Name: single particle electron microscopy reconstruction of the exosome complex using the random conical tilt method
Uploaded: 2011-03-28T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single Particle Electron Microscopy Reconstruction of the Exosome Complex Using the Random Conical Tilt Method at JoVE.com

فإن الكتاب أود أن أشكر أعضاء نوغاليس مختبر في جامعة كاليفورنيا في بيركلي في المساعدة على إنشاء بروتوكولات الأولية وأعضاء وانغ مختبر في جامعة ييل في مساعدتهم لوضع بروتوكولات كاملة. نعترف أيضا من العاملين في البرد EM المرفق وعالية الأداء مركز الحاسوب في كلية ييل للطب لدعمهم. الأب هو رست سميث الأسرة.

1. مبدأ أسلوب الخيمة المخروطية عشوائية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مبدأ أسلوب الميل المخروطية عشوائية يتطلب اتخاذ زوج من micrographs من نفس المنطقة من العينات داخل المجهر الالكتروني. يتم أخذ صورة واحدة من العينة في موقف untilted (الشكل 1A) ، ويتم أخذ صورة أ?...

<ol>
	<li>van Heel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angular+reconstitution:+a+posteriori+assignment+of+projection+directions+for+3D+reconstruction.">Angular reconstitution: a posteriori assignment of projection directions for 3D reconstruction.</a> Ultramicroscopy. 21, 111-123 (1987).</li><li>Radermacher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+reconstruction+of+single+particles+from+random+and+nonrandom+tilt+series.">Three-dimensional reconstruction of single particles from random and nonrandom tilt series.</a> J Electron Microsc Tech. 9, 359-394 (1988).</li><li>Penczek, P. A., Grassucci, R. A., Frank, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ribosome+at+improved+resolution:+new+techniques+for+merging+and+orientation+refinement+in+3D+cryo-electron+microscopy+of+biological+particles.">The ribosome at improved resolution: new techniques for merging and orientation refinement in 3D cryo-electron microscopy of biological particles.</a> Ultramicroscopy. 53, 251-270 (1994).</li><li>Ohi, M., Li, Y., Cheng, Y., Walz, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Negative+staining+and+image+classification+-+powerful+tools+in+modern+electron+microscopy.">Negative staining and image classification - powerful tools in modern electron microscopy.</a> Biol Proced Online. 6, 23-34 (2004).</li><li>Frank, J., Radermacher, M., Penczek, P., Zhu, J., Li, Y., Ladjadj, M., Leith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SPIDER+and+WEB:+processing+and+visualization+of+images+in+3D+electron+microscopy+and+related+fields.">SPIDER and WEB: processing and visualization of images in 3D electron microscopy and related fields.</a> J Struct Biol. 116, 190-199 (1996).</li><li>Shaikh, T. R., Gao, H., Baxter, W. T., Asturias, F. J., Boisset, N., Leith, A., Frank, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SPIDER+image+processing+for+single+particle+reconstruction+of+biological+macromolecules+from+electron+micrographs.">SPIDER image processing for single particle reconstruction of biological macromolecules from electron micrographs.</a> Nat Protoc. 3, 1941-1974 (2008).</li><li>Heel, M. v. a. n., Harauz, G., Orlova, E. V., Schmidt, R., Schatz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+generation+of+the+IMAGIC+image+processing+system.">A new generation of the IMAGIC image processing system.</a> J Struct Biol. 116, 17-24 (1996).</li><li>Ludtke, S. J., Baldwin, P. R., Chiu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EMAN:+semiautomated+software+for+high-resolution+single-particle+reconstructions.">EMAN: semiautomated software for high-resolution single-particle reconstructions.</a> J Struct Biol. 128, 82-97 (1999).</li><li>Pettersen, E. F., Goddard, T. D., Huang, C. C., Couch, G. S., Greenblatt, D. M., Meng, E. C., Ferrin, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UCSF+Chimera--a+visualization+system+for+exploratory+research+and+analysis.">UCSF Chimera--a visualization system for exploratory research and analysis.</a> J Comput Chem. 25, 1605-1612 (2004).</li><li>Wang, H. W., Wang, J., Ding, F., Callahan, K., Bratkowski, M. A., Buttler, J. S., Nogales, E., Ke, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Architecture+of+the+yeast+Rrp44+exosome+complex+suggests+routes+of+RNA+recruitment+for+3'+end+processing.">Architecture of the yeast Rrp44 exosome complex suggests routes of RNA recruitment for 3' end processing.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 104, 16844-16849 (2007).</li><li>Scheres, S. H., Nunez-Ramirez, R., Sorzano, C. O., Carazo, J. M., Marabini, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image+processing+for+electron+microscopy+single-particle+analysis+using+Xmipp.">Image processing for electron microscopy single-particle analysis using Xmipp.</a> Nat Protoc. 3, 977-990 (2008).</li><li>Yoshioka, C., Pulokas, J., Fellmann, D., Potter, C. S., Milligan, R. A., Carragher, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automation+of+random+conical+tilt+and+orthogonal+tilt+data+collection+using+feature-based+correlation.">Automation of random conical tilt and orthogonal tilt data collection using feature-based correlation.</a> J Struct Biol. 159, 335-346 (2007).</li></ol>

في هذا المقال نقدم بروتوكول مفصل لإعداد نموذج إعادة الإعمار وثلاثة الأبعاد للمجمع exosome السلبية باستخدام المجهر الإلكتروني تلطيخ. باستخدام هذه الطريقة ، حصلنا على اعادة اعمار 3D باستخدام طريقة عشوائية الميل المخروطية دون أي علم مسبق للهيكل. عشوائية طريقة الميل المخر?...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Polyvinyl Formal Resin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Electron Microscopy Science</td>
<td>63450-15-7</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Uranyl Formate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Electron Microscopy Science</td>
<td>22451</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Superfrost Microscope Slides</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Scientist </td>
<td>4951F-001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>400 mesh grid regular</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>SPI Supplies</td>
<td>3040C</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Carbon coater Auto 306</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Edwards</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tecnai-12 Electron Microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>FEI</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glow Discharger</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BAL-TEC</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sputter Coater SCD 005</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

single particle electron microscopy reconstruction of the exosome complex using the random conical tilt method

واحد المجهر الإلكتروني الجسيمات (EM) إعادة الإعمار وأصبح أداة شعبية في الآونة الأخيرة للحصول على ثلاثي الأبعاد (3D) هيكل المجمعات الجزيئات الكبيرة. بالمقارنة مع البلورات بالأشعة السينية ، فإنه لديه بعض مزايا فريدة. أول واحد الجسيمات EM إعادة الإعمار ليست في حاجة لبلورة نموذج البروتين ، والذي هو عنق الزجاجة في البلورات بالأشعة السينية ، وخاصة بالنسبة للمجمعات الجزيئات الكبيرة. وثانيا ، أنها لا تحتاج إلى كميات كبيرة من عينات البروتين. بالمقارنة مع ملليغرام من البروتينات اللازمة لبلورة واحدة التعمير EM يحتاج فقط الجسيمات الدقيقة عدة لترات من محلول البروتين في تركيزات نانو المولي ، وذلك باستخدام أسلوب تلطيخ السلبية EM. ومع ذلك ، على الرغم من الجمعيات القليلة التي تماثل الجزيئات عالية ، جسيم واحد هو EM محدودة في دقة منخفضة نسبيا (أقل من 1 نانومتر القرار) لعينات كثيرة لا سيما تلك دون التماثل. وتقتصر هذه التقنية أيضا حسب حجم الجزيئات قيد الدراسة ، أي 100 كيلو دالتون لعينات الملون سلبيا و300 كيلو دالتون لعينات مجمدة رطب بشكل عام. لعينة جديدة من الهيكل غير معروف ، ونحن عموما استخدام المعادن الثقيلة حل لتضمين الجزيئات التي تلطيخ السلبية. ثم يتم فحص العينة في انتقال مجهرا الكترونيا لاتخاذ ثنائي الأبعاد (2D) micrographs من الجزيئات. من الناحية المثالية ، وجزيئات البروتين وبنية متجانسة 3D كنه يحمل توجهات مختلفة في micrographs. يتم ترقيم هذه micrographs ومعالجتها في أجهزة الكمبيوتر باسم &quot;الجزيئات واحدة&quot;. ثنائي الأبعاد باستخدام المحاذاة وتقنيات التصنيف ، تتجمع جزيئات متجانسة في نفس وجهات النظر إلى طبقات. المتوسطات على تعزيز إشارة من الأشكال الجزيء 2D. بعد أن تعيين جسيمات ذات التوجه النسبي الصحيح (زوايا أويلر) ، سنكون قادرين على إعادة بناء الصور في حجم الجسيمات 2D 3D ظاهري. في واحد الجسيمات 3D إعادة الإعمار ، هو خطوة ضرورية لتعيين بشكل صحيح التوجه السليم لكل جسيم واحد. هناك عدة طرق لتعيين عرض لكل جسيم ، بما في ذلك إعادة الزاوي (1) والميل عشوائي المخروطية (RCT) الأسلوب 2. في هذا البروتوكول ، وصفنا ممارستنا في الحصول على إعادة الإعمار 3D المعقدة باستخدام الخميرة exosome السلبية EM تلطيخ وRCT. وتجدر الإشارة إلى أن لدينا بروتوكول المجهر الإلكتروني ومعالجة الصور يتبع المبدأ الأساسي لRCT ولكن ليست الطريقة الوحيدة لتنفيذ هذه الطريقة. علينا أولا كيف تصف لتضمين عينة البروتين إلى طبقة من ثاني اكسيد اليورانيوم فورمات - بسماكة مماثلة لحجم البروتين ، وذلك باستخدام الشبكة الكربون holey مغطاة بطبقة من الكربون رقيقة فيلم المستمر. ثم يتم إدخال العينة إلى انتقال مجهرا الكترونيا لجمع untilted (0 درجة) ويميل (55 درجة) زوجا من micrographs التي سيتم استخدامها لاحقا لتجهيز والحصول على النموذج الأولي لل3D exosome الخميرة. ولهذه الغاية ، نقوم RCT ثم صقل النموذج الأولي 3D باستخدام طريقة الإسقاط مطابقة التنقيح 3.

Watch this Scientific Journal Video about Single Particle Electron Microscopy Reconstruction of the Exosome Complex Using the Random Conical Tilt Method at JoVE.com

Single Particle Electron Microscopy Reconstruction of the Exosome Complex Using the Random Conical Tilt Method

توضح هذه المقالة أسلوب قياسي للحصول على ثلاثي الأبعاد (3D) إعادة بناء الجزيئات البيولوجية باستخدام المجهر الإلكتروني تلطيخ السلبية (EM). في هذا البروتوكول ، ونشرح كيفية الحصول على هيكل 3D من exosome السكيراء مجمع البيرة في قرار عشوائي المتوسطة باستخدام أسلوب إعادة الإعمار الميل المخروطية (RCT).

واحد المجهر الإلكتروني التعمير الجسيمات مجمع Exosome باستخدام أسلوب عشوائي الخيمة المخروطية

Single particle electron microscopy (EM) reconstruction has recently become a popular tool to get the three-dimensional (3D) structure of large ...

Research

JoVE Journal

Biology

Method for Measurement of Viral Fusion Kinetics at the Single Particle Level

طريقة لقياس حركية الانصهار الفيروسي على مستوى الجسيمات واحدة

Membrane fusion is an essential step during entry of enveloped viruses into cells. Conventional fusion assays typically report on a large number of fusion ...

Quantitative Analysis of Random Migration of Cells Using Time-lapse Video Microscopy

التحليل الكمي للهجرة عشوائية من الخلايا باستخدام الوقت الفاصل بين الميكروسكوب فيديو

Cell migration is a dynamic process, which is important for embryonic development, tissue repair, immune system function, and tumor invasion 1, 2. During ...

Fundamental Technical Elements of Freeze-fracture/Freeze-etch in Biological Electron Microscopy

العناصر الفنية الأساسية من تجميد كسر / تجميد حفر في البيولوجية المجهر الإلكتروني

Freeze-fracture/freeze-etch describes a process whereby specimens, typically biological or nanomaterial in nature, are frozen, fractured, and replicated ...

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

المصدر المفتوح تحليل واحد الجسيمات لسوبر قرار المجهري مع VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...

Investigating the Detrimental Effects of Low Pressure Plasma Sterilization on the Survival of Bacillus subtilis Spores Using Live Cell Microscopy

Investigating the Detrimental Effects of Low Pressure Plasma Sterilization on the Survival of Bacillus subtilis Spores Using Live Cell Microscopy

التحقيق "تضر الآثار من منخفضة الضغط البلازما التعقيم" على البقاء لجراثيم Bacillus نجحت "باستخدام خلية يعيش مجهرية"

Plasma sterilization is a promising alternative to conventional sterilization methods for industrial, clinical, and spaceflight purposes. Low pressure ...

Isolation and Fluorescence Imaging for Single-particle Reconstruction of Chlamydomonas Centrioles

Isolation and Fluorescence Imaging for Single-particle Reconstruction of Chlamydomonas Centrioles

والعزلة وتصوير الأسفار لتعمير واحد-الجسيمات Chlamydomonas Centrioles

Centrioles are large macromolecular assemblies important for the proper execution of fundamental cell biological processes such as cell division, cell ...

Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging

إعداد العينات البيولوجية بالتجميد ذات الضغط العالي، وتعزيز النقيض ساعدت الموجات الدقيقة، والحد الأدنى راتنج التضمين لتصوير حجم

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the ...

The CryoAPEX Method for Electron Microscopy Analysis of Membrane Protein Localization Within Ultrastructurally-Preserved Cells

طريقة CryoAPEX لتحليل المجهر الإلكتروني لتوطين بروتين الغشاء داخل الخلايا المحفوظة فائقة الهيكلية

Key cellular events like signal transduction and membrane trafficking rely on proper protein location within cellular compartments. Understanding precise ...

Reconstruction of Single-Cell Innate Fluorescence Signatures by Confocal Microscopy

إعادة بناء خلية واحدة توقيعات الفلورية الفطرية من قبل المجهر Confocal

Described here is confocal reflection microscopy-assisted single-cell innate fluorescence analysis (CRIF), a minimally invasive method for reconstructing ...

Cryo-Electron Microscopic Grid Preparation for Time-Resolved Studies using a Novel Robotic System, Spotiton

إعداد الشبكة المجهرية كريو إلكترون للدراسات التي تم حلها عبر الزمن باستخدام نظام روبوتي جديد، Spotiton

The capture of short-lived molecular states triggered by the early encounter of two or more interacting particles continues to be an experimental ...