the understanding of cardiac physiology and pathophysiology. ...