Name: modified es / op9 co-culture protocol provides enhanced characterization of hematopoietic progeny
Uploaded: 2011-06-07T13:00:00
Duration: 8 min 36 s
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हम mStrawberry OP9 सेल लाइन की स्थापना और परीक्षण के लिए अमेरिकी गणपति धन्यवाद. इसके अतिरिक्त, हम एच. Shafifor सह संस्कृति के साथ उसकी सहायता धन्यवाद. हिमाचल प्रदेश के राष्ट्रीय हृदय, फेफड़े और रक्त संस्थान (F31HL087714) (हिमाचल प्रदेश) से एक फैलोशिप द्वारा समर्थित है. इस काम की सामग्री केवल लेखक की जिम्मेदारी है और राष्ट्रीय हृदय, फेफड़े और रक्त संस्थान या स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान (NIH) के आधिकारिक विचार जरूरी नहीं प्रतिनिधित्व करते हैं. UCLA फ्लो Cytometry कोर सुविधा (सीए 16,042 और ऐ - 28,697) एनआईएच, Jonsson कैंसर केंद्र, UCLA एड्स संस्थान, और UCLA स्कूल ऑफ मेडिसिन के द्वारा समर्थित है.

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ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

MStrawberry OP9 सह संस्कृति के 5 दिवस पर Flk1 + hemangioblasts के उत्पादन में कोशिकाओं के परिणाम मिला हुआ परत पर ES कोशिकाओं के समुचित भेदभाव. Hemangioblasts को प्रकट करना चाहिए के रूप में कोशिकाओं की whorls ढेर, जैसा कि चित्र 1 में मनाया. सह संस्कृति के शेष के लिए, दिखाई संतान ES व्युत्पन्न hematopoietic कोशिकाओं के समूहों (चित्रा 1) के रूप में प्रकट करना चाहिए. 7 / Day6 से कम दो से चार सेल समूहों दिखाई देगा और सह संस्कृति / 8 9 दिन से बड़ा सेल समूहों (दोनों पक्षपाती और निलंबन में) के रूप में विकसित होने चाहिए. अन्य ES व्युत्पन्न संतान भी पाए जाते हैं कसकर पक्षपाती stromal सेल परत के भीतर ही है. हालांकि प्रोटोकॉल में सूचीबद्ध नहीं है, यह पूर्व परीक्षण FBS ES मध्यम विकास, mStrawberry OP9 विकास मीडिया और / ES mStrawberry OP9 भेदभाव मीडिया में इस्तेमाल किया के लिए महत्वपूर्ण है. ठीक से परीक्षण सीरम भेदभाव के 5 दिन तक mStrawberry OP9 कोशिकाओं के समुचित विकास के रूप में के रूप में अच्छी तरह से ES कोशिकाओं के सह संस्कृति में भेदभाव उचित यह सुनिश्चित करना चाहिए. एक विकल्प के रूप में या mStrawberry OP9 कोशिकाओं के अलावा, OP9 कोशिकाओं 8000 rads पर, विकिरणित confluency पर (7.8x10 4 कोशिकाओं / 2 सेमी) बोने से पहले कर सकते हैं ,. OP9 कोशिकाओं के किरणन दोहराया replating चरणों के उन्मूलन के लिए अनुमति देता है, के रूप में अच्छी तरह के रूप में पुराने के लगभग पूर्ण उन्मूलन के लिए अनुमति देता है, बहाव assays से OP9 कोशिकाओं contaminating. OP9 कोशिकाओं के लिए एक सीएमवी प्रमोटर के नियंत्रण (वेक्टर pRRLsin - सीएमवी, UCLA वेक्टर कोर) के तहत एक lentiviral वेक्टर व्यक्त mStrawberry 3ug/mL के साथ OP9 कोशिकाओं transducing mStrawberry प्रोटीन व्यक्त इंजीनियर थे. मानक ES/OP9 सह संस्कृति प्रोटोकॉल एक मिला हुआ परत OP9 कोशिकाओं पर ES कोशिकाओं के स्थान पड़ेगा, के रूप में अच्छी तरह के रूप में, एक दिन में 5 replating कदम क्रम में करने के लिए पुराने को कम करने, सेल के पारित होने से OP9 कोशिकाओं contaminating. इसके अतिरिक्त, केवल hematopoietic निलंबन में पाया कोशिकाओं ES-व्युत्पन्न संतान के मूल्यांकन के लिए हटा रहे हैं. हालांकि, दोनों एक replating कदम है और केवल निलंबन कोशिकाओं की कटाई के साथ एक संभावित विकास की एक पर्याप्त संख्या ES-व्युत्पन्न hematopoietic कोशिकाओं याद करते हैं. यह समस्या महत्वपूर्ण हो जाता है पता है जब hematopoietic पीटा ES लाइनों के साथ जुड़े दोषों विशेषताएँ की कोशिश कर रहा है. आदेश में इस मुद्दे को दरकिनार करने के लिए हमारी प्रयोगशाला mStrawberry OP9 कोशिकाओं व्यक्त करने के उपयोग के माध्यम से एक संशोधित सह संस्कृति, इस्तेमाल किया. यह भरोसा दिलाते हैं कि सभी ES संतान 5 दिन में सह संस्कृति जारी करने के लिए स्थानांतरित कर रहे हैं, और बहाव assays के लिए सभी ES-व्युत्पन्न संतान की फसल के लिए. इस संशोधन मूल्यांकन और hematopoietic दोनों मानव और माउस ES लाइनों से व्युत्पन्न संतान के लक्षण वर्णन में एक उपयोगी उपकरण प्रदान करता है. यह ES - mStrawberry OP9 सह संस्कृति विभिन्न चरणों आदिम और निश्चित hematopoiesis मॉडल स्मरण दिलाता है. Hematopoietic विकास के प्रारंभिक चरणों के अध्ययन में, कई लोगों को (कॉलोनी गठन सेल ब्लास्ट की तरह) बीएल सीएफसी परख, जो ES सेल से hemangioblast के विकास का आकलन उपयोग करें. जबकि बीएल-सीएफसी परख एक उपयोगी उपकरण है जब जल्दी hematopoietic विकास जांच, mStrawberry ES-सह संस्कृति प्रणालियों के रूप में वृद्धि उपयोगिता दर्शाती यह hemangioblast के मूल्यांकन के रूप में अच्छी तरह के रूप में, और अधिक वयस्क hematopoietic प्रजातियों के लिए अनुमति देता है. पिछला पारंपरिक OP9/ES और EB भेदभाव प्रोटोकॉल का उपयोग कर काम दिखाया गया है कि अतिरिक्त शायद HoxB4 की overexpression के रूप में आवश्यक हो, आदेश में कारकों दीर्घकालिक प्राप्त करने के लिए इन विट्रो में hematopoietic स्टेम सेल repopulating. अतिरिक्त काम का आकलन है कि mStrawberry नकारात्मक, हल ES-व्युत्पन्न आबादी सच hematopoietic स्टेम सेल होते आवश्यक है.

ओपी 9 सेल रखरखाव मध्यम स्टॉक अवयव <table border="1"><tbody><tr><td> अभिकर्मक के नाम </td><td> कंपनी </td><td> सूचि संख्या </td><td> टिप्पणियाँ </td></tr><tr><td> aMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 12571-063 </td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td> ओमेगा वैज्ञानिक </td><td> FB01 </td><td> पूर्व परीक्षण </td></tr><tr><td> एल-glutamine </td><td> Cellgro </td><td> 25 005-CI </td><td> 200nM </td></tr><tr><td> Trypsin - EDTA </td><td> कक्ष टेक्नोलॉजीज स्टेम </td><td> 07901 </td><td></td></tr></tbody></table> ES/OP-9 सेल भेदभाव मध्यम स्टॉक अवयव <table border="1"><tbody><tr><td> अभिकर्मक के नाम </td><td> कंपनी </td><td> सूचि संख्या </td><td> टिप्पणियाँ </td></tr><tr><td> aMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 12571-063 </td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td> Hyclone </td><td> SH30070 </td><td> पूर्व परीक्षण </td></tr><tr><td> एल-glutamine </td><td> Cellgro </td><td> 25 005-CI </td><td> 200mm </td></tr><tr><td> पीबीएस (2 Ca बिना मिलीग्राम + और ​​+ 2) </td><td> Cellgro </td><td> 21-031-CV </td><td></td></tr><tr><td> Trypsin - EDTA </td><td> कक्ष टेक्नोलॉजीज स्टेम </td><td> 07901 </td><td></td></tr></tbody></table>

modified es / op9 co-culture protocol provides enhanced characterization of hematopoietic progeny

एक hematopoietic सेल भाग्य की दिशा में ES कोशिकाओं की इन विट्रो में भेदभाव उपयोगी है जब सेल आबादी है कि vivo में है और जल्द से जल्द hematopoiesis में शामिल जीनों भ्रूण lethalities के साथ सौदा करने के लिए बिना, के लिए निस्र्पक का उपयोग करने के लिए मुश्किल हैं का अध्ययन. ES/OP9 प्रणाली सह संस्कृति मूल मैक्रोफेज के अधिक उत्पादन के बिना hematopoietic संतान, उत्पादन के लिए डिजाइन किया गया था, के रूप में OP9 stromal सेल लाइन osteopetrosis उत्परिवर्ती चूहों कि एम-CSF कार्यात्मक कमी calvaria से ली गई है. इन विट्रो ES/OP9 सह संस्कृति प्रणाली में क्रम में करने के लिए जल्दी hematopoietic विकास पुनरावृत्ति इस्तेमाल किया जा सकता है . जब OP9 stromal कोशिकाओं पर सुसंस्कृत, ES कोशिकाओं Flk-1 + hemangioblasts, hematopoietic progenitors, और अंत में परिपक्व, terminally विभेदित प्रजातियों में अंतर है. मानक प्रोटोकॉल ES/OP9 सह संस्कृति OP9 कोशिकाओं के एक मिला हुआ परत पर ES कोशिकाओं की नियुक्ति की जरूरत पर जोर देता है, के रूप में अच्छी तरह के रूप में, आवधिक replating कदम क्रम में पुराने को हटाने के लिए, OP9 कोशिकाओं contaminating. इसके अलावा, मौजूदा प्रोटोकॉल केवल hematopoietic निलंबन में पाया कोशिकाओं का मूल्यांकन शामिल है अनुकूलित कर रहे हैं और भेदभाव के प्रत्येक दिन पर ES-व्युत्पन्न संतान के मूल्यांकन के लिए नहीं. हालांकि, replating कदम और केवल निलंबन कोशिकाओं की कटाई के साथ एक संभावित ES व्युत्पन्न संतान और hematopoietic कोशिकाओं के विकास का एक बड़ा हिस्सा याद करते हैं. यह समस्या महत्वपूर्ण हो जाता है पता है जब hematopoietic पीटा ES लाइनों के साथ जुड़े दोषों विशेषताएँ की कोशिश कर रहा है. यहाँ हम एक संशोधित / ES mStrawberry OP9 सह संस्कृति, जो बहाव assays से OP9 कोशिकाओं contaminating के उन्मूलन के लिए अनुमति देता है का वर्णन. इस विधि सह संस्कृति के सभी दिनों में सभी ES व्युत्पन्न संतान का पूरा मूल्यांकन के लिए अनुमति देता है, एक hematopoietic भेदभाव पैटर्न है, जो और अधिक सीधे hematopoietic भेदभाव भ्रूण के भीतर मनाया पैटर्न से मेल खाती है है में जिसके परिणामस्वरूप.

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Modified ES / OP9 Co-Culture Protocol Provides Enhanced Characterization of Hematopoietic Progeny

mStrawberry OP9 कोशिकाओं सह संस्कृति से सभी ES-व्युत्पन्न संतान का पूरा मूल्यांकन के लिए अनुमति देते हैं.

संशोधित ES / OP9 प्रोटोकॉल सह - संस्कृति hematopoietic संतान की बढ़ी विशेषता प्रदान करता है

The in vitro differentiation of ES cells towards a hematopoietic cell fate is useful when studying cell populations that are difficult to access in vivo ...

Research

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