Name: single particle electron microscopy reconstruction of the exosome complex using the random conical tilt method
Uploaded: 2011-03-28T14:00:00
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Die Autoren bedanken sich bei den Mitgliedern des Nogales Labor an der UC-Berkeley danken an der Erstellung der ersten Protokolle und die Mitglieder des Wang-Labor an der Yale University in ihre Hilfe, um die volle Protokolle zu etablieren. Wir erkennen auch die Mitarbeiter in Kryo-EM-Anlage und High-Performance Computation-Center an der Yale School of Medicine für ihre Unterstützung. HW ist ein Smith Family Preisträger.

1. Prinzip des Zufalls Konische Tilt-Methode <ol><li> Das Prinzip des Zufalls konische Neigung Methode erfordert unter ein Paar Aufnahmen der gleichen Region der Probe im Elektronenmikroskop. Ein Bild der Probe in einem ungekippten Position (Abbildung 1A) genommen und das andere Bild ist von der Probe in einem Winkel zwischen 50 bis 70 Grad (in unserem Fall verwenden wir 55 Grad) geneigt gemacht. (Abbildung 1B) </li><li> Mit dem Computer die digitalisierten Aufnahme Paar nebeneinander und Bilder aus dem gleichen Teilc...

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	<li>van Heel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angular+reconstitution:+a+posteriori+assignment+of+projection+directions+for+3D+reconstruction.">Angular reconstitution: a posteriori assignment of projection directions for 3D reconstruction.</a> Ultramicroscopy. 21, 111-123 (1987).</li><li>Radermacher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+reconstruction+of+single+particles+from+random+and+nonrandom+tilt+series.">Three-dimensional reconstruction of single particles from random and nonrandom tilt series.</a> J Electron Microsc Tech. 9, 359-394 (1988).</li><li>Penczek, P. A., Grassucci, R. A., Frank, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ribosome+at+improved+resolution:+new+techniques+for+merging+and+orientation+refinement+in+3D+cryo-electron+microscopy+of+biological+particles.">The ribosome at improved resolution: new techniques for merging and orientation refinement in 3D cryo-electron microscopy of biological particles.</a> Ultramicroscopy. 53, 251-270 (1994).</li><li>Ohi, M., Li, Y., Cheng, Y., Walz, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Negative+staining+and+image+classification+-+powerful+tools+in+modern+electron+microscopy.">Negative staining and image classification - powerful tools in modern electron microscopy.</a> Biol Proced Online. 6, 23-34 (2004).</li><li>Frank, J., Radermacher, M., Penczek, P., Zhu, J., Li, Y., Ladjadj, M., Leith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SPIDER+and+WEB:+processing+and+visualization+of+images+in+3D+electron+microscopy+and+related+fields.">SPIDER and WEB: processing and visualization of images in 3D electron microscopy and related fields.</a> J Struct Biol. 116, 190-199 (1996).</li><li>Shaikh, T. R., Gao, H., Baxter, W. T., Asturias, F. J., Boisset, N., Leith, A., Frank, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SPIDER+image+processing+for+single+particle+reconstruction+of+biological+macromolecules+from+electron+micrographs.">SPIDER image processing for single particle reconstruction of biological macromolecules from electron micrographs.</a> Nat Protoc. 3, 1941-1974 (2008).</li><li>Heel, M. v. a. n., Harauz, G., Orlova, E. V., Schmidt, R., Schatz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+generation+of+the+IMAGIC+image+processing+system.">A new generation of the IMAGIC image processing system.</a> J Struct Biol. 116, 17-24 (1996).</li><li>Ludtke, S. J., Baldwin, P. R., Chiu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EMAN:+semiautomated+software+for+high-resolution+single-particle+reconstructions.">EMAN: semiautomated software for high-resolution single-particle reconstructions.</a> J Struct Biol. 128, 82-97 (1999).</li><li>Pettersen, E. F., Goddard, T. D., Huang, C. C., Couch, G. S., Greenblatt, D. M., Meng, E. C., Ferrin, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UCSF+Chimera--a+visualization+system+for+exploratory+research+and+analysis.">UCSF Chimera--a visualization system for exploratory research and analysis.</a> J Comput Chem. 25, 1605-1612 (2004).</li><li>Wang, H. W., Wang, J., Ding, F., Callahan, K., Bratkowski, M. A., Buttler, J. S., Nogales, E., Ke, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Architecture+of+the+yeast+Rrp44+exosome+complex+suggests+routes+of+RNA+recruitment+for+3'+end+processing.">Architecture of the yeast Rrp44 exosome complex suggests routes of RNA recruitment for 3' end processing.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 104, 16844-16849 (2007).</li><li>Scheres, S. H., Nunez-Ramirez, R., Sorzano, C. O., Carazo, J. M., Marabini, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image+processing+for+electron+microscopy+single-particle+analysis+using+Xmipp.">Image processing for electron microscopy single-particle analysis using Xmipp.</a> Nat Protoc. 3, 977-990 (2008).</li><li>Yoshioka, C., Pulokas, J., Fellmann, D., Potter, C. S., Milligan, R. A., Carragher, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automation+of+random+conical+tilt+and+orthogonal+tilt+data+collection+using+feature-based+correlation.">Automation of random conical tilt and orthogonal tilt data collection using feature-based correlation.</a> J Struct Biol. 159, 335-346 (2007).</li></ol>

In diesem Artikel präsentieren wir ein detailliertes Protokoll der Probenvorbereitung und dreidimensionale Rekonstruktion des Exosom Komplex mit negativen Färbung Elektronenmikroskopie. Mit dieser Methode erhalten wir die 3D-Rekonstruktion mit zufälligen konische Neigung Methode ohne vorherige Kenntnis der Struktur. Zufällige konische Neigung Methode erfordert nicht unbedingt eine homogene Probe, aber die folgenden Projektion passenden Verfeinerung Schritt wäre eine homogene Probe braucht, um eine hohe Auflösung z...

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		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
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		<tbody>
		
<tr>
<td>Polyvinyl Formal Resin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Electron Microscopy Science</td>
<td>63450-15-7</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Uranyl Formate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Electron Microscopy Science</td>
<td>22451</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Superfrost Microscope Slides</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Scientist </td>
<td>4951F-001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>400 mesh grid regular</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>SPI Supplies</td>
<td>3040C</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Carbon coater Auto 306</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Edwards</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tecnai-12 Electron Microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>FEI</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glow Discharger</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BAL-TEC</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sputter Coater SCD 005</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

single particle electron microscopy reconstruction of the exosome complex using the random conical tilt method

Einzelne Partikel-Elektronenmikroskopie (EM) Rekonstruktion hat vor kurzem ein beliebtes Mittel, um die dreidimensionale (3D) Struktur von großen makromolekularen Komplexen erhalten werden. Im Vergleich zu Röntgenkristallographie, hat es einige einzigartige Vorteile. Erstens, einzelne Partikel EM Rekonstruktion nicht erforderlich, die Proteinprobe, die den Engpass in der Röntgenkristallographie ist kristallisieren, insbesondere bei großen makromolekularen Komplexen. Zweitens braucht es nicht große Mengen von Protein-Proben. Verglichen mit Milligramm Proteine, die für Kristallisation, einzelne Partikel EM Wiederaufbau braucht nur einige Mikroliter Proteinlösung bei nano-molaren Konzentrationen, wobei die negative Färbung EM-Methode. Doch trotz ein paar makromolekularen Anordnungen mit hoher Symmetrie, einzelne Partikel EM ist bei relativ niedrigen Auflösung begrenzt (weniger als 1 nm Auflösung) für viele Exemplare vor allem ohne Symmetrie. Diese Technik wird auch von der Größe der Moleküle unter-Studie beschränkt, dh 100 kDa für negativ gefärbten Proben und 300 kDa für frozen-hydratisierten Proben im Allgemeinen. Für eine neue Probe mit unbekannter Struktur, verwenden wir grundsätzlich eine Heavy Metal-Lösung, um die Moleküle durch negative Färbung einbinden. Die Probe wird dann in einem Transmissionselektronenmikroskop untersucht, um zweidimensionale (2D) Aufnahmen der Moleküle statt. Idealerweise haben die Proteinmoleküle einer homogenen 3D-Struktur, sondern weisen unterschiedliche Orientierungen in den Aufnahmen. Diese Aufnahmen werden digitalisiert und verarbeitet in Computern als &quot;single-Teilchen&quot;. Mit Hilfe von zweidimensionalen Ausrichtung und Klassifizierung Techniken, homogen sind Moleküle in die gleichen Ansichten in Klassen gruppiert. Ihre Mittel erhöhen das Signal des Moleküls 2D-Formen. Nachdem wir die Teilchen mit der richtigen relativen Orientierung (Euler-Winkel) zuordnen, können wir die 2D-Partikel-Bilder in einer virtuellen 3D-Volumen zu rekonstruieren. In einzelnen Partikels 3D-Rekonstruktion, ist ein wesentlicher Schritt, um richtig zuordnen die richtige Ausrichtung der einzelnen Teilchen. Es gibt mehrere Methoden, um die Ansicht für jedes Teilchen zuordnen, einschließlich der eckigen Rekonstitution 1 und zufälligen konische Neigung (RCT) Methode 2. In diesem Protokoll, beschreiben wir unsere Praxis in immer der 3D-Rekonstruktion von Hefe Exosom Komplex mit negativen Färbung EM und RCT. Anzumerken ist, dass unser Protokoll der Elektronenmikroskopie und Bildverarbeitung das Grundprinzip der RCT folgt, ist aber nicht der einzige Weg, die Methode auszuführen. Wir beschreiben zunächst, wie die Protein-Probe in einer Schicht von Uranyl-Formate mit einer Dicke vergleichbar mit der Größe des Proteins eingebettet, mit einem löchrigen Kohlenstoff-Gitter mit einer Schicht durchgehende dünne Kohlenstoff-Folie abgedeckt. Dann wird die Probe in einem Transmissions-Elektronenmikroskop zu sammeln eingefügt ungekippten (0-Grad) und neigbar (55-Grad-) Paare von Aufnahmen, die später für die Verarbeitung und den Erhalt einer ersten 3D-Modell der Hefe Exosom verwendet werden. Zu diesem Zweck führen wir RCT und dann zu verfeinern den ersten 3D-Modell mit Hilfe der Projektion passenden Verfeinerung der Methode 3.

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Single Particle Electron Microscopy Reconstruction of the Exosome Complex Using the Random Conical Tilt Method

Dieser Artikel beschreibt ein standardisiertes Verfahren, um eine dreidimensionale (3D) Rekonstruktion biologischer Makromoleküle mit Hilfe Negativfärbung Elektronenmikroskopie (EM) zu bekommen. In diesem Protokoll erklären wir, wie die 3D-Struktur des Saccharomyces cerevisiae Exosom Komplex in mittlerer Auflösung unter Verwendung des Random konische Neigung Rekonstruktionsverfahren (RCT) zu bekommen.

Single Particle Electron Microscopy Rekonstruktion der Exosom Complex Mit der Random-konische Tilt-Methode

Single particle electron microscopy (EM) reconstruction has recently become a popular tool to get the three-dimensional (3D) structure of large ...

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