Name: nanodrop microvolume quantitation of nucleic acids
Uploaded: 2010-11-22T17:00:00
Duration: 9 min 28 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about NanoDrop Microvolume Quantitation of Nucleic Acids at JoVE.com

Richard W. Beringer och David L. Ask, Program Forskare, Thermo Scientific NanoDrop produkter, tekniskt stöd och filmning.

1. Microvolume nukleinsyra Kvantifiering med hjälp av en NanoDrop 2000c Spektrofotometer <ol><li> Till att börja rengöra den övre och nedre optiska ytor microvolume spektrofotometer prov återhållningssystem genom att pipettera från 2 till 3 mikroliter av rent avjoniserat vatten på den nedre optiska ytan. </li><li> Stäng hävarmen, se till att den övre sockeln kommer i kontakt med avjoniserat vatten. Lyft arm och torka av både optiska ytor med en ren, torr, luddfri lab torka. </li><li> Öppna NanoDrop programvara och välj nukleinsyra ansökan. Använd en liten volym, kalibrerad pipett för att utföra en tom mätning genom att man avskaffar en mikroliter av buffert på den nedre optiska ytan. Sänk armen och välj &quot;Blank&quot; i nukleinsyra ansökan. </li><li> När tom mätningen är klar, ren både optiska ytor med en ren, torr, luddfri lab torka. </li><li> Välj lämplig konstant för det urval som ska mätas. <table border="1"><tbody><tr><td> Provtyp </td><td> Välj Alternativ </td><td> Konstant Används för att beräkna Koncentration </td></tr><tr><td> dsDNA </td><td> DNA-50 </td><td> 50 </td></tr><tr><td> ssDNA </td><td> DNA-33 </td><td> 33 </td></tr><tr><td> RNA </td><td> RNA-40 </td><td> 40 </td></tr><tr><td> Oligo </td><td> Anpassad </td><td> 15-150 </td></tr></tbody></table> Tabell 1. Typiska nukleinsyra koncentrationsintervall för direkt A280 absorbansen mätningar med en NanoDrop microvolume spektrofotometer, en traditionell kyvett-baserad spektrometer används med en TrayCell microcell kyvett, och en microvolume NanoDrop fluorospectrometer i samband med PicoGreen analysen. </li><li> Dispensera 1 mikroliter av nukleinsyra prov på den nedre optiska piedestal och stäng hävarm. Eftersom mätningen är volymen oberoende, behöver provet bara för att överbrygga klyftan mellan de två optiska ytor för en mätning göras. </li><li> Välj &quot;Mät&quot; i programmet. Programvaran kommer automatiskt att beräkna den nukleinsyra koncentration och renhet nyckeltal. Följande exempel mätning, granska spektrala utgång. </li><li> Programvaran kommer automatiskt att beräkna den nukleinsyra koncentration och renhet nyckeltal. Följande exempel mätning, granska spektrala bilden för att bedöma prov kvalitet. </li><li> En typisk nukleinsyra prov kommer att ha en mycket karakteristisk profil. <img src="/files/ftp_upload/2565/2565fig1.jpg" alt="Figur 1" /> Figur 1. En typisk nukleinsyra prov kommer att ha en mycket karakteristisk profil. </li><li> Vanliga källor till föroreningar i samband med särskilda nukleinsyra tekniker syra isolering inkluderar Fenol / Trizol och kolumn extraktion. Vid fenol / Trizol utvinning, kan resterande reagens föroreningar anges genom onormal spektra mellan 220-240 nm samt av förändringar i de 260 till 280 nm regionen. Omvänt kan rester guanidin från kolumn utvinning bidrar till en topp nära 230 nm och en förskjutning i tråget från 230 nm till ca 240 nm. <img src="/files/ftp_upload/2565/2565fig2.jpg" alt="Figur 2" /> Figur 2. Förändringar i toppar och dalar av prov B och C jämfört med prov A illustrera hur föroreningar kan påverka spektra av nukleinsyra prover. </li><li> Att exakt bedöma prov kvalitet bör 260/280 eller 260/230 nyckeltal analyseras i kombination med övergripande spektrala kvaliteten. Ren nukleinsyror ger oftast en 260/280 förhållandet mellan ~ 1,8 och en 260/280 förhållandet ~ 2,0 för DNA och RNA, respektive. Detta förhållande är beroende av pH och jonstyrka i bufferten används för att göra den tomma och mätningar prov. Sura lösningar kommer att under-representera förhållandet med 0,2-0,3, medan en grundläggande lösning kommer att över-representera förhållandet med 0,2-0,3. Signifikant olika renhet nyckeltal kan tyda på närvaro av protein, fenol eller andra föroreningar som absorberar starkt vid eller nära 280 nm. Den 260/230 renhet förhållandet är en andra åtgärd av DNA renhet med värden för ett &quot;rent&quot; nukleinsyra vanligen i intervallet 1,8-2,2. Renhet nyckeltal som är betydligt lägre än de förväntade värden kan indikera isolering teknik som används kan kräva ytterligare optimering. </li><li> NanoDrop spektrofotometrar kan även användas för att kvantifiera proteiner med direkta absorbans eller protein kolorimetrisk analyser. För att säkerställa korrekt kolumn bildning och reproducerbarhet, är 2-l prover rekommenderas för proteinet prover. Se följande JUPITER videon: Microvolume proteinkoncentration Fastställande Använda NanoDrop Spektrofotometer <a href="http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=1610">http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=1610</a> </li></ol><ol><li> För att visa högkänsliga microvolume nukleinsyra kvantifiering med NanoDrop 3300, är ​​en PicoGreen fluorescens kit används. Till att börja balansera satsen standarderna och alla nukleinsyra prover syra till rumstemperatur. Fluorescerande prover är ljuskänsliga och bör förvaras i gult eller aluminiumrör inslagna. </li><li> Förbered tillräckligt 1x TE buffert för alla standarder och prov som skall mätas samt för PicoGreen arbetar lösning som kommer att behövas. Förbered 1xTE buffert genom att späda den medföljande 20x TE buffert med nukleasfritt vatten per tillverkarens protokollet. Reaktion volymerna kan variera från 200 mikroliter till så lite som 10 ul. I detta exempel kommer 10 mikroliter reaktionsvolym vara beredd. </li><li> Förbered seriellt utspädd dsDNA standarder på 2x den önskade slutgiltiga koncentrationen i nukleasfritt flaskor eller rör. Överföring 5 mikroliter av varje av den utspädda dsDNA standarderna i en enskild märkt nukleasfritt gul eller folie-täckt rör. </li><li> Alikvotera 5 mikroliter av varje dsDNA urval av intresse i korrekt märkta nukleasfritt gul eller folie-täckt rör. </li><li> Förbered PicoGreen fungerande lösning enligt tillverkarens protokollet. Överför en lika stor volym av PicoGreen fungerande lösning till varje rör som innehåller antingen en standard eller prov av intresse (5 mikroliter i detta exempel). </li><li> Kombinera lika stora volymer av 1x TE buffert och PicoGreen fungerande lösning för att förbereda den negativa kontrollen, som fungerar som en referens lösning. </li><li> Blanda innehållet i varje reaktionsrör noggrant genom försiktig pipettering och inkubera de reaktioner vid rumstemperatur i 5 minuter. Alla standarder och prover bör återfå samma temperatur innan mätning som fluorescenssignalen påverkas av temperaturen. </li><li> För att förbereda instrumentet och göra mätningar, först rena den nedre och övre ytorna av provet behålla systemet. Pipettera 2 till 3 mikroliter av avjoniserat vatten på den nedre optiska ytan, stäng sedan öppnar hävarmen och blot övre och nedre piedestaler med en ren, luddfri, laboratorium torka. Se till att ytorna är fria från ludd innan så ludd kan uppvisa fluorescens i närvaro av en exciteringskälla och kan störa mätningen. </li><li> Öppna instrumentets programvara, välj &quot;Nucleic Acids&quot; programmet och välj &quot;PicoGreen-dsDNA&quot; alternativet. </li><li> Att blanka instrumentet, tillsätt 2 mikroliter 1X TE till de lägre piedestal, stäng armen och välj &quot;Blank&quot; i instrumentets programvara fältet. När tomt är klar blot bort blindlösning från båda ytorna av provet behålla systemet. </li><li> Blanda referenslösningen genom försiktig pipettering. Med låg retention tips, pipett 2 mikroliter på den nedre sockeln och stäng armen. </li><li> Välj &quot;Referens&quot; i mätningen typ och välj önskad enheter. Klicka på &quot;åtgärd&quot; att inleda mätcykeln. </li><li> När mätningen cykeln är klar öppnar armen och grundligt blot av provet ytorna behålla systemet. Mät upp till fem replikat av referens, med hjälp av ett nytt delprov för varje replikera. </li><li> Upprepa processen för ytterligare standarder för att bygga upp en standardkurva. Upp till sju standarder får användas. Programvaran är utformad för att lagra upp till fem replikat för varje standard. Replikat av standarder är i genomsnitt för att generera en standardkurva som stickprovet koncentrationerna bestäms automatiskt. </li><li> När standardkurva är klar, välj &quot;Samples&quot; fliken, skriv in respektive information prov-ID och mäta varje okänt prov. </li></ol>

<ol>
	<li>Wilfinger, W. W., Mackey, K., Chomczynski, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+pH+and+Ionic+Strength+on+the+Spectrophotometric+Assessment+of+Nucleic+Acid+Purity.">Effect of pH and Ionic Strength on the Spectrophotometric Assessment of Nucleic Acid Purity.</a> BioTechniques. 22, 474-481 (1997).</li><li>Voolstra, C., Jungnickel, A., Borrmann, L., Kirchner, R., Huber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectrophotometric+Quantification+of+Nucleic+Acids:+LabelGuard+enables+photometric+quantification+of+submicroliter+samples+using+a+standard+photometer.">Spectrophotometric Quantification of Nucleic Acids: LabelGuard enables photometric quantification of submicroliter samples using a standard photometer.</a> Implen Applications Note. , (2006).</li><li>Jr, I. n. g. l. e., D, J., Crouch, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Spectrochemical analysis. , XV-590 (1988).</li><li>Van Lancker, M., Gheyssens, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+four+frequently+used+assays+for+quantitative+determination+of+DNA.">A comparison of four frequently used assays for quantitative determination of DNA.</a> Anal. Lett. 19, 615-623 (1986).</li></ol>

Philippe Desjardins och Debra Conklin är anställda av Thermo Scientific NanoDrop Products, Inc som tillverkar de instrument som används i denna artikel.

Kvantitering protokollen som presenteras här är baserade på den mest accepterade microvolume system. Sådana system ger praktiska alternativ för traditionella nukleinsyra kvantifiering metodik, som förlitar sig på större prov volymer och användning av inneslutning apparater. NanoDrop microvolume tekniken använder ett system prov bevarande som bygger på egenskaperna ytspänningen av provet som mäts för att bilda en vätska kolumn. Det är viktigt att provet kommer i kontakt med övre och nedre optisk mätning ytor för korrekt kolumn bildas. Om det vid något tillfälle mätresultaten verkar vara felaktiga eller inte reproducerbar, är det sannolikt ett resultat av prov heterogenitet eller flytande kolumnen brott. Tvätt-och isopropylalkohol rekommenderas inte rengöringsmedel eftersom de kan uncondition ytorna piedestal mätningen. En obetingad piedestal uppstår när de hydrofoba ytegenskaper av sockeln har äventyrats, vilket resulterar i en utplaning av provet droppen. Obetingade piedestaler kan leda till brott av vätskan kolumnen under mätningen. <img src="/files/ftp_upload/2565/2565fig3.jpg" alt="Figur 3" /> Figur 3. Obetingade yta kännetecknas av en flackare en vattendroppe. Uncondtioned piedestal ytor kan renoveras med hjälp av NanoDrop sockel Renovering Compound (PR-1, Thermo Scientific NanoDrop Products). Ett tunt lager av rekonditionering förening appliceras på övre och nedre piedestal ytor, få torka ~ 30 sekunder och sedan gnuggas bort med en ren, torr, luddfri lab torka. Ett framgångsrikt rekonditionerade tillståndet kännetecknas av en vattendroppe beading upp när den tillämpas till botten piedestal ytan. <img src="/files/ftp_upload/2565/2565fig4.jpg" alt="Figur 4" /> Figur 4. En renoverad yta kännetecknas av en beading av en vattendroppe. Microvolume kvantifiering system minskar kraftigt prov konsumtion och dramatiskt öka koncentrationen intervallet jämfört med mer traditionella kvantifiering system. Även microvolume kvantifiering har blivit ofta en möjliggörande teknik för omständigheter som innebär begränsad cellmassan som nål biopsier och laser-capture microdissection, effektivitet och enkel användning av denna metod har gjort det ett allmänt accepterat alternativ till traditionella nukleinsyra metoder kvantifiering även När provet är riklig.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>NanoDrop 2000c</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Fisher Scientific</td>
<td>ND-2000C</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>NanoDrop 3300</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Fisher Scientific</td>
<td>ND-3300</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

nanodrop microvolume quantitation of nucleic acids

Biomolekylära analyser utvecklas ständigt som använder allt mindre mängder av material, ofta hindrar användningen av konventionella kyvett styrmedel för nukleinsyra kvantifiering för dem som kan utföra microvolume kvantifiering. Den NanoDrop microvolume prov retention system (Thermo Scientific NanoDrop produkter) funktioner genom att kombinera fiberoptisk teknik och naturliga ytegenskaper spänning för att fånga och behålla små mängder av provet oberoende av traditionella inneslutning anordning såsom kyvetter eller kapillärer. Dessutom använder systemet kortare väglängd, vilket resulterar i ett brett spektrum av nukleinsyra mätningar syrakoncentration, huvudsakligen eliminerar behovet av att utföra spädningar. Att minska mängden av provet som krävs för spektroskopiska analyser underlättar också införandet av ytterligare åtgärder för kvalitetskontroll under många molekylära arbetsflöden, öka effektiviteten och slutligen leder till större förtroende i efterföljande resultat. Behovet av högkänsliga fluorescerande analys av begränsad massa har också dykt upp med de senaste experimentella framstegen. Med samma microvolume prov retention-teknik, kan fluorescerande mätningar utföras med 2 mikroliter av material, vilket gör fluorescerande analyser volym krav som måste minskas betydligt. Sådana microreactions av 10 mikroliter eller mindre är nu möjligt att använda en dedikerad microvolume fluorospectrometer. Två microvolume nukleinsyra kvantifiering protokoll kommer att visas som använder integrerade system prov retention praktiska alternativ till traditionella kyvett-baserade protokoll. För det första är en direkt A260 absorbansen metoden i ett microvolume spektrofotometer beskrivs. Detta följs av en demonstration av en fluorescens-baserad metod som möjliggör minskade volymer fluorescens reaktioner med en microvolume fluorospectrometer. Dessa nya tekniker möjliggöra bedömningen av nukleinsyra koncentrationer från 1 pg / mikroliter till 15.000 ng / mikroliter med minimal förbrukning av prov.

Watch this Scientific Journal Video about NanoDrop Microvolume Quantitation of Nucleic Acids at JoVE.com

NanoDrop Microvolume Quantitation of Nucleic Acids

Användningen av NanoDrop microvolume system som praktiska och effektiva alternativ till traditionell nukleinsyra kvantifiering metod beskrivs genom demonstration av två microvolume nukleinsyra protokoll syra kvantifiering.

NanoDrop Microvolume Kvantifiering av nukleinsyror

Biomolecular assays are continually being developed that use progressively smaller amounts of material, often precluding the use of conventional ...

<a class="grey_button" href="http://www.jove.com/details.stp?ID=2891"> &#x4E2D;&#x6587; </a>
 
 
 <a class="grey_button" href="http://www.jove.com/details.stp?ID=2892"> Deutsch </a>
 
 
 <a class="grey_button" href="http://www.jove.com/details.stp?ID=2893"> Fran&#231;ais </a>
 
 
 <a class="grey_button" href="http://www.jove.com/details.stp?ID=2894"> Espa&ntilde;ol </a>
 
 
 <a class="grey_button" href="http://www.jove.com/Details.stp?ID=2895"> &#x65E5;&#x672C;&#x8A9E; </a>

Research

JoVE Journal

Biology

Microvolume Protein Concentration Determination using the NanoDrop 2000c Spectrophotometer

Microvolume proteinkoncentration Fastställande med NanoDrop 2000C Spektrofotometer

Traditional spectrophotometry requires placing samples into cuvettes or capillaries. This is often impractical due to the limited sample volumes often ...

Quantitation of &gamma;H2AX Foci in Tissue Samples

Quantitation of ÃƒÅ½Ã‚Â³H2AX Foci in Tissue Samples

Kvantifiering av γH2AX foci i vävnadsprover

DNA double-strand breaks (DSBs) are particularly lethal and genotoxic lesions, that can arise either by endogenous (physiological or pathological) ...

Concentration Determination of Nucleic Acids and Proteins Using the Micro-volume Bio-spec Nano Spectrophotometer

Koncentration Fastställande av nukleinsyror och proteiner med hjälp av Micro-volymen Bio-spec Nano Spektrofotometer

Nucleic Acid quantitation procedures have advanced significantly in the last three decades.  More and more, molecular biologists require consistent ...

Metabolic Pathway Confirmation and Discovery Through 13C-labeling of Proteinogenic Amino Acids

Metabolic Pathway Confirmation and Discovery Through 13C-labeling of Proteinogenic Amino Acids

Metabolismväg Bekräftelse och upptäckt genom 13 C-märkning av proteinogena aminosyror

Microbes have complex metabolic pathways that can be investigated using biochemistry and functional genomics methods. One important technique to examine ...

Electricity-Free, Sequential Nucleic Acid and Protein Isolation

El-Free, Sekventiell nukleinsyra och protein isolering

Traditional and emerging pathogens such as Enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC), Yersinia pestis, or prion-based diseases are of significant concern ...

Analyzing and Building Nucleic Acid Structures with 3DNA

Analysera och bygga nukleinsyrastrukturer med 3DNA

The 3DNA software package is a popular and versatile bioinformatics tool with capabilities to analyze, construct, and visualize three-dimensional nucleic ...

Dietary Supplementation of Polyunsaturated Fatty Acids in Caenorhabditis elegans

Dietary Supplementation of Polyunsaturated Fatty Acids in Caenorhabditis elegans

Kosttillskott av fleromättade fettsyror i<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Fatty acids are essential for numerous cellular functions. They serve as efficient energy storage molecules, make up the hydrophobic core of membranes, ...

Sequence-specific Labeling of Nucleic Acids and Proteins with Methyltransferases and Cofactor Analogues

Sekvensspecifik Märkning av nukleinsyror och proteiner med metyltransferaser och kofaktor Analogues

S-Adenosyl-l-methionine (AdoMet or SAM)-dependent methyltransferases (MTase) catalyze the transfer of the activated methyl group from AdoMet to specific ...

Highly Efficient Ligation of Small RNA Molecules for MicroRNA Quantitation by High-Throughput Sequencing

Mycket effektiv Ligering av små RNA-molekyler för MicroRNA Kvantifiering av hög genomströmning sekvense

MiRNA cloning and high-throughput sequencing, termed miR-Seq, stands alone as a transcriptome-wide approach to quantify miRNAs with single nucleotide ...

Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro

Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro

Kvantifiering av endotelceller Vidhäftnings<em&gt; In Vitro</em

One of the cardinal processes of inflammation is the infiltration of immune cells from the lumen of the blood vessel to the surrounding tissue. This ...